1、REACH法规 第四卷译稿18B.17.基因突变IN 体外 哺乳动物细胞的基因突变测定1.测定方法此方法是和OECD TG476,哺乳动物细胞基因突变测定(1997)同样的测定。1.1.引言体外哺乳动物基因突变测定可被用来探知由化学物质诱导的基因突变。合适的细胞群包括L5178Y老鼠淋巴瘤细胞,CHO,CHO-AS52和中国大鼠细胞的V79阵列,以及TK6人类淋巴胚细胞。在这些细胞阵列中,最常用的是TK,HPRT,和XPRT.TK,HPRT和XPRT探知不同幅度的基因事件。TK和XPRT可以探知常染色体的基因事件,但不能探知X染色体,而HPRT可以。在哺乳动物基因突变测定中,可用建立细胞阵列或
2、细胞品系的培养环境。细胞根据在培养液中的生长能力和自然有丝分裂频率的稳定性来选择。测定基本都需要外加物质交替环境。这物质交替环境不能完全模仿哺乳动物样品的生长条件。应注意控制条件避免导致结果不能反映特属于某器官的突变。不能反映内部突变的阳性结果可能是由于PH值的改变或毒性太高。这个测定被用来测定可能的哺乳动物基因突变和诱癌因素。许多在此测定中呈阳性结果的化合物是生癌物质。然而,这个测定和致癌之间无绝对的关联。这种关联决定于药品种类。越来越多的证据表明还有不少诱癌因素这个测定不能探知,它们似乎是通过其它细菌细胞中没有的机制起作用。见B部分的总引言。1.2.定义正向突变:从亲代类型突变导致催化合成
3、基因对应的蛋白质的酶的功能丧失或改变。碱基替代突变:物质使DNA的一对或几对碱基发生突变。移码突变:物质使DNA分子中的一个或成对的碱基发生增添或缺失。表现型表达时间:未改变的基因被新改变的基因替代的时间。突变频率:观察到的变异的细胞数除以总的细胞数。相对总增长:随着时间的过去,细胞数目相对于控制细胞数的增长。计算相对于阴性测定的间歇期增殖数目乘以相对于阴性测定的繁殖效率。相对间歇期增长量:表达期过后相对于阴性测定的细胞增长数目。生活体:表达期后在选择条件下的培养皿中,被处理细胞的繁殖率存活率:在处理结束时被处理细胞的繁殖率;存活率通常以与控制细胞数相比的形式表示。1.3.测定方法原理细胞中胸
4、苷激酶(TK)缺陷,由于突变新种TK+/.TK-/-抵抗TFT的毒性效应的。TK细胞对TFT敏感,从而抑制了细胞的新陈代谢,并阻止了进一步的细胞分裂。因此,突变细胞在TFT存在下可以增生,而正常的含TK的细胞却不能。类似地,在HPRT或XPRT中有缺陷的细胞是通过对TG和AG的抵抗而被选择的。在哺乳动物基因突变测定中,若被测物是与选择性试剂有关的主要基础类似物或一化合物,则应该仔细判断测定物的性质。例如,对突变细胞和非突变细胞,任何被怀疑对测定物毒性的选择性试剂都应仔细研究。因此,当测定化学药品与选择性试剂结构相关时,选择性体系或试剂的使用必须被证实可行。将处于间隔期或单分子培养基的细胞在有和
5、没有物质交替的环境中加入测定物,一段合适时间后再做次培养以确定毒性,并在变异选择之时使形状得以表达。毒性通常用测定相对繁殖效率(存活率)或处理期以后的相对总增长(存活率)来确定。处理液使在生长环境中经过充足的时间获得的,从而使诱导新种的性状得到最佳的表达。测定突变频率是将已知数目的细胞置于包含选择性试剂的环境中探知突变细胞,再将已知数量的细胞置于不含选择性试剂的环境中测定繁殖效率(存活率)。经过一段合适的培养时间,点数细菌数目。突变频率从选择性环境中的突变突变细菌数目和非选择性环境中的突变数目推得。1.4. 测定方法描述1.4.1. 准备1.4.1.1细胞此测定中使用了大量的细胞类型,包括L5
6、178Y,CHO,CHO-AS52,V79或TK6 细胞。此测定所用的细胞类型必须对化学诱变剂有显著的敏感性,繁殖率高,还要有稳定的自然突变频率。细胞必须检查是否被污染,若被污染则不能使用。测定设计时要预先确定测定限和准确度。细胞数,基液和测定物浓度应反映这些参数。处理后仍存活的最小细胞数目及测定每阶段所用的最小细胞数取决于自然突变频率。经验规律是用自然突变频率反函数十倍的细胞数。尽管如此,建议使用最少106个细胞。足够的细胞体系的历史资料可用来指示可靠的测定操作。1.4.1.2.介质和培养条件应选用合适的介质以及培育条件(培养容器,温度,CO2浓度和温度)培养应根据测定中选择性体系和细胞类型
7、来选择。培养条件的选择尤其重要,要使之确保表达期细胞的最佳生长以及变异和非变异细胞的增殖能力。1.4.1.3.培养的准备细胞是从繁殖培养液中增殖的,于37在培养液中种植和培育。在此测定之前,必须除去先前存在的突变细胞。1.4.1.4.新陈代谢活动细胞应当存在于有或没有合适的新陈代谢活性的系统中。最普遍使用的系统是从用酶诱导基因预处理过的啮齿类动物样品的肝脏中提取的线粒体馏分。在最终的测定环境中,馏分通常以浓度(V/V)为110%的溶液使用。物质交换体系条件的选择取决于被测定化学药品的等级。在某些情况下,可用不止一种浓度的馏分。基因工程细胞阵列的建构,表达特种催化酶等许多发展可能提供内部活化的可
8、能性。所使用细胞阵列的选择必须有科学的依据。1.4.1.5.测定物质/准备固态测定物应用合适的溶剂溶解或悬浮在合适的媒介中,并在处理细胞之前进行稀释。液态测定物可直接加入测定体系中,或在处理前稀释。应使用新鲜制备的测定物,除非可靠的实验数据证明贮存物的可行性。1.4.2.测定条件1.4.2.1.溶剂/介质溶剂或媒介不可以与测定物质发生化学反应,而且可与生存的细胞及S9活动相容,若所用溶剂不是常用溶剂,应用实验数据证明其组成的可行性。如果有可能,应优先考虑含水溶剂,当测定物遇水不能稳定存在时,有机溶剂应除水。可加入分子筛除水。1.4.2.2.接触浓度决定最高浓度时考虑的因素有,测定体系中的溶解度
9、,PH的改变。应该在主测定中用一指示细胞完整和生长的指示剂在有和无新陈代谢活动时测定相对繁殖率(存活率)或相对总增长,从而得出毒性。在初步测定中测定毒性和溶解度是有用的。至少要用四种可分析的浓度。当有细胞毒性时,这些浓度分布需从最大到几乎无毒性。这通常意味着浓度水平应被仅仅介于2和的因素分隔。若最大浓度建立在细胞毒性的基础上,则它应该导致约1020%的的相对存活率(相对繁殖率)或相对总增长。对于相对无毒的物质,最大测定浓度应该为5mg/ml,5ul/ml或0.01M。相对不溶物的测定量应达到或超过其溶解极限。不溶物的证据应在细胞接触的最终处理环境中决定。在处理初始和结束时评估溶解度是有益的,因
10、为由于细胞,S9,乳浆等的存在,在测定中接触的过程中,测定物的溶解度会发生变化。不溶物用肉眼观察。沉淀物不可以干扰现象记录。1.4.2.3.对照组测定每个测定都必须包含阳性阴性对照组测定,包含有和没有新陈代谢活动的测定。当新陈代谢活动被使用时,阳性对照组测定需要有一活化作用来给出突变响应。阳性对照组测定物质示例有:新陈代谢活动情况座位物质CAS NO.EINECS NO.外生新陈代谢作用的缺乏HPRT甲磺酸乙脂乙基甲硝基脲62-50-0759-73-92000-536-7212-072-2TK(大小菌群)甲磺酸乙脂66-73-3200-625-0XPRT甲磺酸乙脂乙基甲硝基脲62-50-075
11、9-73-9200-536-7212-072-2存在外生新陈代谢作用HPRT3-MethcholanthreneN-亚硝基二甲胺7,12-Dimethylbenzanthracene56-49-562-75-957-97-6200-276-4200-549-8200-359-5TK(大小菌群)环磷酰胺一水环磷酰胺Benzoapyrene3-甲基胆蒽50-18-06055-19-250-32-856-49-5200-015-4200-028-5200-276-5XPRTN-亚硝基二甲胺( S-9 高标准 )Benzoapyrene62-75-950-32-8200-549-8200-028-5其
12、他合适的正参考物质参考物质也可被使用,比如,若一实验室有基于5-溴-2- deoxyuridineCAS n,59-14-3,EINECS n.200-415-9,这一参考物质也是可用的.。在使用正参考物质的化学同系物时,其作用应首先被确认。负参考物质,包括溶剂、在处理媒质中单独使用的载色剂、以及以相同方法处理的组分都应包括在内。另外,无处理参考物质也应包括在内,除非有历史实验数据证明所选用的溶剂无毒并不会引起基因突变。1.4.3.步骤1.4.3.1.测定物处理无论是否具有新陈代谢作用的增殖细胞都应接触预测定物质中。接触时间应适当(有效时间一般为三至六小时)。接触时间应长达一个或几个细胞周期。
13、单处理载体或其副本在每个浓度测定中都应被使用。单处理载体在使用适应适当被浓缩以保证有足够适量载体以供分析。(例如,至少个单位的分析浓度)。副本的负调控载体(溶剂)也应被应用。气态或易挥发的物质应用适当方法分析,比如在密封容器中(21)(22)。1.4.3.2.残存物质生存能力和突变频率的测量在接触时间结束时,细胞被洗涤和栽培后测定残留物,并进一步用来表征发生突变的有共同表现型的生物群。可通过决定相关细胞系培养的功效(残留物)或有关培养机制的总增重来测量细胞毒素。而这一过程,一般在处理后开始进行。为了让新增的突变个体得到最佳的共同表现型的生物群的表征,每个座位都应有最小时间的限定(HPRT和XP
14、RT至少天,TK至少两天)。细胞分别在加了有选择性和无选择性药剂的媒介中生长,以确定突变个体的个数和细胞体系培养的功效。在表征结束时可开始生存能力的测量(用于计算突变个体的数目)。其测量是通过在无选择媒质中栽培进行的。若测定物在L5178YTK+/-测定中为正反应,菌群应在正负参考物质情况下控制在至少一个测定载体大小(最高正反应浓度)。如果测定物质在L5178YTK+/-测定中为负反应,菌群大小受正负参考物质影响。在研究使用L5178YTK+/-时,菌群大小也受反应影响。2.实验数据2.1.实验结果处理实验数据应包括细胞毒性、生存能力测定、菌群数目、突变个体的数目,以供处理和调控载体。在L51
15、78YTK+/-测定中为正反应的情况下,菌群按其大小的判别标准标记。标记时应使菌群在至少单位浓度的测定物质(最高正反应浓度)和正负参考物质下进行。大小菌群突变个体的分子及细胞遗传性质都应被仔细研究()()。在L5178YTK+/-测定中,菌群按常速生长(大)及慢速生长(小)的判别标准标记()。受最广泛遗传损坏的突变细胞时间延长至两倍,因此形成小菌群。其损坏程度在丧失全部遗传因子和产生明显的染色体组基因突变之间。小菌群的诱导效应是与诱导全部染色体发生变异的化合物相联系的()。未发生严重变异的细胞像其亲代细胞一样在老鼠体内生长,并形成大的菌群。应给出残留量(相关细胞群培养功效)或相关的总生长情况。
16、突变频率表示为突变细胞在存活的细胞总数中的比率。单个细胞的数据也应当被提供。另外,所有实验数据都应按表格形式总结。无需确定明显的阳性反应,不确定的实验结果需改变测定条件后进一步明确。阴性结果需按情况讨论,在那样的情况下无需对阴性反应结果进行证实,但其理由应被证实。在实验结果不明确或出现负反应时,若要修改测定参数,则需通过做跟踪实验来确定。包括浓度间隔和新陈代谢活动情况在内的研究参数可被修改。2.2.实验结果评价与分析测定突变个体有许多标准,比如相关浓度的增长、突变个体数目的可繁殖增长。应首先确定结果之间的生物学关系。统计学方法可作为统计测定结果的辅助,但统计不仅仅在阳性反应方面有意义。不符合上
17、述标准的测定物质则被认为不能引起基因突变。虽然大多数研究可给出明确的阳性、阴性反应结果,但在极少数情况下,实验数据无法给出测定物活性的明确评价。无论重复多少次测定,仍会有些结果是不明确或存在疑问的。体内 哺乳动物细胞基因突变测定的正结果表明测定物质引起被培养动物细胞的基因突变。可重现的正浓度反应非常有意义。测定条件下,阴性反应表明被测定物质不引起被培养的动物细胞的基因突变。3.实验结果报告测定结果测定结果应包括以下信息:溶剂介质- 选择溶剂介质的理由;- 测定物质在溶剂赋形剂中的溶解度和稳定性,如果知道的话。细胞- 细胞的种类和来源;- 细胞载体的数目;- 细胞通过的数目,如果适合;- 维持载
18、体的方法,如果适合;- 不存在支原体。测试条件- 选择浓度和载体数目的理论基础,应包括在可获得情况下的生物毒性实验数据和浓度限制;- 媒质的构成,二氧化碳的浓度;- 测定物质的浓度;- 赋形剂和所加测定物质的体积;- 培养温度;- 培养时间;- 处理持续时间;- 处理时细胞密度;- 新城代谢活动系统的种类和组成,包括规律的可接受性;- 正负参考物质;- 表达时间(包括播种细胞数目),次培养菌和培养时间表,如果合适的话。- 选择的药剂;- 判断正、负反应的标准;- 计算可存活的基因突变细胞的方法;- 判断菌群大小和种类的比标准,(包括定义菌群“大”和“小”的标准,如果合适)。结果- 毒性迹象;-
19、 沉淀物迹象- 在接触于测定物质过程中的PH值和摩尔渗透压浓度,如果可以侧得;- 至少在正、负参考物质下示踪菌群的大小;- 在L5178YTK+/-系统中,实验室选择小突变菌群的adequacy,如果合适的话;- 在可能条件下反应反馈关系;- 在可能条件下的统计学分析;- 正、负(溶剂、赋形剂)协同参考物质的实验数据;- 正、负(溶剂、赋形剂)参考物质的历史实验数据及其范围;方法和标准偏差- 突变个体数目结果讨论结论4.参考文献Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury
20、 Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.Liber, H.L. and Thilly, W.G.
21、 (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, 467-485.Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, 394-403.Aaron, C.S.
22、and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121-128.Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation As
23、says Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures.Mutation Res., 312, 235-239.Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A repor
24、t from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, 225-251.Li, A.P., Gupta
25、, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res.
26、, 196, 17-36.Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., ONeill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase GeneMutation Assay. Mutation
27、Res., 189, 135-141.Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.Stankowski, L.F. Jr
28、., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedu
29、res for the L5178Y/TK+/- - TK+/-Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268.Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989)
30、. Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, pp. 66-101.Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanin
31、e-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31,347-364.Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, 61-108.Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mu
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