遗传学实验.docx

1、遗传学实验实验三 人类和动物染色体标本的制备及核型分析一 、人类体细胞染色体组型分析 【实 验 目 的】 掌握人类体细胞染色体组型分析的方法。 【实 验 原 理】 核型 （karyotype） 是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。正常细胞的核型能代表个体的核型。组型（idiogram）是以模式图的方式表示，它是通过对许多细胞染色体的测量取其平均值绘制而成的，是理想的，模式化的染色体组成。代表了一物种染色体组型的特征。核型的研究对人类医学遗传研究及临床应用，对探讨动植物起源、物种间亲缘关系，鉴定远缘杂种等方面都有重大意义。 染色

2、体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m） ，亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st） ，端部着丝粒染色体（t） 。对任何一个染色体的基本形态学特征来说，重要的参数有三个： 1相对长度（relative length） ，指单个染色体长度与包括（或）染色体在内的单倍染色体总长之比，以百分率表示。 相对长度 每个染色体的长度 /单倍染色体X染色体总长度 100 2臂指数（am index ） ：指长臂同短臂的比率，即 臂指数 长臂长度 / 短臂长度 按 Levan（1964）的划分标准：臂指数在 1.0

3、 1.7 之间称中部着丝粒染色体（m） ；臂指数在 1.73.0 之间称亚中部着丝粒染色体（sm） ；臂指数在 3.0 7.0 之间称亚端部着丝粒染色体（st） ；臂指数 7.0 者为端部着丝粒染色体（t） 。 着丝粒指数（centromere index） ，指短臂占该染色体长度的比率，它决定着丝粒的相对位置。 着丝粒指数短臂长度/该染色体总长 100 按 Levan（1964）的标准划分：着丝粒指数在 50.037.5 之间称中部着丝粒染色体（m） ；指数在 37.525.0 之间称亚中部着丝粒染色体（sm） ；指数在 25.012.5 之间称亚端部着丝粒染色体（st） ；指数在 12.5

4、0.0 之间称端部着丝粒染色体（t） 。 人类体细胞的正常核型是含有 46 条染色体，相互构成 23 对。其中 22 对是男女所共有的常染色体， 一对为男女所不同的性染色体， 男 XY， 女 XX。 根据丹佛 （1960） 、 伦敦 （1963）和芝加哥（1966）会议提出的标准，即按照染色体的长度依次减小和着丝粒位置以及其它特征，把人类体细胞染色体分为七个组群，各自特征简括于下表。 人类染色体组型： 群组号 染色体号 形态大小 着丝粒位置 随体 次缢痕 鉴别程度 A 1-3 最大 m 无 常见1号 可鉴定 B 4-5 次大 sm 无 不易 C 6-12+X 中等 sm 无 常见9号 难鉴定

5、D 13-15 中等 st 有 偶见13号 难鉴定 E 16-18 较小 16m， 17和18sm 无 常见16号 可鉴定 F 19-20 小 m 无 不易 G 21-22+Y 最小 st 有、Y无 难鉴定 【实验仪器、材料和试剂】 （一） 仪器、用具 摄影显微镜、胶卷、冲印放大器材、剪刀、镊子、毫米尺、胶水 （二）材料 人类体细胞染色体标本 【方法与步骤】 1在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姊妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄。 2将显微拍摄放大好的照片上的一个细胞的全部染色体，分别一条一条剪下。 3根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的目测配对。 4测量出每条染色体短臂和长

6、臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数，并记录原始数据。 5根据测量数据校正目测配对排列的结果，进行调整排列。 6. 把染色体按一定顺序一对一对地排列，排列时注意短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列，最后把染色体贴成一完整的染色体组型图 。 7翻拍。 二 、动物骨髓细胞染色体标本的制备 【实验目的】 1掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术。 2观察染色体的数目以及形态特征。 3掌握染色体核型分析的一般方法。 【实验原理】 骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可直接观察到分裂细胞。经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻

7、断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室均可进行。 【实验仪器、材料和用具】 （一） 仪器、用具 天平、离心机、保温箱、显微镜、注射器、解剖盘、解剖剪、刀片、试管架、10ml 离心管、吸管、烧杯、量筒、酒精灯、冰冻载玻片、玻璃板、吸水纸、擦镜纸 （二） 材料 小鼠或青蛙 （三）试剂 1Carnoy固定液（甲醇冰醋酸 = 31） 20.1%秋水仙素溶液 称取10mg 秋水仙素，加入 10ml 0.65%生理盐水（1ml 含有 1000 微克，

8、0.1ml 含有 100微克秋水仙素） 。 3生理盐水 41/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4） A液：1/15M磷酸氢二钠：1000ml含Na2HPO4 9.465g或Na2HPO42H2O 11.876g或 Na2HPO412H2O 23.88g 。 B液：1/15M磷酸二氢钾：1000ml含KH2PO4 9.07g 。 取 A液 80ml + B 液20ml 混匀即成 pH7.4 。 51：10 Giemsa磷酸缓冲液染液（pH6.8） 【方法与步骤】 1秋水仙素处理： 实验前 34小时，按动物每克体重 24g 的剂量，腹腔注射秋水仙素。 2取股骨： 处死动物后，立即取出股骨，用

9、刀片剔掉肌肉。 3收集骨髓细胞：用刀片切开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白色为止。将收集的骨髓细胞平衡后放入10ml离心管，以 1000r/min 离心 10min。4低渗处理：弃上清液，加入 6mlKC1或6ml 蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，置 37温箱中低渗 10min ，以 1000r/min 离心 10min。 5预固定： 弃上清液，加入5滴新配的Carnoy固定液，立即打匀，并以 1000r/min 离心 10min 后。 6 固定：弃上清液， 沿管壁慢慢加入 6ml 固定液， 立即用吸管吹打成细胞悬液， 室温下静置固定

10、20min.。1000r/min 离心 10min 后。 7重复步骤 6 的操作。 8制悬液：沉淀物中加入 0.30.5ml 固定液，用吸管吹打成细胞悬液。 9滴片： 用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上 23 滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥。 10染色： 将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用 Giemsa 染液（Giemsa 原液用 10 倍体积的 1/15M磷酸缓冲液（pH7.4）稀释）染色 30min，自来水冲洗，空气干燥。 11镜检。在低倍镜下找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察。 12染色体核型

11、分析（）【注意事项】 1掌握好秋水仙素的浓度和处理时间，浓度过高，处理时间过长，都会使染色体过分收缩，不利于形态观察。 2控制好离心的转速，一般以 1000r/min 为宜，转速过大，会造成细胞结块，不利于染色体伸展；转速过小，细胞不能充分沉淀，会造成细胞分裂相丢失。 3低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗处理时间过长，会造成细胞破裂，染色体丢失，不能准确计数。低渗处理时间不足，则细胞内染色体聚集一起，不能很好伸展开来，观察时无法区辨和计数。 4固定液要现配现用，固定要充分。 5载玻片要洁净，无油脂和预先冰冻，滴片要有一定的高度，以利于细胞和染色体充分分散。 【作

12、 业】 1通过这次实验，实验中要注意的问题有哪些？ 2分析你做的标本的优劣，绘出骨髓细胞分裂中期染色体核型图，指出染色体数目 2n等于多少？【 结果：小鼠骨髓细胞染色体核型（2n=40）；青蛙骨髓细胞染色体核型（2n=26）】3剪贴人类和小鼠染色体核型分析图（详见“一 、人类体细胞染色体组型分析”）。实验四 果蝇的单/双因子杂交实验（6学时）一 实验目的1 掌握果蝇单/双因子的杂交方法和杂交结果的统计处理方法，验证并加深理解遗传的自由组合定律和分离定律的原理2 记录单/双因子杂交结果，掌握数据统计处理方法二 实验原理按照孟德儿第一定律，即分离定律，基因是一个独立的单位。基因完整地从一代传递到下

13、一代，有该基因的显隐性决定其在下一代的形状表现一队杂合状态的等位基因保持相对的独立性，在减数分裂形成继配子时，等位基因随同源染色体的分离而分配到不同的配子衷曲。理论上配子的分离比是，即产生带和a基因的配子数相等，因此，等位基因杂合体的自交后代表现为基因型分离比:Aa:aa是1:2:1，如果显性完全，其表型分离比为3:1，这就是分离定律的基本内容。通过果蝇一队因子的杂技哦啊实验，即可以验证它位于非同源染色体上的两对基因，在减数分裂形成配子时可以自由组合；又由于配子的随机结合，导致它们所决定的两对相对性状在杂种第二代是自由组合的一对基因所决定的性状在杂种二代是：之比，两对不相互连锁的基因所决定的性

14、状，在杂种二代就呈：之比 三 材料与用品1 材料饲养的野生型和几种常见突变型果蝇。单因子杂交实验可选用黑腹果蝇的长翅纯合体、残翅纯合体作为实验材料双因子杂交实验可选用黑腹果蝇的长翅灰体、残翅黑檀体作为实验材料用具及药品1 用具双筒解剖镜、显微镜、放大镜、小镊子、麻醉瓶、培养瓶、白瓷板、毛笔、棉塞、软木塞或橡胶塞、恒温培养箱、小滴瓶、载片、盖片、吸水纸、纱布等2 药品琼脂、蔗糖、乙醇、氯仿、丙酸、玉米粉、酵母粉四 实验步骤（一）1 选择处女蝇将长翅果蝇和残翅果蝇培养瓶内已羽化的成蝇全部杀死，此后凡羽化后未超过h的雌营即是处女蝇2 杂交正交：长翅果蝇（母）残翅（公）；反交：残翅果蝇（母）：长翅果蝇

15、（公）各做两瓶，每瓶性培养基中各移入对种蝇贴好标签，注明杂交组合、杂交日期及实验者姓名3 移去亲本天后移去亲本4 观察天后成虫出现，观察其翅膀形态后处死连续观察记录d，各自记录正、反交观察结果统计日期正交反交长翅数残翅数长翅数残翅数月日合计F1互交在新培养瓶内，每瓶各放入对果蝇，培养移去天后，移去成蝇，麻醉致死，放入废蝇盛留瓶观察天后成蝇出现，观察翅膀形态后处死，隔天记录一次，连续观察统计次正、反交的结果并记录数据处理及2测验2= (O-E) 2/E式中，是观察值，是预期值根据2自由度，查表，若P5%,说明观察值与理论值相符合.可以认为观察值是符合分离定律的长翅残翅合计观察值（）预期值（）（：

16、）(O-E) 2/E实验步骤（二）1 选择处女蝇将长翅果蝇和残翅果蝇培养瓶内已羽化的成蝇全部杀死，此后凡羽化后未超过h的雌蝇即是处女蝇选取野生型处女蝇和突变型处女蝇，分别放于含新鲜培养基的培养瓶内保存备用杂交正交：野生处女蝇（母）黑檀体、残翅雄蝇（公）；反交：黑檀体、残翅处女蝇（母）野生型雄蝇各做瓶，每瓶中分别移入对种蝇贴好标签，注明杂交组合、杂交日期及实验者姓名移去亲本d后移去亲本果蝇处死观察d后成蝇出现，观察其性状后处死连续观察并记录正、反交d互交按原来的正、反交各选对成蝇，移入新培养瓶中，继续培养移去d后移去成蝇观察及实验结果记录d后成蝇出现，观察性状后处死，隔天观察记录一次，连续观察统

17、计次，正、反交结果各自就子代类型统计日期正交反交灰长黑长灰残黑残灰长黑长灰残黑残合计数据处理及2测验2= (O-E) 2/E式中，是观察值，是预期值根据2自由度，查表，若P5%,说明观察值与理论值相符合.可以认为观察值是符合分离定律的子代类型参数灰长黑长灰残黑残合计观察值（）预期值（）（：）(O-E) 2/E五 实验报告1 统计分析果蝇实验结果，并用2测验验证实验结果是否与分离/自由组合规律相符？2 根据你的实验结果记录，对所做杂交过程作一遗传分析，对所研究的性状及基因可得出哪些结论？3 果蝇杂交时，为什么要选择处女蝇？代是否要选择处女蝇，为什么？4 在做果蝇杂交时会出现表型分离比不符合：的比

18、例为什么？分析此次实验成败原因5 果蝇麻醉时的注意事项有哪些？6 在进行亲本杂交和自交后一定时间为什么要倒去杂交亲本？实验三 果蝇的形态、生活史观察和雌雄鉴别及饲养一 实验目的2 了解果蝇生活史各个阶段的形态特征，掌握果蝇雌、雄成虫和几种常见突变性状的主要区别方法。3 学习实验果蝇的饲养管理、实验操作、培养基的配制等方法。4 掌握果蝇单因子的杂交方法和杂交结果的统计处理方法，理解分离定律的原理二 实验原理黑腹果蝇为双翅目昆虫，具完全变态。用作实验材料的优点是：容易饲养，生活周期短；繁殖能力较强，每只受精的雌虫约可产卵粒，因此在短时间内可获得较大的子代群体，有利于遗传学分析；突变类型多，研究得较

19、清楚的突变已达多个，且多数是形态特征的变异，便于观察；唾腺染色体较大因此，果蝇在遗传学研究中得到广泛应用，积累了许多典型材料三 材料与用品1 材料饲养的野生型和几种常见突变型果蝇。单因子杂交实验可选用黑腹果蝇的长翅纯合体、残翅纯合体作为实验材料2 用具及药品1 用具双筒解剖镜、显微镜、放大镜、小镊子、麻醉瓶、培养瓶、白瓷板、毛笔、棉塞、软木塞或橡胶塞、恒温培养箱、小滴瓶、载片、盖片、吸水纸、纱布等2 药品琼脂、蔗糖、乙醇、氯仿、丙酸、玉米粉、酵母粉四 实验步骤1果蝇生活史的观察果蝇生活史包括受精卵、幼虫、蛹、成虫四个发育阶段2麻醉果蝇制备麻醉瓶用干净培养瓶或与培养瓶口径相同的玻璃瓶并配备相应的

20、软木塞或橡胶塞，在软木塞的下面钉一铁钉，在铁钉上缠一小团棉花或可在软木塞上打一小孔，塞上一折叠的吸水纸或可在橡胶塞上划一切口，夹住一折叠的吸水纸引出果蝇将有果蝇的培养瓶用手轻拍，使果蝇震落瓶底，迅速拔去棉塞，将麻醉瓶与培养瓶的两口相对，培养瓶在下、麻醉瓶在上并朝向灯光处，双手遮住培养瓶，利用果蝇的趋光性和向上性，将果蝇引入麻醉瓶麻醉在麻醉瓶瓶塞的棉球或吸水纸上滴加滴乙醚或氯仿，迅速塞入麻醉瓶口，.min左右大部分果蝇即被麻醉落入瓶底，摇动麻醉瓶，全部果蝇震落瓶底，之后立即将果蝇倒在白瓷板或玻璃板上，用毛笔小心拨动观察如果用于杂交，翅膀外展的果蝇不能使用3 辨认果蝇成虫雌雄个体雌果蝇雄果蝇体型腹

21、部第一对足大末端尖背面：环纹节、无黑斑腹面：腹片节跗节基部无性能小末端钝背面：环纹3节、延续到末端呈黑斑腹面：腹片节跗节基部有黑色鬃毛状性梳4果蝇常见突变类型的观察突变名称基因符号性状特征在染色体上座位白眼棒眼黑檀体黑体黄体残翅焦刚毛WBebyvgsn3复眼白色复眼横条形，小眼数少身体成乌木色，黑亮体黑色，比黑檀体深全身呈浅橙黄色翅明显退化，部分残留，不能飞刚毛卷曲如烧焦状X1.5X57.0R70.7L48.5X0.0R67.0X21.05果蝇原种保存为了保证果蝇杂交试验材料的充分供应，必须保存一定数量和种类的果蝇原种1 原种要纯每次转移培养基都要严格检查有无混杂，如发现同一原种群体内有其他类

22、型，应立即丢弃，以保证群体的纯度2 每隔周换一次新鲜的培养基，每瓶对，每一原种至少保留两套，并注明类型和转移日期3 平时保存可放在生化培养箱内湖哟恒温培养箱内，温度调至0C扩大培养和实验时将温度调至0C，以便加快生长繁殖夏季高温时，最好用可制冷的生化培养箱保存原种6果蝇培养基的配制配方水ml琼脂g蔗糖g玉米粉g丙酸ml酵母粉g801001.51131010102. 50.51. 50.5配方可用于培养杂交果蝇，因培养基较干稠，可避免黏着果蝇配方可用于原种保存，因培养基较稀，可延长培养时间两种培养基也可都用苯甲酸而不用丙酸果蝇杂交大实验（综合）一、 内容：见遗传学实验实验1：果蝇形态观察与饲养p

23、g63实验4：果蝇单、双因子杂交实验（果蝇的单因子实验 pg14，果蝇的二对因子的自由组合 pg25）实验5：果蝇的伴性遗传 pg19二、 实验材料三个品系果蝇：野生果蝇（红眼、灰身、全翅）；残翅果蝇（红眼、灰身、残翅）；黑檀体果蝇（红眼、黑身、全翅）、白眼（白眼、灰身、全翅）三、 实验设计果蝇单双因子、果蝇伴性遗传实验路线图（见图）；四、 关键实验步骤1. 果蝇雌雄鉴别；2. 果蝇的麻醉和再麻醉；3. 果蝇培养基的配制；4. 处女蝇的准备：各品系亲本果蝇在培养的第810（平均温度为25时为8天）天晚上10点（pm10:00）弃去老果蝇（此时有很多没孵化出幼虫或蛹），接着每天按照am6:00,pm2:00,pm10:00的方法连续（2-3天）分别收集分离成蝇，放入杂交瓶中每瓶培养基放置5-6对亲本果蝇，雌雄分开（取一正方形白纸，沿对角线对折然后展平，平置于桌面，将麻醉之果蝇倒于对角线折痕上，用尺、尖头镊子或解剖针拨弄果蝇使其均匀分散于对角线的折痕上，然后沿对角线将雌雄果蝇分类拨入各侧）；5. 亲本的挑出：从扩大培养的原种中，选择10对果蝇，放入装有的培养基的大试管（三角瓶或广口瓶）中，每组每个品系各2瓶，共准备6瓶；五、各实验的结果记录（见实验教材）图 果蝇单因子实验、二对因子自由组合以及果蝇伴性遗传实验路线图