质粒DNA的提取实验报告思考题.docx

1、质粒质粒 DNA 的提取实验报告思考题的提取实验报告思考题 质粒质粒 dna 的提取实验报告思考题的提取实验报告思考题 人 篇一：质粒 DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题 1实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的方法和技术；2实验材料及用品（1）实验仪器（apparatus）：恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（Vortex

2、mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator）3）、材料与试剂（Reagents）：溶液 I（Solution）：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（T

3、ris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0 溶液 I可成批配制，每瓶约 100ml，10 磅高压蒸气灭菌 15分钟，贮存于 4。溶液（Solution）：新鲜配制，等体积混合 0.2mol/L NaOH（临用前用 10mol/L贮存液现用现稀释）；1%SDS（可用 10贮存液稀释配制）注意：SDS 易产生气泡，不要剧烈搅拌。溶液 III（Solution，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀 60mL5mol/L KAc，11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O（该溶液钾离子浓度为 3mol/L，醋酸根离子浓度为 5mol/L）TE液缓冲液

4、：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）70%乙醇；平衡酚：氯仿 1：1：将量取 25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入 24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。LB培养基：胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 15g pH 7.0 琼脂糖（Agarose）；1 liter（升）5 TBE 备用溶液（stock solution）：54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid），20ml 0.5 mol/L EDTA,pH 8.0；6 凝胶加样缓冲液：0.

5、25%溴酚蓝（bromophenol blue），40%蔗糖（sucrose in water）；另外还有的试剂是：胰 RNA酶、DNA Marker、硼酸、Gelview试剂（2）实验材料：含有 pUC19 质粒的大肠杆菌等。3实验原理：1）质粒 DNA的提取：（1）关于质粒：质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的 DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从 1kb 至 200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复

6、制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。（2）一般分离质粒 DNA的方法都包括 3个步骤：培养细菌，使质粒 DNA大量扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒 DNA。分离制备质粒 DNA 的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS 法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA的用途进行选择。（3）碱裂解法提取大肠杆菌质粒 DNA的原理：碱裂解法提取质粒 DNA是根据共价闭合环状质粒 DNA和线性染色体 DNA在拓扑学上的差异来分离质粒 DNA。在 pH值介于 12.012.5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA双螺旋结

7、构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH至中性时，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体 DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒 DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子 RNA，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒 DNA。2）质粒 DNA的琼脂糖凝胶电泳：（1）关于电泳技术：电泳常用

8、于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离 200 到 50,000 bp 大小的 DNA 片断。一般琼脂糖胶浓度在 0.5到 4之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的 DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的 DNA片断。（2）琼脂糖凝胶电泳条带的观察：通过观察示踪染料的迁移

9、距离可以判断 DNA 的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与 300 和 4000bp 大小的双链 DNA片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过 Gelview染色来观察 DNA片断。Gelview 是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳 时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的 Gelview 溶液中进行染色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的 DNA或 RNA进行观察。（3）质粒 DNA的琼脂糖凝胶电泳分离：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA 分子在高于等电点的 pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的

10、重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的 DNA分子泳动速率不一样，可以进行分离。未切割的质粒 DNA 在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒 DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在：超螺旋 DNA：尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内 DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它

11、在凝胶中的泳动速度最快。线性 DNA：当 DNA损伤在 DNA 双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种 DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒 DNA之间。开环 DNA：在质粒 DNA复制过程中，拓扑异构酶 I会在 DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。4实验方法步骤及注意事项 1）实验方法步骤 第一部分：质粒 DNA 的提取及酶切（1）取 1.4 ml 含 pUC19 这里的大肠

12、杆菌培养物于 1.5 ml 微量离心管中，4 000 r/min 离心 2分钟，吸去上清液，并使细胞沉淀尽可能干燥；（2）加 100 ml 溶液悬浮细菌沉淀，充分混和均匀，室温放置 10 min；（3）加 200 ml 溶液（新鲜配制），盖紧管口，轻缓上下 4-6次颠倒离心管以混合内容物。将离心管静置冰上 5 min（使溶液变透明，粘稠）；（4）加 200 ml 溶液（事先冰上预冷），盖紧离心管口后上下轻缓颠倒 4-6次，置冰上 15 min(溶液出现白色沉淀)；（5）12 000 rpm 离心 15 min，转移上清液至另一离心管（弃沉淀）；（6）向上清液中加入等体积的酚：氯仿（1：1），反

13、复混匀，12 000 rpm 离心5min，取上清液移至另一离心管中；（7）加 2倍体积无水乙醇，振荡混匀，静置 10 min，12000 rpm 离心 510 min。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。（8）加 200 ml 70乙醇洗涤沉淀物，12000 rpm 离心 2 min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干（或在 5060的烘箱中也可）。（9）沉淀加 20l TE,反复吹打使质粒 DNA 充分溶解，20保存。第二部分：质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳.凝胶的制备（Preparation of the gel）（1）制备 1琼脂糖凝胶：称取 0.5g琼脂糖，放人锥形瓶

14、中，加入 50mL的 0.5 TBE 缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为 0.5琼脂糖凝胶液（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）；(2）制胶器的安装：取多功能制胶器，洗净，晾干；将多功能制胶器放置于一水平位置，选择 12 6cm 制胶架，然后选择 1.5mm 18teeth 的梳子（最大加样量 25l）；将所选择规格的梳子插入制胶架的定位槽中；（3）将熔化的琼脂糖凝胶液转入 Gelview专用的三角瓶中，然后加入 Gelview 5l；（4）将冷到 60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入所选择的制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)；（5）待

15、胶凝固后（30-60min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内；（6）加入电泳缓冲液(0.5）至电泳槽中；.加样(Loading DNA samples)：用移液枪缓慢将 DNA 样品及其经过酶切的质粒 DNA样品垂直加入加样孔直至开口下方（记录点样顺序，以便作为对照和分析），各加样量如下：DNA samples：15l 酶切的 DNA样品：3l Loading buffer：2l DNA markers：6l（DNA samples 与 Loading buffer总共加入 20l）.电泳（Gel）：（1）接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。

16、保持电压 120V；（2）当溴酚蓝染料移动到凝胶总长度一半处时，停止电泳；.Gel Interpretation（凝胶图像解释）：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下进行 DNA 电泳条带的观察，并用凝胶电泳成像系统进行拍照、分析。2）注意事项（1）加溶液 I后，必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒DNA提取的首要关键；（2）（3）TAE和 TBE 均为常用的缓冲液。TBE 比 TAE有相对高的缓冲能力。加样染料溴酚蓝可与长度约为 0.5 kb的 DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。（4）DNA的迁移速率取决于以下因素:DNA的分子大小分子量越小，迁移越快。琼脂糖浓度浓度

17、越低，迁移越快。DNA的构象环状的或带切口环状的 DNA 通常比线状的 DNA 迁移要快。两个电极之间单位厘米的电压电压越高，迁移越快。（5）如果 DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：DNA过载电压过高加样孔破损 凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二实验内容 1 实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的 DNA电泳条带图如下所示意：图注：x：代表经过酶切的质粒 DNA样品的电泳条带；x：代表未经过酶切的质粒 DNA样品的电泳条带（x 相同的互为对照组）；marker:D

18、NA相对分子质量标准物。pUC19 质粒 DNA标准参照条带图像：2 对实验现象、实验结果的分析及其结论：对实验现象的分析及其结论：从上述所示的 DNA电泳条带图可以看出：不管在 DNA Sample 中还是在经过酶切处理后的 DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒 DNA。而在此次试验中出现线性质粒 DNA是因为 pUc质粒 DNA在提取的过程中 DNA 双链在相对应的两条链上同时产生切口。这说明质粒制备过程个出现线性 DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在 marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中

19、加入溶液所经历的时间过长，在碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒 DNA样品混入了基因组 DNA。但是其中各组也存在超螺旋 DNA（与 marker 组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。标号为 1、2和 3 组的电泳条带存在开环质粒 DNA（与 marker组的最后一条带相比较，同在一条水平线上且较亮的一条条纹即为开环质粒 DNA），而且只出现在未经过酶切的质粒 DNA Sample 中，这说明在此次实验过程中酶切是彻底的。从总体上观察，所有电泳条带的亮度并不高，可能是提取的质粒 DNA 量较少（浓度过低）或电泳前加样量过少所致。5作业 1.简要叙述溶液、溶液和溶液的作用

20、，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因?溶液的作用：悬浮大肠杆菌菌体，而且加溶液 I后，必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒 DNA提取的首要关键。且其中含有的溶霉菌可以水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4 糖苷键，因而具有溶菌作用。另外葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液 I中加入 EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制 DNase 对 DNA的降解和抑制微生物生长的作

21、用。另外也可保证溶菌酶活性。溶液的作用：提供碱性条件，在 NaOH与 SDS 的共同作用下使大肠杆菌瞬间裂解，并变性核DNA。当细胞悬浮于 NaOH和十二烷基酸钠（SDS）溶液中使，在高 pH（碱性环境）的作用下细胞发生裂解，此外蛋白质和染色体 DNA发生变性与细胞碎片一起沉淀下来。这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化。新配制的溶液避免作为最佳溶解细胞的试剂NaOH接触空气中的 CO2过久而减弱了碱性。用不新鲜的 0.4 M NaOH，即便有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌。因此必须使用新鲜的 0.4 M NaOH试剂进行配制。溶液的作用：

22、该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基硫酸钠（即 SDS 与 NaOH所形成的可溶性物质）发生反应形成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），从而将与之结 篇二：质粒 DNA测定生化实验报告 生物化学实验报告 姓 名：杨晓霞 学 号：3120040025 专业年级：2012级口腔 组 别：第一实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 篇三：质粒 DNA的提取、定量、酶切与 PCR 鉴定实验报告 质粒 DNA的提取、定量、酶切与 PCR 鉴定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习

23、并掌握紫外吸收检测 DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反应)在 DNA聚合酶催化下，可以 DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制 DNA，使目的 DNA按 2n方 式呈指数形式扩增。PCR 一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至 95，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（3570,一般低于模板 Tm 值的 5 左右），与模板

24、 DNA 互补退火形成部分双链。C.延伸：溶液反应温度升至中温 72，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 为原料，引物为复 制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。2.质粒 DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体 DNA与质粒 DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体 DNA和质粒 DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其 pH值至中性时，变性的质粒 DNA复性并保存在溶液中，染 色体 DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低 pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA，而不吸附溶液 中的

25、蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高 pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA从硅基质膜上洗脱。3.质粒 DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280及 A260/A230 的比值可以反应 DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA 纯净 A260/A2801.8 含 RN

26、A杂质，用 RNA酶去除。4.质粒 DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是 DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与 一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并 在结合位点切割双链 DNA。5.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于 琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的 DNA，分子量大小 及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数 值成反比关系).三、材

27、料与方法：（一）实验材料：1.PCR 仪器：PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 材料：菌液【大肠杆菌 DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2 Premix Taq、引物 2.质粒 DNA的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管 材料：溶液 P1（S1）、溶液 P2(S2）、溶液 P3（S3）、去蛋白液 PE（W1）漂洗液 WB（W2）、洗脱液 EB（Eluent)、含 pMD19-T质粒的大肠杆菌 DH5 3.质粒 DNA的定量（紫外分光光度法）仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 材料：蒸馏水、质粒 4.质粒 DNA的酶切鉴定 仪器：1.5ml 的 EP 管、微量加样枪 材料：无菌水、10 M 酶切缓冲液 Buf R、质粒 DNA、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳 仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液（二）实验方法 1.PCR 2.质粒 DNA的提取与制备 3.质粒 DNA的定量（紫外分光光度法）质粒 dna的提取实验报告思考题