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1、分离技术蛋白质综述doc双水相萃取技术在蛋白质与酶中的应用研究进展摘要：双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到人们的重视，与其他的萃取技术和分离技术相比较，双水相萃取技术操作条件温和，易于连续操作，处理量大等优点。本文综述了双水相萃取技术在蛋白质与酶当中最近几年的应用进展，分析了双水相萃取技术分离蛋白质和酶的优缺点，并对该技术在蛋白质和酶中的应用前景进行了展望。关键词：双水相萃取 蛋白质 酶 应用 研究进展 Application and Progress of Aqueous Two-Phase Extraction Technology in Protein and enzymeAb

2、stract:As a new separation technology,aqueous two-phase extraction technology has received more and more importance;In contrast to other extraction technology and separation technology,it have many advantages,for example,mild operation condition,continuous operation easily,large treatment capacity a

3、nd so on.This paper introduces the application and progress of aqueous two-phase extraction technology in protein and enzyme in latest years ；analysis the advantage or disadvantage of the separation technology in protein and enzyme.The review also discusses the prospect of aqueous two-phase extracti

4、on technology in protein and enzyme.Keywords:Aqueous Two-Phase Extraction protein enzyme application progress引言液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一，在生物化工、基因工程中也有广泛的应用。然而，大部分生物制品的原液是有生物活性的溶液，需要在低温或室温下进行富集、分离，因此常规的萃取技术对于该领域应用受到限制。双水相萃取分离技术是基于液-液理论同时考虑到保持样品生物活性的一种新型萃取分离技术，最早是由荷兰科学家Beijerinck观察到的。1896年，Beijerinck发现

5、，当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混合时，得到一个浑浊不透明的溶液，随之分为两相，上相含有大部分的水，下相含有大部分琼脂（或淀粉），两相的主要成分是水，由此产生了双水相。20世纪80年代，人们发现了一些特殊的双水相系统，其中最典型的是聚氧乙烯基表面活性剂与水构成的双水相系统，当温度超过浊点温度时，具有聚氧乙烯基团的非离子型表面活性剂的水溶液可形成两个互不相溶的水相：上相富含聚合物，下相则几乎全是水，这种双水相系统只使用了一种成相组分，如果浊度较低，在生物分离中使用时特别有利于高聚物的回收。20世纪90年代，人们又发现了阴阳离子两种表面活性剂在水溶液中可形成双水相，从而使双水相的内容不断丰富

6、，应用也越来越广泛。双水相应用的主要问题是体相回收，这方面的研究正在进行，并取得了一定的进展。对于蛋白质生物大分子物质，有相当大的表面积，在双水相中易于单侧分配，用双水相萃取技术处理可以取得较理想的效果。双水相萃取是通过溶质在两水相之间分配系数的差异而进行萃取的技术，其应用于蛋白质和酶的分离纯化具有以下优势： 体系含水量高，可达80% 以上，萃取环境和操作条件温和，蛋白质和酶在其中不易失活；界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力，有助于强化相际间的质量传递；易于按比例放大和进行连续性操作等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势，现已被广泛用于蛋白质的分离纯化，取得了很好的成效。近年来，双水

7、相萃取技术的分离对象进一步扩大，已包括了多肽、氨基酸、植物有效成分、重金属离子和抗生素等。一，双水相萃取技术在蛋白质中的应用进展许多研究人员用双水相系统来对蛋白质进行纯化、分离、分析等。本文罗列了以下双水相系统在蛋白质中应用的实例。萃取血清白蛋白和血红蛋白朱陈银等1研究表明在离子液体四氟硼酸-1-丁基-3-甲基咪唑（ Bmim BF4）和NaH2PO4形成的双水相体系中，研究了茜素红S(ARS)与牛血清白蛋白( BSA)作用形成复合物的光谱行为及离子液体的用量、盐的浓度、溶液酸度及共存物质对体系成相及复合物测定的影响。研究结果表明，在总体积为5.00mL的离子液体双水相中，离子液体用量在1.5

8、 mL，磷酸二氢钠量在2.0 g，茜素红S（ARS）1.0 mL，蛋白质溶液1mL，pH为6时， ARS 与BSA 复合物吸光度较大。在离子液体相中，复合物摩尔吸光系数() 为2.32 104 Lmol-1cm-1,，最大吸收波长在531nm，比单纯ARS红移109 nm，并初步探讨了茜素红S与牛血清白蛋白之间的作用机理。陈琳琳等2运用荧光光谱，研究了在离子液体双水相中铕离子( Eu3+ ) 与牛血清白蛋白( BSA) 的相互作用。研究发现铕离子对牛血清白蛋白有较强的荧光猝灭作用，且为静态猝灭类型。根据双对数方程处理荧光猝灭数据得到了铕离子与牛血清白蛋白在不同温度下的结合常数Ka和结合位点数n

9、。通过热力学方程求得了铕离子与牛血清白蛋白作用的热力学参数，表明它们之间的作用力主要是范德华作用力和氢键。Eu3+和BSA之间有较强的结合作用，这为Eu3+在体内被蛋白质储存和转运提供了条件。王军等3研究了新型离子液体N-乙基-N-丁基吗啉四氟硼酸盐( Nebm BF4 ) 和KH2PO4形成的双水相体系对牛血清白蛋白( BSA )的萃取行为，考察了盐的加入量、离子液体浓度、溶液pH值、蛋白质浓度等因素对萃取率的影响。结果表明：当KH2PO4的加入量为85 g /L（图1）、离子液体浓度在200 250 g /L（图2）、溶液酸度在pH 4. 5 7. 0（图3）、BSA 的浓度在60 120

10、 m g /L时，其萃取率达98. 0%以上。该双水相系统对-淀粉酶的萃取率也达98. 5%。邓凡政等4研究了在聚乙二醇2000（PEG）-硫酸铵-苋菜红(AT)双水相系统中,研究了PEG相中食用色素AT与人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、DNA生成复合物光谱行为和溶液酸度，盐浓度，PEG用量，反应时间，共存物质等对体系复合物测定的影响。实验结果表明：在PH=6的缓冲溶液中，加入HSA、DNA、BSA生成复合物最大吸收波长与AT比较，分别紫移15-3nm，用摩尔比法求得HSA、DNA与BSA最大结合数分别是158和210。用加入不同类型表面活性剂的方法，初步探讨了食用色素苋菜红与

11、蛋白质之间的作用机理。F.Qu5等研究了用PEG/磷酸盐的双水相系统分离和富集蛋白质，再与HPLC连用来鉴定蛋白质。他运用了5中蛋白质，牛血清白蛋白、细胞色素C、溶菌酶、肌红蛋白和胰蛋白酶，研究了磷酸盐浓度和pH值对双水相系统分离蛋白的效率。该研究表明：一些蛋白质在用双水相系统分离时具有明显的差异，并且指出双水相系统对蛋白质组的分离和富集是一种潜在的高效率方法。Q.Q.Gai等6将磁颗粒吸附和双水相相结合，先根据蛋白质等电点、溶液pH和离子强度用磁颗粒吸附蛋白，再用PEG/硫酸盐的双水相系统对牛血清白蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶、细胞色素C和肌红蛋白进行了分离萃取。白海鑫等7将正丙醇、氯化钠和水的双

12、水相系统用于人血清白蛋白、玉米醇溶蛋白和r-球蛋白的预分离研究，并且考察了体系的酸度以及在不同浓度的盐、正丙醇及蛋白质存在时该双水相系统对蛋白质的分离效果。将经该双水相体系预分离过的蛋白质组样品在未与成相试剂分离的条件下直接用于凝胶电泳分析。结果表明，该双水相体系可通过一步萃取将蛋白质组样品分开，该蛋白质组预分离方法简单、快速、成本低，并具有生物相容性、可连续操作性、无需昂贵复杂仪器以及在进行电泳分析前无须( 或易于) 将目标蛋白与成相试剂分离等优点。该蛋白质组预分离方法的建立在蛋白质组学和方法学方面均有着极为重要的意义。萃取藻蓝蛋白刘杨等8以PEG/硫酸钠双水相体系，经一次萃取从钝顶螺旋藻(

13、 Spirulina platensis) 细胞破碎液中富集分离藻蓝蛋白。在双水相体系中，待分离的组分选择性分配于其中一相，而其他杂质组分分配于另一相中，因此使待分离组分的浓度和纯度都得到提高。其中影响双水相萃取的因素很多，主要有：聚合物种类、聚合物平均分子质量和浓度、成相无机盐种类和浓度、离子强度、pH 值等。本实验选取聚乙二醇( PEG) 进行实验研究，考察PEG 平均分子质量和浓度、成相无机盐浓度、离子强度和pH 值对双水相萃取藻蓝蛋白的影响，以确定最佳的萃取条件。研究结果表明：萃取最适宜的条件为12% PEG 4000，15% Na2SO4，1% KCl时，藻蓝蛋白收率为91. 2%，

14、分配系数达到8. 01，分离因数达到6. 33。对于螺旋藻藻蓝蛋白的富集分离，双水相萃取法与传统的盐析沉淀法相比， 具有节省操作时间、简化操作过程、降低能耗和成本以及易于工艺放大等优点。王魏杰等9运用双水相技术分离提取钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白， 对构成双水相体系中不同分子量PEG 和酒石酸钾钠浓度的影响进行了分析。确定了双水相组成体系为16的PEG 2000(W/W)和25的酒石酸钾钠(W/W)，pH值为6.0，在此系统中藻蓝蛋白主要分布在上相， 最高纯度3.69， 分配系数20.7， 回收率94.56。多次双水相萃取有利于藻蓝蛋白纯度提高， 3 次双水相萃取后， 藻蓝蛋白纯度高达4.15。谢云飞

15、等10应用双水相体系分离血红蛋白( HB)。研究结果表明：最佳PEG 双水相体系为PEG400质量分数20%、( NH4 ) 2 SO4质量分数20% 、pH 值7、温度30。在此条件下，HB 分配系数达到65，回收率达到89. 5% ，纯度达到80. 5% 。萃取其他蛋白质Z.Du等11首次研究了使用离子液体 BmimCl/K2HPO4双水相体系直接从人类的尿液中萃取分离蛋白质，分相后蛋白质富集于上层离子液体相，分配系数在10左右，可以实现蛋白质的在线分离和量化分析。M.J.Ruiz-Angel等12测定了 Bmim Cl/K2HPO4和 Bmim Cl/K2CO3双水相系统的相图，并结合逆

16、流色谱萃取了卵清蛋白，分配系数达到180，而传统的双水相体系PEG /K2HPO4的分配系数只为1.4。A.M.Lopes等13研究了利用双水相胶束系统从样品中萃取绿色荧光蛋白和内毒素（脂多糖），当样品在双水相胶束系统中，绿色荧光蛋白进入了不含胶束的相，而内毒素进入了含胶束的相。该研究分析了绿色荧光蛋白由于在富含胶束的相中受到空间排斥效应而进入了不含胶束的相。因此该方法在生物科技中被作为纯化的第一步来去除高浓度的毒素。魏玲等14运用了PEG（6000）-Na2HPO4双水相系统对鹰嘴豆蛋白进行了萃取，并且分析了Na2HPO4的量、PEG的浓度、恒温超声时间、pH和温度对鹰嘴豆蛋白萃取的影响。研

17、究结果表明：萃取的最佳条件为PEG和Na2HPO4的质量比为1:1.5、PEG的浓度为10%、恒温超声时间为15min、pH值为7.5、温度为40时，蛋白质的萃取率可以达到63.46%。蔡马等15建立了PEG/(NH4)2SO4的双水相系统，通过优化实验的条件因素，确定了萃取苦瓜籽蛋白的最适(NH4)2SO4和PEG6000的质量分数分别为25%，22%，分配系数为0.089，回收率为96%。X.Xiong等16将聚合双水相系统和离心相结合来萃取大鼠背根神经节细胞质膜中的蛋白质，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱和生物信息学进行分析。研究表明：蛋白质的纯化浓度是原来的2.3倍，是整个组织裂解液的

18、15倍。通过搜索大鼠蛋白质序列数据库，从样品中鉴定出了729种蛋白质，其中547种是细胞的组成成分，159种被明确确定了的是神经节质膜上的蛋白质。二，双水相萃取技术在酶中的应用进展运用双水相系统来萃取酶，不但可以大大的提高酶的萃取效率，而且由于操作条件温和，使酶的活性没有较大的改变。有许多研究人员将双水相萃取技术来提取酶，下面列举了最近几年双水相系统在纯化酶方面的研究。萃取蛋白酶B.Ravindra Babu等17使用聚乙二醇/磷酸钾双水相系统第一次从菠萝中分离和纯化了混合酶（菠萝蛋白酶和多酚氧化酶）。并且研究了PEG分子量、相中各成分的浓度和系统的pH因素对萃取的影响，选取了最佳萃取条件：聚

19、乙二醇分子量1500、聚乙二醇占18%(质量分数)、磷酸钾占14%（质量分数）、pH6-9，该条件下，菠萝蛋白酶分布在上相中，多酚氧化酶分布在下相。随着聚乙二醇分子量的增加，两种酶的分离效果降低，并且相中各成分的含量对两种酶的分离纯化影响较大。在该双水相系统中（18%PEG1500、14%磷酸钾），菠萝蛋白酶的活性增加了228%，纯化倍数4；多酚氧化酶的活性增加了90%，纯化倍数2.7。Sarote Nitsawang等18用聚乙二醇/硫酸铵双水相系统（聚乙二醇8%质量分数，硫酸铵15%质量分数）萃取番木瓜乳胶中的木瓜蛋白酶并和传统的两步盐析法进行了比较，传统的盐析法萃取时含有许多其他的蛋白质

20、，且萃取率与样品的蛋白质浓度相关；而双水相萃取时萃取率高，时间短。张兰威等19研究了运用双水相技术分离提取风干香肠中蛋白酶，对构成双水相体系中的PEG分子量、浓度和类型以及盐浓度的影响进行了分析。确定了双水相组成体系为20% PEG1000(W /W )和25% M gSO4 (W/W )，在此系统中风干香肠的蛋白酶主要分布在上相，最高酶活12. 37 U /ug，纯化倍数为4. 61，回收率为85%。通过分子筛层析对比，表明风干香肠经过双水相分离提取杂蛋白峰被除去，而蛋白酶峰几乎未受到影响，说明了双水相体系萃取香肠中蛋白酶具有良好的专一性。调解双水相pH值对蛋白酶的萃取没有影响，而添加电解质

21、NaCl反而会有不利的影响。萃取脂肪酶黄瑛等20研究了用PEG/磷酸盐双水相系统从洋葱假单胞菌G-63发酵粗酶液中提取脂肪酶，并且分析了PEG分子量、PEG、磷酸盐、氯化钠溶液浓度和pH值对回收率、脂肪酶分配系数、纯化效率、分相时间的影响。研究结果显示：当PEG2000质量分数10%、磷酸盐质量分数15%、氯化钠浓度1%、pH值为8时，脂肪酶的最大回收率为87.25%、分配系数为4.36、纯化因子为3.98、分相时间16min。王蕾等21研究了使用双水相体系对Geotrichum spSYBC WU-3脂肪酶的萃取分离效果，选用PEG4000 / NaH2PO4作为成相系统进行研究，考察影响脂

22、肪酶萃取的各种因素(如PEG相对分子质量及质量分数、NaH2PO4质量浓度、pH)，并采用正交实验进一步优化实验条件，确定双水相萃取体系为PEG质量分数为30%、NaH2PO4质量分数为20%、体系pH为6，在此条件下Geotrichum spSYBC WU-3脂肪酶经硫酸铵沉淀和双水相萃取两步纯化的纯化倍数达到最大，Geotrichum spSYBCWU-3脂肪酶粗酶纯化了22倍。Geotrichum spSYBCWU-3脂肪酶纯酶为低温碱性脂肪酶，最适反应温度为15,最适pH为9.5，相对分子质量为3.58 104。萃取碳水化合物酶苏玉春等22研究了用PEG/磷酸氢二钾双水相系统从黑曲霉A

23、S3.4309的发酵液中提取木聚糖酶，采用正交实验优化实验条件，确定了双水相体系为PEG4000质量分数19%，磷酸氢二钾质量分数为10%；在此条件下，木聚糖的萃取效果比较好，其分离系数达到6.23，上相产率达到88.67%。房耀维等23采用PEG/磷酸盐双水相系统从Pseudoalteromonas arctic GS230 发酵液中萃取分离低温a-淀粉酶。通过正交优化实验确定了pH值为5、PEG1000为15%、磷酸盐15%，在此条件下，纯化系数为4.8，回收率为87%。舒国伟等24研究了PEG4000/(NH4)2SO4双水相系统从商品纤维素酶样品中萃取纤维素酶，并探讨了PEG浓度、硫酸

24、铵浓度和pH对提取纤维素酶的影响；通过实验确定PEG质量分数26%、硫酸铵质量分数8%、pH4.8时，纤维素酶的分配系数为5.21，萃取率为79.4%。陈利梅等25研究了采用聚乙二醇/硫酸铵 PEG /( NH4 )2SO4 双水相系统对葡萄糖氧化酶的萃取。以双水相系统的上、下相的酶活性、比酶活性、相比R、分配系数K和萃取率Y等为参数，分析了PEG质量分数、不同PEG浓度和不同硫酸铵浓度对葡萄糖氧化酶在PEG /( NH4 )2SO4双水相系统中分配行为的影响。实验结果表明：葡萄糖氧化酶在25%的PEG4000和10%硫酸铵的双水相体系中可获得较高的萃取率达81.11%，分配系数为0.134。

25、周念波等26使用PEG/(NH4)2SO4双水相系统从Bacillus spLS的发酵液中提取壳聚糖酶，并且分析了PEG的分子量和质量分数、硫酸铵的质量分数、氯化钠的质量分数以及pH值对壳聚糖酶的分配系数和萃取率的影响；通过研究表明：萃取的最佳条件为PEG600 20%、硫酸铵20%、氯化钠0.1%、pH值为6，在该条件下，壳聚糖酶的分配系数为5.91，萃取率为88.7%。张娟等27使用PEG/(NH4)2SO4双水相系统对果胶酶进行了分离纯化，探讨了PEG分子量和质量分数、硫酸铵质量分数、pH值、氯化钠浓度、温度对果胶酶分配系数的影响。通过实验，PEG1000 27%，硫酸铵19%、pH5.

26、0、氯化钠0.002%、温度50时，萃取效果比较理想，在该条件下，分配系数达到了14。萃取过氧化物酶M.Scott Long等28研究了生物偶联技术对胶状金纳米粒子在PEG/葡聚糖双水相系统( ATPS) 中分离蛋白质的影响；山葵过氧化物酶( HRP)通过吸附结合胶状金纳米粒子，虽然HRP很少存在于相中，但HRP/金纳米粒子结合可以存在于PEG相，结合15nm胶状金的比例高达1501。其他蛋白质/金纳米粒子结合在右旋糖酐相中分离大于20001，而自由蛋白为51。分离程度取决于聚合物浓度、分子量、纳米粒子直径，在一般情况下取决于纳米粒子。在既不改变蛋白质的化学性质或聚合物的亲和力配体，也不增加盐

27、类浓度的情况下，通过结合金纳米粒子，大幅度提高了蛋白质的分离，这很大程度上归因于偶联物表面积的增加。吸附胶体粒子提供一个有吸引力的路线，以增加酶和其他蛋白质在ATPS中的分离。此外，这些结果表明：在净化生物分子/纳米粒子结合体中，ATPS分离作为一个强有力的手段，正越来越多地应用于诊断和材料方面。C.Qing等29以山葵过氧化酶(HRP)为例,研究了氯化烷基咪唑离子液体（K2HPO4）、离子液体烷基链长度和每一组分的浓度对酶活性和分离现象的影响。离子液体( 1-丁基-3-甲基咪唑和氯化1-乙基-3-甲基咪唑) 和水分含量( 40% )都是维持HRP在离子液体双水相系统的中活性必不可少的条件。研

28、究表明：C4mimCl对形成双水相和保持HRP的活性有利。在优化的条件下，约80%的HRP分离到离子液体上相中，并且酶活性达到了90%以上。此外，与常用的聚合物/盐双水相系统相比，C4mimCl双水相的黏度要低很多，对实验操作非常的好。因此，离子液体双水相体系被认为是有很好的酶萃取系统。双水相系统在萃取蛋白质和酶方面的应用展望双水相萃取技术作为一向新型的分离技术，克服了常规有机溶剂对生物大分子的变性作用，因此提供了一个比较温和的活性环境，在萃取蛋白质和酶等活性物质方面具有明显的技术优势，并且取得了阶段性的成果。然而，由于该向萃取技术还是处于起步和发展的阶段，在使用和研究的过程不可避免的会遇到相

29、关的技术难题：像易乳化、相分离时间有时很长、成相聚合物的成本比较高、聚合物回收比较困难以及大多数水溶性聚合物粘度大不易定量控制等。对双水相系统的动力学研究、双水相萃取的设备流程研究以及成相聚合物的重复使用需要进一步的研究和开发。随着研究的深入，其形成机理、热力学模型、动力学模型以及相关的技术工艺问题最终会得到突破和解决；毋庸置疑，双水相萃取技术在蛋白质和酶中的应用将会越来越广泛。参考文献：1朱陈银,邓凡政,高贺军.离子液双水相中茜素红S与牛血清白蛋白作用研究J .淮北煤炭师范学院学报: 自然科学版, 2009, 30( 3): 45-46.2陈琳琳,汤秀琴,邓凡政.离子液体双水相中铕离子与牛血

30、清白蛋白作用的研究J.化工科技,2011,19(3):13-15.3王军,张艳,时召俊等.N-乙基-N-丁基吗啉离子液体双水相体系萃取分离蛋白质J应用化工,2009,38(1):70-72.4邓凡政,郭东方.聚乙二醇硫酸铵双水相中苋菜红与蛋白质作用的初步研究J. 淮北煤炭师范学院学报: 自然科学版,2007,28(2):29-32.5F.Qu,H.Qin,M.Dong,D.X.Zhao,X.Y.Zhao,J.H.Zhang,Selective separation and enrichment of proteins in aqueous two-phase extraction system

31、,Chinese Chemical Letters.20 (2009)1100-1102. 6Q.Q.Gai,F.Qu,T.Zhang,Y.K.Zhang, Integration of carboxyl modified magnetic particles and aqueous two-phase extraction for selective separation of proteins,Talanta,85 (2011) 304-309.7白海鑫,刘小花,杨帆等.通过一步萃取将组蛋白分为多个亚组分的蛋白质组预分离方法的建立J.高等学校化学学报,2010,31(7):1314-132

32、1.8刘杨,王雪青,庞广昌等.双水相萃取法富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的研究J.海洋科学2008,32(7):30-33.9王魏杰,徐长波.双水相萃取藻蓝蛋白的研究J.技术食品工程,2009:92-95.10谢云飞,常雅宁,谢志镭等.用双水相体系分离血红蛋白(HB)J.华东理工大学学报：自然科学版,2010,36(5):685-689.11Z.Du,Y.L.Yu,J.H.Wang, Extraction of Proteins from Biological Fluids by Use of an Ionic Liquid/Aqueous Two-Phase System,Chemistry,13 (2007) 2130-2137.12M.J.Ruiz-Angel,V.Pino,S.Carda-Broch,A.Berthod, Solvent systems for countercurrent chromatography: An