微生物检验操作规程.docx

1、微生物检验操作规程微生物检验操作规程1. 目的建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作规范化。2. 范围适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。3. 职责3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程；3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。4. 操作规程4.1 微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤4.1.1 一般的玻璃器皿（例如培养皿、试管、三角瓶等），可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢，然后用自来水、蒸馏水充分冲洗，直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜，即器壁既不挂水珠也无条纹，即洗涤达到标准。4.1.2 玻璃器皿内有污迹不能洗净时，可浸泡于洗液中，待器皿中有机物氧化分解后，取出用自来水、蒸馏水冲

2、洗干净，备用。4.1.3 新购的玻璃器皿先用2盐酸浸泡，再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。4.2 器皿的包扎4.2.1 试管：塞上胶塞，然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。做发酵试验时，将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。4.2.2 三角瓶、抽滤瓶：将三角瓶（抽滤瓶）口塞上胶塞，然后用牛皮纸把塞头部包起来。4.2.3 吸管：将耐高温的移液枪头装盒，用用牛皮纸或报纸包裹。4.2.4 平皿：10个为一组，用牛皮纸包裹。4.3消毒和灭菌：4.3.1 化学灭菌：此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。如人手等。（1）用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。（2）一般用12%的甲醛液浸泡

3、软管和用具。（3）一般成品漂白粉的有效成分是2532% 。使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内，（对金属有腐蚀作用）放置1015min后冲洗即可。（4）氯灭菌剂的能力以有效氯表示，将氯水配制成50100PPm 的有效氯溶液，可用于浸泡，冲洗和表面杀菌。但氯对金属有腐蚀作用。4.3.2 物理灭菌：固体试液、液状石蜡等。灭菌条件一般选用在160干热空气灭菌2h。（1）器具用牛皮纸或灭菌袋包（装）扎，放入金属容器内。（2）器具在干燥箱加热前放入，每个器具之间留有足够的空隙，使热空气能畅通。（3）关闭箱门接通电源，打开通气孔，使箱内湿空气能逸出，至箱内温度达到100时关闭。（4）加热至160，

4、保持2小时。（5）切断电源，冷却至60 时，打开箱门，取出灭菌器具，并打开箱顶通气口。注：灭菌时必须注意温度不能超过180，以免使棉花、报纸烘焦；灭菌时不得打开箱门；干燥箱未冷却时，不要取出里面器具，防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸璃器具爆炸。无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损伤的物品。详见压力蒸汽灭菌器操作规程。（1）装入培养基的瓶用胶塞盖上，再用牛皮纸包扎。（2）瓶中的培养液不要超过1L，否则灭菌不彻底。（3）容器的上部应留有足够的空间（一般不超过装量的2/3），以便产生气泡。（4）器具用牛皮纸包裹。（5）器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。（6）各类器具装入灭菌器时，

5、相互间要留有空隙以使蒸汽自由流动。4.4 无菌操作的准备工作及注意事项4.4.1 微生物室应定期按微生物实验室管理规程清洁。4.4.2 微生物室使用前，应先打开紫外灯灭菌2030min。4.4.3 微生物室应备有专用剪刀、镊子、接种针，每次使用前后应灭菌消毒。4.4.4 微生物室应备有75%酒精棉球；新洁尔灭消毒液内浸纱布数块，备用。4.4.5 进入微生物，换专用鞋，穿好洁净服，离室时脱去洁净服和专用鞋，洁净服和专用鞋只准在微生物室内使用，不准穿到其它地方去，并定期洗换和消毒灭菌。4.4.6 样品检验前应在原始记录本上记录名称、批号等内容，并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期等内容。

6、4.4.7 无菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。4.4.8 操作要正确迅速，所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。4.4.9 检验完毕，立即清理工作台，弃去不需要物品，打开紫外灯灭菌2030min。4.5 微生物检验用培养基、溶液的配制、使用与储存配制方法参见培养基说明书或检验标准项下规定配制。4.5.1 水：电导率在25时不超过25s/cm，除非另有规定要求。4.5.2 称重和溶解：保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定，已制备好的培养基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30min，使其与室温一致再使用，因为气体的溶解度可因温度上升而降低，特别是乳糖胆盐

7、发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡，这一点必须注意。4.5.3 pH 的测定和调整： 用pH计测pH，必要时在灭菌前进行调整，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25时，pH应在标准pH0.2范围内。一般使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调整培养基的pH。4.5.4 分装：将配好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积应比培养基体积最少大20%。4.5.6 培养基的使用：经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间，融化后避免过度加热。融化后应短暂置于室温中（如2 min）以避免玻璃瓶破碎。 融化后的培养基放入4750的恒温水浴锅

8、中冷却保温，且应尽快使用，放置时间一般不应超过4 h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意，融化后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参考指定的标准。 倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为3 mm（直径90 mm的平皿，通常要加入18 mL20 mL琼脂培养基）。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板需储存，或者培养时间超过48h或培养温度高于40，则需要倾注更多的培养基。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）53冰箱的密封袋中，以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记，标记的内容包括名称、制备日期和（或）有效期。也可使用适宜的

9、培养基编码系统进行标记。 将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对培养基表面进行干燥处理。 对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱或培养箱中（温度设为2550）；或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。4.6 检验方法做样前，将灭菌好的吸管、培养皿等放入操作台上，操作台、微生物室紫外线灭菌30min，然后关紫外线灭菌灯，开启净风循环30min后开始做样。详见附录各检测方法附录1 菌落总数测定

10、附录2 霉菌和酵母计数附录3 大肠菌群计数附录4 大肠埃希氏菌计数附录5 沙门氏菌检验附录6 金黄色葡萄球菌检验附录1 菌落总数的测定方法1. 样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水中均质1 min2 min制成1:10 的样品匀液。1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。1.3 用1mL微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支

11、无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。1.6 及时将15mL20mL冷却至46的平板计数琼脂培养基（可放置461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。2. 培养2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，361培养48h2h。2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻

12、转平板，按条件进行培养。2.3 菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。2.3.1选取菌落数在30CFU300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。2.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。2.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状

13、生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。3 结果与报告3.1菌落总数的计算方法3.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。3.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。3.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数

14、乘以最高稀释倍数计算。3.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。3.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.2 菌落总数的报告3.2.1 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。3.2.2 菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字后面用0代替位数

15、；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。3.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。3.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。3.2.5 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。附录2霉菌和酵母菌计数1. 样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即1:10稀释液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3 取1mL1:10稀释液注入

16、含有9mL无菌水的试管中, 另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，此液为1:100稀释液。1.4 按1.3 操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。1.6 及时将15mL20mL冷却至46的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。2. 培养待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养5d，

17、观察并记录。3. 菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（CFU）表示。选取菌落数在10CFU150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。4. 结果与报告4.1 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。4.1.2 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。4.1.3 若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。4.1

18、.4 若所有稀释度平板均无菌生长，则以小于1乘最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。4.2 报告4.2.1 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。4.2.2 菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。4.2.3 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。附件A菌落总数、霉菌及酵母数检验流程图附录3大肠菌群计数第一法 MPN计数1. 样品的稀释1.1 固体和半固体样品

19、：称取25g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水均质1min2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋制成1:10 的样品匀液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3 样品匀液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支1mL

20、无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。2. 初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），361 培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。3

21、. 复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，361培养48h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。4. 大肠菌群最可能数（MPN）的报告按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附件B，表1），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。第二法 平板计数法1. 样品的稀释按第一法中的1进行。2. 平板计数2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。2.2 及时将15mL20mL冷至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心

22、旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于361培养18h24h。2.3 平板菌落数的选择选取菌落数在15CFU150CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。3. 证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361培养24h48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。4. 大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以2.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，

23、即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。附件B表1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN95%置信区间阳性管数MPN95%置信区间0.100.010.001上限下限0.100.010.001上限下限0000001111111122222200112300011223000111010100012010100120123.03.03.06.16.29.43.67.2117.4111

24、115169.21420152027-0.150.151.21.23.60.171.33.61.33.63.64.54.51.43.64.53.74.58.79.59.61118183818183820384242423842424242942222233333333333333322233000111122223333012010120123012301232128352936233864437512016093150210290240460110011004.58.78.78.78.74.68.717917374018374090429018042042949494949411018018

25、02004204204204204301000100020004100注1：本表采用3个稀释度0.1g (mL)、0.01g (mL)和0.001g (mL)，每个稀释接种3管。注2：表内所列检样量如改用1g (mL)、0.1g (mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g (mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。附件 C大肠菌群计数检验流程图第一法 MPN计数法 第二法 平板计数法附录4大肠埃希氏菌计数第一法 MPN计数法1. 样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓

26、冲液或生理盐水均质1min2min,制成1:10 的样品匀液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3 样品匀液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操

27、作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。2. 初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），361 培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h2h，产气者进行复发酵试验。产气者进行复发酵试验。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN 结果。3. 复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中

28、分别取培养物1环，移种于已提前预温至45的EC 肉汤管中，放入带盖的44.50.2水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。4. 伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，361培养18h24h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。5. 营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落

29、中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，361，培养18h24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。6. 鉴定取培养物进行靛基质试验、MR（甲基红）-VP试验和柠檬酸盐利用试验（详见生化试剂盒使用）。5.3 大肠埃希氏菌MPN 计数的报告大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为或。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表（见附件D，表2），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。第二法 平板计数法1. 样品稀释按第一法中的1进行2. 平板计数2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。2.2 将10mL15mL冷至450.5的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3mL4mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，361培养18h24h。2.3 平板菌落数的选择选择菌落数在10CFU100CFU之间的平板，暗室中360nm366n