牛奶中抗生素残留及其检测.docx

1、牛奶中抗生素残留及其检测牛奶中抗生素残留及其检测徐州市畜禽水产品检测中心摘要:抗生素在畜牧业中广泛应用，这造成了牛奶中大量残留抗生素。本文论述了牛奶中残留抗生素的原因及其危害性，并列举了目前较为流行的牛奶中抗生素残留的检测方法，介绍了其检测原理。为了了解徐州市牛奶中抗生素的残留情况，随机抽取样品40份，分别采用TTC法和纸片法对样品进行抗生素残留的检测，以农业部2001年发布的无公害食品牛奶中“抗生素不得检出”为判断标准。调查结果显示徐州市牛奶中有部分牛奶存在抗生素的残留。关键词：牛奶，抗生素残留，国标TTC，微生物法Assay on Residue of Antibiotics in Mil

2、kAbstracts: Antibiotics are used in stockbreeding abroad, and It is the reason why there is residue of antibiotics in milk. The reason and hazard of antibiotics residue are discussed in this paper. Several kinds of popular antibiotics screening test are listed and their principle is introduce simult

3、aneously. In order to know the situation of antibiotics residue in milk from Xuzhou, we selected 40 samples at random. And detected the residue of antibiotics in milk by TTC and paper disc. Antibiotics should not be detected from milk according to the standard issued by the department of agriculture

4、 in 2001, but the test results showed that the residue of antibiotics in milk from Xuzhou is higher. Key words: milk, antibiotics residue, TTC, microbial test抗生素是治疗动物疾病的常用药物，并作为饲料成分被广泛使用。但抗生素容易在动物体内及其产品中残留，经过食用后进入人体，给人类的健康造成危害。目前人们对牛奶的消费量越来越大，牛奶中残留的抗生素会对饮用者的身体健康造成危害，也会对牛奶发酵过程的发酵剂产生抑制作用，从而使牛奶变质造成经济损失

5、。牛奶中抗生素残留的问题日益受到社会的重视。一牛奶中抗生素残留情况的简介1抗生素的种类介绍抗生素类是主要的兽药添加剂和兽药残留物质，约占药物添加剂的60%，在世界及我国的农产品或食品进出口贸易中，常需检测的抗生素残留主要有以下六类： 内酰胺类：内酰胺类抗生素主要用于抗革兰氏阳性细菌感染，也能有效抑制抗革兰氏阴性细菌。尽管仅有少数的这类化合物被用来治疗养殖动物疾病，然而这就有可能以残留物形成出现在食品中。尤其是青霉素G因为价廉广谱，而被广泛应用。因此对内酰胺类药物尤其是青霉素G残留的检测十分重要。这类抗生素主要包括青霉素、头孢霉素、头孢噻呋、阿莫西林等。磺胺类：磺胺类药物作为预防和治疗用药广泛用

6、于食用动物中。磺胺类药物的副作用有过敏反应，尿结石和造血紊乱。这类抗生素主要包括磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺嘧唑等。四环素类：主要用于食用动物和海洋动物的养殖。土霉素和金霉素被加入饲料以促进生长和预防疾病。这类抗生素主要包括四环素、金霉素、土霉素、强力霉素等。氨基糖苷类：氨基糖苷类抗生素主要用于治疗动物的各种感染，并以亚剂量给药方式预防疾病和提高饲料利用率。已经发现这类抗生素损害颅神经，引起失聪和损害肾脏，因此它们在食品中的残留引起关注。这类抗生素主要包括庆大霉素、新霉素、链霉素、二氢链霉素等。大环内酯类：这类抗生素治疗革兰氏阳性菌及李斯特菌和支原体的某些菌株效果较好。常用于

7、治疗动物的感染，牛的呼吸道疾病及治疗乳腺炎。这类抗生素主要包括红霉素、泰乐霉素、林可霉素等。氯霉素类：这类抗生素在治疗人的疾病时，会产生再生障碍性贫血、再生不良性贫血、粒性白血球减少、舌炎、口腔炎等副作用。因此已经被人类所禁用。农业部也于2002年将其列为禁用的18种兽药之一。这类抗生素主要包括氯霉素、甲砜（氯）霉素、氟砜尼可等。2牛奶中抗生素残留的来源随着畜牧业的发展，在奶牛的饲料中添加一定比例的抗生素已经十分普遍了，主要是预防疾病的发生，这也是牛奶中残留抗生素的主要来源。其次，对乳牛用药不当也是造成牛奶中抗生素残留的又一来源。特别是当使用乳房灌注法治疗奶牛的乳房炎时，容易造成牛奶中残留抗生

8、素。此外在高温季节，一些不法产奶户为了防止牛奶酸败，往往向牛奶中加入各种抗生素，这也是牛奶中抗生素残留的一个来源。经过调查表明：重用经过抗生素治疗的乳牛用过的挤乳器给正常乳牛挤乳，也可使正常牛的牛乳中残留抗生素，由此可见，挤乳是牛奶中抗生素残留的另一个来源。3牛奶中抗生素残留的危害虽然对食品中药物残留食用后是否会引起严重的后果仍有争议，但是目前可以肯定的是，饮用含抗生素残留的牛奶，会对人体造成伤害，尤其是那些长期饮用者。牛奶中含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，那些对抗生素过敏的人服用残留抗生素的牛奶后会发生过敏反应，如皮疹，过敏性休克等等，严重时甚至会危及生命。即使

9、是正常的饮用者也会破坏肠道内的菌群平衡，会使病菌，念珠菌大量增殖而导致局部或全身感染，并引起胃肠疾病和生理紊乱，使体内的某些致病菌产生耐药性，使该种抗生素失去对患者的治疗效果。而且抗生素具有一定的毒性，长期服用含抗生素的牛奶会对服用者的肝肾功能造成一定的伤害，严重的还会引起致癌、致畸、甚至致突变。从牛奶加工的角度看，抗生素残留会抑制发酵细菌的生长，影响牛奶的发酵。使得牛奶的产量和质量大幅度降低。而市场不允许出售含抗生素残留过量的牛奶又造成了牛奶生产者经济上的损失。4牛奶中抗生素的残留现状 我国过去对牛奶中抗生素残留的卫生指标没有明文规定，直到2001年10月农业部发布实施了无公害食品生鲜牛乳行

10、业标准，对生鲜牛乳的卫生指标定为“抗生素不得检出”。所以2001年以前我国市场上出售的生鲜牛奶抗生素残留情况还是比较严重的。王晓光（1992年）测得长春市市售鲜牛奶中抗生素残留阳性率为3.3%。葛华等（1996年）对西宁市市售各种乳制品进行了检测，检测结果抗生素残留阳性率为4.3%。张利琴（1999年），测得西宁市市售鲜奶中抗生素残留阳性率为2%。常建军（2000年）测得西宁市市售鲜奶中抗生素残留阳性率为5.3%。从已知道的信息看，即使是在2001年农业部发布实施了无公害食品生鲜牛乳行业标准之后，我国也并没有严格执行这一标准。马群飞等（2002年）对福建省生鲜牛乳抗生素残留进行测定，结果86件

11、生鲜乳样中共检出抗生素残留阳性17件，检出率高达17.8%。丁洁等（2004年）对南京市牛奶中的抗生素残留进行检测，结果南京市市售奶粉的抗生素残留阳性率为26.7%，消毒牛奶的抗生素残留阳性率为8.0%。从以上信息可以看出我国牛奶中抗生素残留状况十分令人担心，有关部门应该加强对牛奶生产的管理，有效检测和监控牛奶中的抗生素等药物的残留，保证人们饮用牛奶的卫生和安全。二检测方法简介根据WHO提供的数据，欧盟药典确定了食品中各种抗生素残留的最大限制(MRL)，MRL也就是欧盟药典认为食品中含有某种兽药残留的最大量。为了使原料乳和乳制品中的抗生素符合MRL的要求，奶牛厂和监督部门都在寻找准确可行的抗生

12、素检测方法。目前牛奶中抗生素残留的检测方法有很多，比较常用的是微生物法，如纸片法TTC法等。此外还有其他理化方法，主要包括:高效液相色谱法、色谱/质谱连用法、免疫法等等。纸片法，即PD（paper disc）法。根据所用菌种的不同，常用的纸片法可以分为枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片法。这两种方法主要是用来检测牛奶中的-内酰胺类抗生素。它们的操作过程基本相同只是所选的菌种不同。枯草杆菌纸片法的结果易出现假阳性，为了确定阳性物质是否是青霉素，要对加热后的乳样用青霉素酶处理，以灭活乳样中的青霉素，然后再进行检测。而嗜热脂肪杆菌纸片法不仅可以检测奶样中的-内酰胺类抗生素，并且可以确定样品中是否还存在

13、其他抑菌物质。因此，实践中嗜热脂肪杆菌纸片法在奶样检测中的应用比枯草杆菌纸片法更为广泛。国标TTC法，TTC即氯化三苯基四氮唑(tripheye tetrazolium chloride)，这是目前我国规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法(GB5409-85)。在牛乳中加入菌种，一般是嗜热链球菌，经过培养后加入TTC指示剂，观察颜色变化，从而确定牛奶中的抗生素残留情况。如果牛奶中含有抗生素残留则培养后菌种并不增殖，此时加入的TTC指示剂不发生还原显色状态；如果没有抗生素的残留则培养后菌种可以增殖，此时加入TTC指示剂则TTC被还原成红色。高效液相色谱法，高效液相色谱法是目前广泛应用的一种理化检

14、测方法，它引用了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快，效率高和操作自动化。高效液相色谱法测定牛奶中的药物残留都要经历样品处理（包括样品的提取，脱蛋白，离心，层析柱净化，衍生化等步骤），残留药物的分离和残留药物的检测。色谱/质谱联用法，色谱/质谱联用法由于实现了高效层析分离和检测联机，可以用电脑控制层析条件和数据处理。它的特异性，灵敏度和重复性都很好，并且可以一次同时完成同一样本中多种药物及其代谢物检测，对分析牛奶中青霉素类抗生素，质谱作为一种专一检测器已经获得了广泛的应用。免役法，目前药物残留免役分析技术主要分为两大类：一是相对独立的分析方法，即免役

15、测定法如RIA，ELISA，固相免役传感器等。二是将免役分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免役分析的高选择性作为理化测定中的净化手段，典型的方式为免役亲和色谱。牛奶中的抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题，应该重视和加强检测工作，并努力研究发展一些简单，快速的多残留分析技术，实现分析过程的自动化或智能化，以提高分析效率，降低成本，保证消费者的健康。本次实验是在徐州市兽医卫生监督所完成的，主要采用的是国标TTC法。三实验材料与方法材料新鲜牛奶:取自单位A，单位B，单位C，徐州周边地区的私人奶牛养殖户即单位D。随机抽取40份作为待检测样品。其中单位A 10份，单位B 10份，单位C 10份，

16、单位D 10份。菌种:嗜热乳酸链球菌，取自徐州绿建乳品公司。试剂:TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)，化学纯，购买自仪器水浴箱一个，温箱一个，高压锅一个，100温度计一个，蜡笔一只，试管架一个，灭菌10毫升吸管，灭菌1毫升吸管，灭菌15150mm试管。、实验方法国标TTC法（GB44789.27-84）1原理TTC即 氯化三苯基四氮唑(tripheye tetrazolium chloride)，这是目前我国规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法(GB5409-85)。在牛乳中加入菌种，一般是嗜热链球菌，经过培养后加入TTC指示剂，观察颜色变化，从而确定牛奶中的抗生素残留情况。如果牛奶中含有

17、抗生素残留则培养后菌种并不增殖，此时加入的TTC指示剂不发生还原显色状态；如果没有抗生素的残留则培养后菌种可以增殖，此时加入TTC指示剂则TTC被还原成红色。2牛奶样品的预处理:将生鲜牛乳在15条件下3500r/min离心10分钟，牛乳分层后停止离心。上层为脂肪，除去上层脂肪，下层脱脂乳保存备用。3菌液的准备:将单菌种(嗜热链球菌)移种，以脱脂乳为培养基，在361恒温培养箱中培养15小时后，再以灭菌脱脂乳1:1稀释后保存备用。4 TTC标准指示剂的配制 准确称量出标准品TTC 1克，倒入小烧杯中，然后加入24毫升蒸馏水。摇匀后转移到棕色瓶中，放入冰箱7左右保存，备用。临用前需要进行1：5的稀释

18、。5实验流程 取预处理后待检测的样品溶液9毫升，置于15150mm试管中，在80水浴中加热5分钟后冷却到37以下。(2)加入1:1稀释后备用的活性菌液1毫升，在361水浴中培养2小时。(3)将已配制的4%的TTC标准指示剂进行1：5稀释后，加入0.3毫升，36水浴中培养30分钟后观察颜色变化。(4)如果样品为阳性则再次在水浴中培养做第二次观察，每一份待检样品做两份。另外再做阴性和阳性对照各一份。阳性对照管用无抗生素的牛乳8毫升加抗生素、菌液和TTC。阴性对照管则用无抗生素的牛乳9毫升加菌液和TTC。 6判断方法准确培养30分钟后，观察结果。如果为阳性，再继续培养30分钟做第二次观察。在观察时要

19、迅速，避免因光照过久而产生干扰。如果牛乳中有抗生素存在，则在向待检样品中加入菌液培养时细菌不会增殖，此时由于加入的指示剂不被还原，所以不显示颜色变化。与此相反，如果没有抗生素存在，则加入的菌液就会立即进行增殖，TTC被还原而显示红色。简单的说若检测的样品溶液颜色没有变化即呈牛乳的原色时为阳性，而呈红色时为阴性。7显色状态标准判断 显 色 状 态判 断未显色者阳性微红色者可疑桃红色红色阴性TTC法测定各种抗生素的灵敏度为:青霉素4ppb，链霉素500ppb，庆大霉素400ppb，卡那霉素5000ppb。它具有费用低，易开展的优点，缺点是耗时长，要求操作人员需有一定的专业知识而且实验过程中菌液的准

20、备，水浴过程控制都要求严格遵守操作规程，否则会出现假阳性，以至出现检验结果的不稳定性。四实验结果本次实验结果显示，牛奶中抗生素残留情况不容乐观。在检测的40份新鲜牛奶样品中有3份抗生素药物残留检测呈阳性，阳性率为7.5%。此外可疑阳性样品为9份，占抽查总量的22.5%。徐州市对牛奶的市场监控较为严格，徐州市兽医卫生监督所定期对全市的乳制品加工厂进行取样检测，一旦发现牛奶质量没有达到国家标准，就立即停止其营业。在这种严格的管理体系下牛奶中的抗生素残留阳性率依然高达7.5%。2001年10月，农业部发布了无公害食品生鲜牛乳行业标准对生鲜牛乳的卫生指标定为“抗生素不得检出”。但是从本次实验结果来看，

21、我国目前并未能严格执行，由此直接导致了牛奶中的抗生素残留超标情况越来越严重。引起了人们对牛奶安全问题的担忧，并成为越来越受关注的热点。在四个抽样点随机抽取的40份样品中，有3份检测结果为阳性。其中单位A 1份，单位B 0份，单位C 0份，单位D 2份。可疑阳性共有9份，其中徐州市单位A 3份，单位B 2份，单位C 2份，单位D 2份。具体结果见下表:样品来源取样数量阳性率阳性数量可疑阳性国家食品标准单位A10份10%1份3份不得检出单位B10份0%0份2份不得检出单位C10份0%0份2份不得检出单位D10份20%2份2份不得检出对可疑阳性的9份样品进行重新测定结果如下:徐州单位A 3份可疑阳性

22、样品其中1份阳性2份阴性，单位B两份可疑阳性样品全部是阴性。单位C两份可疑阳性样品1份为阴性，另一份还是可疑阳性，单位D两份可疑阳性样品全部为阴性。具体结果如下:样品来源单位A单位B单位C单位D阴性数量2份2份1份2份阳性数量1份0份0份0份可疑阳性0份0份1份0份综合上面两次实验结果得出下面结果:总的抽查样品数目为40份，其中阳性样品数为4份(不包括单位C的一份可疑阳性)，阳性比例为10%，这个结果偏高。本实验是按照2001年农业部发布的实施的无公害食品的行业标准中牛奶的卫生要求: “牛奶中的抗生素不得检出”作为判定抗生素阳性的标准，所以阳性的检出率较高。五结果讨论本次实验结果显示：徐州市牛

23、奶中抗生素残留阳性率为10%，可疑阳性率为22.5%。这充分说明了徐州市乳制品市场还存在着很多的不足，规范市场，加强管理，已经迫在眉睫。从本次实验结果及其取样过程中所了解的信息可以知道，许多奶牛饲养人员，在奶牛的饲料中频繁加入各种抗生素，以起到预防和治疗奶牛疾病的效果，而一旦奶牛患乳房炎，饲养人员就会长期大剂量的使用青霉素，链霉素等抗生素，经过抗生素治疗后，牛乳中抗生素残留量会很高。根据有关的资料知道，抗生素的休药期为245天。即经过抗生素治疗的奶牛必须通过一定时间的休药期，最短的为2天，最长的为45天。经过休药期之后，奶牛所产的牛奶才可以出售，或作为乳制品加工的原料乳。乳品加工企业收购原料乳

24、时应该检测原料乳中是否含有抗生素残留，严禁将含有抗生素残留的牛奶作为原料乳进行加工生产。我国食品卫生法规定患乳房炎的奶牛在使用抗生素治疗后，五天内所产牛奶不得作为食品销售，但长期大量使用抗生素仅有五天的“弃奶期”是不够的，需要根据抗生素残留的检测情况适当的延长“弃奶期”，以确保提供“无抗奶”。本次实验抗生素残留阳性率偏高，说明我国目前对乳制品市场的监督不是很严格，牛奶生产加工存在一些问题。需要进一步加强市场管理，使人们真正喝上“无抗奶”。2001年国家农业部发布了无公害食品生鲜牛乳行业标准对生鲜牛乳的卫生指标定为“抗生素不得检出”。本次实验对市场上出售的牛奶的检验结果发现部分牛奶中含有抗生素的

25、残留。这表明市场上的一些企业在生产上尚存在不足，同时也表明应该提高原料奶的产品质量，严格执行行业标准，严禁出售和使用含有抗生素残留的牛奶。只有从源头上杜绝含有抗生素残留的牛奶，才能有效遏止含有抗生素残留的牛奶的出售。要杜绝含有抗生素残留的牛奶的出现，首先要减少抗生素在生病奶牛治疗上的应用，即要保证奶牛尽量少得病，奶牛出现疾病一般都与管理饲养不当有关，因此应当提高奶牛的饲养管理水平。为此，奶牛应当分阶段，分群体进行标准饲养，对奶牛的饲料应当合理搭配，科学使用，满足奶牛不同时期的营养要求，根据不同奶牛的不同状态以及不同的季节来调整对奶牛的管理和饲料的使用。其次要做好抗生素的药敏实验（尤其是针对乳房

26、炎的治疗），以提高抗生素用药的针对性和科学性，提高疗效。再次要做好抗生素的筛选工作，要尽量选择在奶牛体内残留时间短，治疗效果好的抗生素治疗奶牛的疾病，如果有条件的话最好使用中药治疗。目前对于抗生素的研究越来越深入，许多国家都达成了共识：凡是人类常用的抗生素，均不能作为畜禽饲料添加剂和用于预防疾病。现在已经筛选并生产了一批专供动物使用的抗生素，如准及酶素、螺旋酶素、黄酶素、硫肽酶素、马卡布酶素等。这些抗生素除了具有杀菌，抗寄生虫的作用外，还对动物生长有刺激作用，而且不影响人类的健康。奶牛厂，饲料加工厂和医疗部门使用添加剂和治疗奶牛疾病时，尽可能选用上述药物，以利于动物的本身生长和人类的健康。此外

27、还要成立专门的检测机构，定期对牛奶中抗生素残留进行检测。建立一套兽药残留监控体系，以法律的形式制定兽药的使用范围、剂量、休药期以及药物最高允许残留量及其检测标准，并制定违规相应的处罚手段，才能真正有效控制药物残留的发生。 目前所用的国标TTC法，具有经典，廉价优点的同时也存在有不少的缺点，主要有：菌量不易固定，不同的菌株以及菌株的不同的传代次数对检测的结果均有影响，所以不同的实验室所作的结果并不是完全一致的，其次是操作时间长，实验过程比较繁琐，而且国标TTC法的结果观察也不易标准化。另外对操作者要求有良好的专业知识和操作能力，否则易出现假阳性，造成实验结果的不准确。随着国际贸易的迅猛发展，国际

28、上采用的一系列有关抗生素残留的检测标准，将会很快进入我国市场，对我国的乳制品市场产生深远的影响。目前的国标TTC法远远不能达到当前国际上普遍应用的对于牛乳中残留抗生素检测标准的要求，这将会不利于我国乳品企业的发展。目前我国还没有形成一个关于生鲜牛乳中抗生素残留含量的国家卫生标准，仅仅有一个农业部制定的行业标准。基于人们的身体健康和乳品企业发展的需要，我国要制定一个抗生素安全浓度卫生标准，以填补我国生鲜牛乳中对抗生素含量规定的空白。而在检测方法中，适当的引进一些经过论证的并被国外广泛使用的检测方法作为国标TTC法的补充。这也是非常必要的。参考文献1、王春奕等，消毒鲜牛奶中抗生素残留的检测，中国兽

29、医科技，1996，26，31322、邓斌等，牛奶中抗生素残留及其检测方法研究进展，饲料广角，2002，24，19223、丁洁、陈晓蔚等，南京市牛奶中抗生素残留的现状分析，中国公共卫生，2004，20，6，6926924、扬爱君、牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法，食品安全与检测，2004，10，60615、吴国娟，沈红，张中文等，市售消毒纯牛奶中抗菌药物残留的检测，北京农学院学报，2002，17，2，33376、丁洁等，牛奶中抗生素残留三种检测方法的比较，实用预防医学，2004，11，4，8168177、陈昌建，牛奶中农药与抗生素残留的控制，中国奶牛，1999，2，54558、席磊等，牛奶中抗生素残留的原因分析与控制，郑州牧业工程高等专科学校学报，2003，23，1，1011039、丁洁等，牛奶中抗生素残留两种检测方法的论证和应用，中国卫生检验杂志，2004，14，5，63964010、马双青，消毒奶中抗生素残留的调查，中国奶牛，2001，6，474811、董志军等，动物性食品中兽药的残留分析，山东畜牧兽医，2004，增刊，16216412、马兆瑞等，乳和乳制品中残留抗生素的检测方法，中国乳品工业，2003，31，4，3738