质粒抽提原理.docx

1、质粒抽提原理为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液 I,50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA ，pH 8.0 ； 溶液 II，0.2 N NaOH / 1% SDS ；溶液 III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-CI溶液，是再自然不过的了。那么 50 mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后 的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎

2、没有任何影 响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在 分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无 非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA ，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工， 只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕 DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的 TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或 LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌

3、体一定要悬浮均匀，不能有结块。轮到溶液II 了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2 %的SDS等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH稀释制备0.4 N的 NaOH ，无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了碱性。很多人不知道其实 破细胞的主要是碱 ，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会 几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4N NaOH ，即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试

4、一下） ，自然就难高效率抽提得到质粒。 如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒， 因为 SDS 也是碱性的， 只是弱了点而已。 很多人对 NaOH 的作用误以为是 为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一， 时间 不能过长，千万不要这时候去接电话， 因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合（象 对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明

5、。每个人都知道，溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当 SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往 1%的 SDS 溶液中加如 2 M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现， 显然与 SDS 的加入有关系。 如果在溶液 II 中不加 SDS 会怎样呢， 也会有少量的沉淀， 但量上要少得多， 显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。 既然 SDS 不是遇酸发生的沉淀， 那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1 的 SDS 溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS的沉淀。但如

6、果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠 （sodium dodecylsulfate ）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS ），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更 完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀 自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难

7、想象，因为 基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2 M的醋酸又 是为什么而加的呢？是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组 DNA 一旦发生断 裂，只要是 50100 kb 大小的片断，就没有办法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡， 不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA条带。很多人误认为 是溶液 III 加入后基因组 DNA 无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好 ,DNA 分子在中 性溶

8、液中都是溶解的。 NaOH 本来是为了溶解细胞而用的， DNA 分子的变性其实是个副产物， 与它是不是沉淀下来其实 没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS 沉淀更充分一点。不要以为 PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚 /氯仿/异戊醇进行 抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA ，不然时间一长就会因为混入的 DNase 而发生降解。 用 25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚( Phenol )对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该 用酚来最大程度将蛋白质抽提掉， 但

9、是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液(比如 4M的异硫氰酸胍)，离心 后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚 /氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应(比 如限制性酶切反应)，应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚 /氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇 的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。回收后的水相含有足够

10、多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA沉淀出来。 这时候如果放到-20C,时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的 DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此 DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70%的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用 tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含 RNase (50 ug/ml )的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的 RNA会干扰电泳结果的。琼 脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你

11、看到的是超螺旋、线性和开环这三条 带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性 质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得 较慢，远离这三条带，是20-100 kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。一、填空1质粒提取中细菌的裂解可采用多种方法，包括：非离子型或离子型去圬剂，有机溶剂，碱或加热处理。2用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到 0.8 X09细胞/ml时，即

12、可通过离心收集菌体。 收集菌体使用定 角转子，离心的速度以 8000r/min为宜。3.在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处： 可以扩增质粒DNA ;抑制了菌体的数量， 有利于裂解。4常使用的质粒纯化方法都利用了质粒 DNA相对较小和共价闭合环状两个性质。5由于不同构型的 DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 DNA ( SC)的泳动速度最快，一条链断裂的开环状质粒 DNA ( OC)泳动速度最慢，二条链断裂的线性DNA ( L)居中，通过凝胶电泳和 EB染色的方法可将不同构型的 DNA分别开来。6. 超离心法纯化质粒

13、DNA时，选用CsCl作介质的优点是：CsCl与不同DNA起反应；CsCl可以自动形 成密度梯度，从而使不同分子量的 DNA分子得以分开。7. SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂， 它有四个作用：溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂； 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对 RNase、Dnase有一定的抑制作用；SDS能够与蛋白 质结合形成R1-O-SO3-R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。10.溶液山中钾是 3mol/L，乙酸根是5mol/L11.LiCl可沉淀大量蛋白质和高分子 RNA。12.1OD260=50gg 质粒 DNA/ml。13. 在碱变形法提取质粒 DN

14、A实验中，聚乙二醇用于沉淀质粒 DNA。14.残留在DNA样品中的酚可抑制酶的活性。15.质粒DNA 提取中酚的pH值范围是 pH7.8pH8.0。16.乙醇沉淀核酸的沉淀混合液中常用的单价阳离子的类型有：乙酸铵、氯化钠和乙酸钠。17.SSCP电泳方式为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。18.SSCP是依据点突变引起单链 DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的。19.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。20.SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是：甲酰胺21. 点突变对SSCP检岀率的影响不仅仅取决于该点在 DNA链上的位置，更取决于该位置对维持立体构象 作用的大小。二、选择1.质粒提

15、取中溶液H的主要成分为： BA.SDS 和 EDTAB.SDS 和 NaOHC.EDTA 和 NaOHD.SDS和冰乙酸2 分离质粒DNA时，用蔗糖的目的是：BA.抑制核酸酶的活性B.保护DNA，防止断裂C.加速蛋白质变性D.有利于细胞破碎3.关于碱解法分离质粒 DNA，下面哪一种说法不正确？： DA.溶液I的作用是悬浮菌体B.溶液H的作用是使DNA变性C.溶液山的作用是使DNA复性D.质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性4.质粒DNA提取中酚的pH值范围：DA.pH6.5 pH7.0B.pH8.0 pH8.5C.pH6.8 pH7.0D.Ph7.8 pH8.05.CsCl-E

16、B密度梯度离心法纯化质粒 DNA的原理是：CA.氯化铯可以较多地插入到线状 DNA中去B.氯化铯可以较多地插入到 SC DNA中去C.EB可以较多地插入到线状 DNA中去D.EB可以较多地插入到 SC DNA中去6同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是： BA.OC DNASC DNAL DNAB.SC DNAL DNAOC DNAC.L DNAOC DNA.SC DNAD.SC DNAOC DNAL DNA7.用碱法分离质粒 DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为： CA.染色体DNA断成了碎片B.染色体DNA分子量大，而不能释放C.染色体变性后来不及复性D

17、.染色体未同蛋白质分开而沉淀& 1OD260相当于每毫升质粒 DNA : AA.50 ggB.100 ggC.50ngD.100ng9.加入溶液山后出现的白色絮状沉淀不包括： AA.质粒DNA和小分子量 RNAB.染色体DNA和高分子量 RNAC.钾离子和SDSD.蛋白质和细胞膜10.SSCP电泳方式为：DA.普通琼脂糖凝胶电泳B.低熔点琼脂糖凝胶电泳C.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳D.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳11. SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是： BA.EDTAB.甲酰胺C.溴酚兰D.Tris-HCI12.SSCP分离单链DNA片段是依据：BA.单链DNA分子量大小B.单链DNA片段空

18、间构象的立体位阻大小C.单链DNA带电量的大小D.单链DNA分子量和带电量的大小三、是非1迄今发现的质粒都是环状的。（错）2.质粒DNA提取时，溶液H需新鲜配置。（对）3如果溶菌酶溶液中pH值低于8.0,溶菌酶就不能有效发挥作用。（对）4碱法和煮沸法分离质粒 DNA的原理是不同的。（错）5. CsCI-EB密度梯度离心法纯化 SC DNA原理是根据EB可以较多地插入到 SC DNA中，因而沉降速度较 快。（错）6.酚法和碱法分离质粒 DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对）7氯霉素扩增DNA时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够，加入时间过迟，菌龄过老， 容易自溶

19、。（对）&碱法和煮沸法分离质粒 DNA的原理是不同的。（错）9.酚法和碱法分离质粒 DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对）10.SSCP对长链DNA或RNA的点突变检出率要比短链的高。（错）11.SSCP分析中非变性PAG电泳分离不能反映出分子量的大小。（对）12.SSCP可以检测出所有的单点突变。（错）13点突变对SSCP检出率的影响取决于该点在 DNA链上的位置，点突变在 DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来。（错）四、简答1 简述溶液I、H、山所包含成分及生化作用原理溶液I含葡萄糖和 EDTA ,葡萄糖能增加溶液的黏度， 防止DNA受机械作用而降解。EDTA

20、可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA的降解作用（Dnase作用时需要一定的金属离子作辅基），另外，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。溶液H含NaOH和SDS，核酸在pH大于5小于9的溶液中是稳定的，但当 pH大于12或小于3时，就会 引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液H中的 NaOH浓度为0.2N，加入抽提液液时，该系统的 pH就高达12.6，因而促使染色体 DNA与质粒的变性。SDS是离子型表面活性剂，它主要功能有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结合成为R1-

21、O-SO3-R2+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用Rnase去除RNA时）受到干扰。溶液山是NaAc-Hac的缓冲液（pH4.8）。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液pH调回中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的 3MnaAc有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。2小量制

22、备质粒 DNA时发现质粒DNA不能被限制酶所切割，分析可能原因及解决办法。由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去除干净导致。大多数情况下，用酚: 氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质，如果总是依然存在，可用离心柱纯化 DNA。3.溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的抱子对溶菌酶不敏感，应该如何处理？添加DTT、3-巯基乙醇，或8.0mol/L的尿素等增加敏感性。4.从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。方法是先用酚：氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。原理：使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除去核酸制品中残量酚。（此外，酚虽能有

23、效地使蛋白质变性，却不能完全抑制RNA酶的活性，它还能溶解带有长 poly （A）段的RNA分子。使用酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液可以使这两个问题迎刃而解，）5. 在用乙醇沉淀 DNA时，为什么一定要加 NaAc或NaCl至最终浓度达 0.1-0.25M?在pH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成 DNA钠盐沉淀。当加入的 盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成 DNA沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，

24、在沉淀的 DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。6.LiCI在质粒DNA提取中的作用是什么？沉淀大量蛋白质和高分子 RNA。7.简述PCR-SSCP基本过程。1） PCR扩增靶DNA ;2） 将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链 DNA分子；3） 将适量单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4） 最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果，若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断 DNA片段中有碱基突变。8 简述RNA-SSCP的基本原理。RNA有着更多精细的二

25、级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上。另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色。9. SSCP图谱一般是二条单链 DNA带，有时可能只呈现一条 SSDNA带或三条以上的原因是什么？主要是由于两条单链 DNA之间存在相似的立体构象，有时三条以上的 SSCP图谱是由于野型 DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。10. 分子量相同的超螺旋环状、带切口环状和线状 DNA在凝胶中迁移率大小顺序是什么？超螺旋环状DNA迁移最快，其次为线状 DNA，最慢为带切口环状 DNA。11.影响DNA迁移率的因素有哪些？影响

26、DNA迁移率的因素有：DNA分子的大小，琼脂糖浓度， DNA的构象，所加电压，温度，嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染 色体之外的自主复制的遗传 成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态， 但在一定条件下 也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制， 并通过细胞 分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子， 重要的条件是可获得大量纯 化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质 粒DNA的提取，本实验采 用碱裂解法

27、提取质粒 DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA勺方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。 例如，氯化铯 -溴化乙锭梯度平衡离心、离 子交换层析、凝胶过滤层析、聚 乙二醇分级沉淀等方法， 但这些方法相对昂贵或费时。 对于小量制备的质粒 DNA经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋 白质和RNA所得纯化的质粒DNA已可

28、满足细菌转化、DNA片段的分离和酶 切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室 中常用。 一、试剂准备1.溶液 I : 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCI(pH 8.0) ，10mM EDTA(pH 8.0。 1M Tris-HCl t1 (pH8.0 ) 12.5ml，0.5M EDT(pH 8.0 ) 10ml，葡萄糖 4.730g，力卩 ddH2O至 500ml。 在10 lbf/in2 高压灭菌15min，贮存于4C。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH ，因此用适当浓度的和适当 pH 值的 Tris-Cl 溶液。50 mM 葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆

29、菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质 粒的抽提本身而言， 几乎没有任何影响。 所以说溶液 I 中葡萄糖是可缺的。 EDTA 呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配 在分子生物学试剂中的主要作 用是：抑制 DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA ，无非就是 要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。 如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完 成质粒抽提，就不用怕 DNA 会迅速被降解，因为最终溶解 质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺

30、了溶液 I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你,只要用等体积的水，或 LB 培养基来悬浮菌体就可以了这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从 浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱 性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS所以 才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还 是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了 从bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了 不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解

31、大肠杆菌（不妨可以 自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提 得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对 NaOH的 作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一 些书上的有关DNA变性复 性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。 这一步要 记住两点：第一，时间不能过长，千 万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女 孩子一样），不然基因组 DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。3.溶液川：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml， 加ddH2O至500ml。4C保存备用。溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。 最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往 1%勺SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。 大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢， 也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋 白质。既