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1、选育纤维素酶生产菌的研究进展选育纤维素酶生产菌的研究进展作者：谢艳（湖南科技大学生物工程系，湖南 湘潭）摘要 纤维素酶是降解纤维素的高效生物催化剂，它的应用对人类意义重大。微生物发酵产生纤维素酶，成为获得纤维素酶最好的途径。在寻找和开发高产纤维素酶菌种的过程中，纤维素酶高产菌的选育是最关键的一步。综述了产纤维素酶的微生物菌种，介绍了获得高产纤维素酶能力的菌株的各种选育方法，并对其未来的研究趋势进行了展望。关键词 纤维素酶高产菌；选育Abstract: Cellulase，a kind of high active biocatalysts that could dissolve cellulo

2、se，its application is of great significance to humanityMicrobial fermentation is the best ways to obtain cellulaseIn the process to Identifying and developing ceIlulase high-yield strain，the selective breeding of cellulose high-yield strain is most essential one stepThis paper introduced the various

3、 breeding methods which can obtain high-yielding strains of cellulaseAt last，it look into the future of the research trendsKey words：cellulase high-yield strains；selective breeding目录1、 纤维素酶简介 11.1.1纤维素酶系组成、结构和性质 11.1.1.1 纤维素酶系的组成 11.1.1.2纤维素酶的分子结构 11.1.2纤维素酶来源 1 2纤维素酶的应用 22.1.1纤维素酶在畜牧业中的应用 22.1.2纤维素

4、酶在食品发酵工业中的应用 22.1.3纤维素酶在生产葡萄糖和单细胞蛋白(SCP)中的应用22.1.4纤维素酶在造纸工业中的应用 32.1.5纤维素酶在酒精生产上的应用 32.1.6纤维素酶在工业洗涤中的应用 32.1.7纤维素酶在其他领域的应用 43、选育纤维素酶高产菌的研究进展 43.1产纤维素酶的微生物 43.1.1真菌类 43.1.2细菌类 53.1.3放线菌 53.2纤维素高产菌的选育方法53.2.1自然选育 53.2.2诱变育种 63.2.3基因工程技术 74、结语 85、参考文献 81、 纤维素酶简介11.1纤维素酶系组成、结构和性质1.1.1.1 纤维素酶系的组成纤维素酶不是单成

5、分酶,而是能将纤维素降解为短链纤维素、纤维二糖和葡萄糖的一组复合水解酶系。总的来说,按照水解酶的作用不同,这一酶系包含以下三大类,分别是:内切葡聚糖苷酶、外切葡萄糖苷酶和纤维二糖酶。内切葡聚糖苷酶(endo-l,4-y9-D-glucanase, EC 3.2.1.4),又称Cx酶或CMC酶。来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Len。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区,能随机地在纤维素分子内部降解y9-l,4糖苷键,将长链纤维素分子截短,产生大量带有非还原末端的小分子纤维素。外切葡萄糖昔酶(exo-l,4-yS-D-glucanase, EC 3.2.1.9),来自真菌的简称CBH,来自细菌

6、的简称Cex。它能从线性纤维素分子的末端(还原或非还原端)水解;9-1,4糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子,故而又称为纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase)。纤维二糖酶C5-l,4-glucosidase,EC3 .2.1.21),又称葡萄糖苷酶,简称BG。它能把纤维二糖、纤维三糖水解成单个的葡萄糖分子。三种酶单一作用时,发现效果极差,迄今为止,未见有关单个酶组分能把纤维素分子降解成葡萄糖的报道。三种酶各有其专一性,相互之间的协同作用在水解过程中起了重要作用,通过互相协调才能最终将纤维素分子分解为葡萄糖。1.1.1.2纤维素酶的分子结构 在一级结构和三维结构的研究中人们发现,纤维

7、素酶分子普遍具有类似的结构,全酶分子呈蝌蚪状,由具有独立活性的两个结构域和连结序列构成。由球状的催化结构域(Catalytic domains, CD)、连接桥(linker)和纤维素结合结构域(Cellulose-binding domains,CBD)三部分组成。 (1) 纤维素结合结构域:它对酶的催化活力是非必需的,但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用,(2) 高度糖基化的连接桥:纤维素酶的连接区大多富含Gly, Ser, Thr。连接桥的作用可能是保持CD和CBD之间的距离,也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体。1.1.2纤维素酶来源自然界中,能够产生纤维素酶的

8、生物很多,其中动物包括原生动物、节肢动物、软体动物以及昆虫等。此外,很多食草动物的瘤胃中有共生的纤维素分解菌和原生动物。高等植物中也含有使细胞壁松弛,促进种子发芽和细胞生长的纤维素酶。在微生物方面,种类繁多,包括细菌、真菌和放线菌等。细菌只有少数能分泌外切葡聚糖酶,这些酶主要是存在于胞内或是吸附于细胞壁上,很少能分泌到细胞外,增加了提取的难度,在工业上很少采用。放线菌中的分枝杆菌和原放线菌几乎不产纤维素酶或产量极低,产量稍高的主要是黑红旋丝放线菌(Actinomyces melanocyclus)玫瑰色放线菌（Actinomyces roseodiastaticus）和纤维放线菌(Actino

9、myces cellulosae)。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌,因其产生的纤维素酶多为胞外酶,分离提取的工艺也相对简单。研究较多的有木霉属(Trichodema sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、青霉属(Penicimum sp.)和枝顶孢霉属（Acremonium sp.)的菌株。其中尤以木霉属的产量居高,里氏木霉(Trichoderma reesei).康氏木霉(Trichoderma koningii)和绿色木霉(Trichoderma viride)等都是木霉属中酶活性较高的菌种,特别是绿色木霉(Trichoderma viride)及其近缘的菌株。目前

10、己利用来源于绿色木霉、黑曲霉(Aspergillius niger)和斜臣卜青霄(Penicillium decumbens)等纤维素酶制成酶制剂。2纤维素酶的应用2.1.1纤维素酶在畜牧业中的应用常见的畜禽饲料如谷物、豆类、麦类及加工副产品等都含有大量的维素。除了反当动物借助瘤胃微生物可以利用一部分外,其它动物如猪、鸡等单胃动物则不能利用纤维素。近年来,国内外应用真菌纤维素酶作为提高畜禽生产性能和饲料利用率的重要措施之一。在饲料中添加纤维素酶,可以补充动物内源酶的不足,激活内源酶,消除抗营养因子,促进内源酶扩散,增加养分消化吸收,非淀粉多糖(NSP)部分溶于水产生粘性,增加动物胃肠内容物的戮

11、度,提高饲料吸收率。另外还可以提高动物细胞免疫力,改善动物消化道微生物环境。2.1.2纤维素酶在食品发酵工业中的应用食品发酵工业是纤维素酶应用广泛的另一个部门。纤维素酶犹如植物细胞壁粉碎机,利用纤维素酶处理原料,可改变细胞壁的通透性,提高细胞内含物(如蛋白质、淀粉、油脂、糖等)的提取率,改善食品质量,简化生产工艺;用纤维素酶处理大豆,可促使脱皮,增加从大豆提取蛋白质的得率,亦可回收豆渣中的蛋白质和油脂;用于淀粉制造,可缩短时间,增加得率;用于柑桔果汁加工,可促进汁液的提取和澄清;用于无囊橘子罐头加工,可促进橘子脱囊衣;用于酱油的酿造,可改善酱油质量,缩短生产周期,提高产量;用于酿造工业,可提高

12、出酒率;用于速溶茶生产,可缩短有效成分的抽提时间,提高速溶茶品位,又可提高其得率。近年来研究得最多的是一葡萄糖昔酶在食品的风味方面的应用。主要是由于-葡萄糖昔酶能水解某些低pH食品如果酒、果汁中的风味物质的糖昔化合物并释放出这些风味物质,从而增强了这些食品的风味,尤其是黑曲霉,因为它的无毒而受到工业界的青睐。似Conzalez一Candelas L等将黑曲霉中编码一葡萄糖昔酶的基因转到用于酿造葡萄酒的酵母中,发现重组酵母表达了一葡萄糖昔酶,生产出来的白葡萄酒中的风味物质白葵芦醇及其衍生物的量大大提高,因而提高了葡萄酒的香味。2.1.3纤维素酶在生产葡萄糖和单细胞蛋白(SCP)中的应用农副产品和

13、城市废料中的纤维素,通过纤维素酶转化为葡萄糖和单细胞蛋白,对人类有着十分重要的意义。美国NatiR研究所的Mandel:等人利用雷氏木霉的培养滤液作用于纸浆,球磨新闻纸,日本的外山信男等人使用商品酶制剂作用于经前处理(去除木质素)的稻草粉和新闻纸粉末,所得10%和9%的糖液可作为发酵工业的原料来生产酒精、SCP等发酵产品。利用纤维素酶发酵生产单细胞蛋白主要有两种方法:一种是先将纤维素经酶搪化后再培养酵母等微生物生产SCP;另一种是直接利用某些纤维素分解菌混合发酵生产SCP,如利用纤维单细胞菌,可直接由纸厂纤维废料发酵生产单细胞蛋白。2.1.4纤维素酶在造纸工业中的应用以纤维素酶为代表的酶法脱墨

14、(enzymatic deinking)是二十世纪九十年代发展起来的一种新型脱墨方法,也是近年来脱墨化学研究的热点。Prasad等人利用纤维素酶和半纤维素酶对新闻废纸进行了脱墨研究,纤维素酶和半纤维素酶可有效地脱除废新闻纸的油墨,酶脱墨浆的光学性能和强度性能都优于对照浆。Franks等人利用一种碱性纤维素酶对含有非接触印刷废纸进行脱墨研究,结果表明,相对低的酶用量可以取得最好脱墨效果。郝军芳、王高升等人研究表明,纤维素酶比半纤维素酶具有更好的脱墨效果。2.1.5纤维素酶在酒精生产上的应用以纤维废料为原料生产酒精的研究近年来异常活跃。往汽油里添加酒精作为燃料始于第一次世界大战,到1921年德国的

15、混合酒精生产量己达到21000吨,但五十年代初期由于大量便宜石油的出现而停止了生产1141。七十年代中期发生石油危机以来,人们又开始关注生物酒精燃料,使其发展得到了大大的加强。美国能源部1979年以1.5亿美元的预算用于生物质能的生产研究,在中西部设置了四个实验厂,用纤维素废物生产燃料酒精1习。1980年2月,由美国能源部和国家科学基金会在纽约主持召开了“燃料和化学物发酵生物学展望”学术讨论会,会议报告中阐述了纤维素资源的开发利用和生产乙醉的问题l6。1999年12月,美国能源部再一次颁布了关于实施“生物质转化酒精”项目的计划。日本通产省从1980年起制定了生物质燃料化的七年研究开发计划,并设

16、置了生物质研究委员会。经费预算总额为260亿日元,其中技术开发费用达124亿日元。日本工业技术研究院微生物工业研究所从1979年起,开始进行稻草、废木材能源化的研究,目的是降低成本、进行工业化生产,至今酒精发酵技术已基本完善。英、法、印度等国也都在计划生产燃料酒精。1998年12月,美国露易丝安纳州的一家名为国际生物燃料的公司,宣布他们将利用申报了的专利技术,以纤维素为原料大规模生产酒精,预计年产量为2500万吨。综上所述,在国外,以纤维素为原料生产酒精逐步走向一个技术成熟的阶段。在我国,以纤维素为原料生产酒精的工艺条件的研究还不成熟。虽然中国科学院早在1980年在广州就召开了“全国纤维素化学

17、学术会议”,把开发利用纤维素资源做为动力燃料提到议事日程上来,但是到目前为.止,仍没有取得重大突破,天然纤维素转化为酒精的新型开发技术在工业上尚未大规模实施,其工艺技术的改进和基础理论的研究仍在进行之中。因此在我国,以纤维素废物为原料生产酒精仍需进一步的深入研究。2.1.6纤维素酶在工业洗涤中的应用1985年,采用腐殖根霉(Hulnicolainsolens)发酵的方法,制得了世界上第1个洗涤剂用的纤维素酶,其产品命名为Cellulase。1987年又推出了一种细菌纤维素酶,并成功地用于Attack洗衣粉。从此,纤维素酶也就正式加入了洗涤剂酶的行列。2.1.7纤维素酶在其他领域的应用(l)环保

18、在工业、农业和生活废料中,纤维素含量占相当大的比重,尤其在造纸、食品工业中会产生大量的纤维废渣。这些废料经理化处理后易于酶解,利用纤维素酶处理这些废料可防治污染又可生产有用的工业产品。(2)中草药提取中草药中的有效成分主要是存在于细胞中的某些生化物质。由于细胞壁的存在阻碍了这些有效成分的释出,因此必需采取适当的提取工艺,使细胞壁破碎,从而使有效成分释放出来。例如用纤维素酶从麻黄草中提取麻黄碱。由于纤维素酶可降解细胞壁,因此麻黄碱提取可在常温常压下进行,这与工业上采用的高温、高压、水浸的传统工艺相比,具有降低设备投资、节约能源、提高麻黄碱的提取率等特点,经济效益显著;用纤维素酶处理人参,可以大大

19、提高人参中的有效成分皂贰萃取量。试验表明,在pH4.5,50条件下保温48h对人参进行提取,随着酶加入量的增加,皂贰浸出量也增加,当酶加入量为100活力单位时,皂贰浸出量可增加9.7%;当酶加入量为200活力单位时,皂贰浸出量增加37.9%。(3)在植物遗传工程中的应用由于纤维素酶和半纤维素酶及果胶酶可以分解植物细胞壁,因此可利用纤维素酶制备植物细胞原生质体。上世纪60年代初即有人开始采用酶法分离原生质体,并获得成功。目前纤维素酶己广泛地应用于植物遗传工程领域,且与机械法相比有产量高及分离效果好等优点。现在纤维素酶应用已扩展到医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水

20、处理及饲料等各个领域,尤其在美、日等国家,其应用前景十分广阔11231。专家预测纤维素酶的研究开发是新世纪可再生性资源利用的关键。纤维素的生物转化对于解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有重要意义。3、选育纤维素酶高产菌的研究进展3.1产纤维素酶的微生物纤维素是世界上非常丰富的有机资源，其生物降解完全是由微生物(细菌、放线菌、真菌)和一些原生动物等来完成的。细菌类包括纤维黏菌属、纤维杆菌属和芽孢杆菌属等；放线菌包括链霉属、高温放线菌属和弯曲热单胞菌等；真菌类包括木霉属、曲霉属、青霉属、漆斑霉属、孢霉属等。3.1.1真菌类真菌通过分泌到胞外的游离纤维素酶，以水解酶机制和氧化酶机制来降解纤

21、维素；目前国内外研究较多的纤维素酶产生菌是木霉属、曲霉属、青霉属、漆斑霉属、孢霉属等丝状真菌，这些微生物能产生大量的纤维索酶，已先后选育出了一些产纤维素酶的优良菌种。并且这些丝状真菌具有产酶的诸多优点：产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；产酶效率高，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。从纤维素酶的工业化制备及其应用角度看，研究和采用丝状真菌产酶具有更大的意义。目前主要还是利用真菌来发酵产纤维素酶，世界纤维素市场中的纤维素酶有20来自木霉属和曲霉属。从目前研究进展来看，里氏木霉同时具有较为稳定性状、优质高产纤维素酶的能力和较好“抗代谢阻遏”能力，

22、被认为是最具有工业应用价值的菌株。另外，绿色木霉和黑曲霉被公认是产纤维素酶最稳定和无毒安全的菌种。康氏木霉和拟康氏木霉也是目前较好的纤维素酶生产菌。3.1.2细菌类细菌类微生物由于分泌的纤维素酶活性较低且胞外分泌型较少，而是处于细胞壁固定化状态，可在细胞壁上形成一种突起物。细菌纤维酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上方能起作用，使用很不方便，酶的提取也较困难，故很少用它们作为纤维素酶的生产菌种。但是近年来通过研究发现，细菌主要生产的中性纤维素酶和碱性纤维素酶在洗涤剂丁业和纺织丁业中有良好的应用性能和巨大的经济价值，因而备受青睐。这类细菌纤维素高产菌是目前的研究热点嘲，其主要集中在芽孢

23、杆菌属。胡爽等人从青贮饲料中分离筛选产纤维素酶细菌，用刚果红染色法和CMC酶活力测定法，对分离所得的细菌进行筛选。结果得到l株产纤维素酶能力较强的菌株WS一6，对该菌进行形态学观察、生理生化鉴定和16SrDNA序列测定，鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)，结论为：该菌最适生长pH值为5070，温度为35，产CMC酶活力达255 UmLl6；另外，筛选的耐高温、耐低温、嗜热等极端细菌纤维素酶高产菌也正在开发应用中。曲小爽等人利用海南热泉附近腐烂朽木及土壤，筛选分离到1株具有较高纤维素酶活性的纤维素分解菌，经生理生化特性及遗传分析，初步鉴定其为环状芽孢杆菌属菌株，该

24、菌株在温度为55，pH值6的条件下生长较好。1996年，Bergquist克隆的栖热菌耐热纤维素酶的耐热温度为70。1997年，美国RBI公司开发的103酶的耐热温度为100。3.1.3放线菌放线菌是介于细菌和真菌的一类微生物，在自然界分布很广，绝大多数为异生需氧菌。大多数为腐生、少数寄生、产生种类多的抗生素，生长最适温度为2832，大多是非致病菌，有的种类可在高温下分解纤维素等复杂的有机质。常见的町降解纤维的放线菌有以下种类：链霉属、高温放线菌属和弯曲热单胞菌等。目前对放线菌降解纤维素的研究较少，但由于细菌分泌酶的量少，且为内切酶，多数不分泌到胞外，工业应用价值不大，真菌中的霉菌因其致病菌较

25、多,其孢子易于传播和感染等，这螳原因限制了对细菌和霉菌的进一步开发应用。然而放线菌具有产生的纤维素酶活性较高，且其结构简单、为单细胞，便于遗传分析等优点，逐步进入人们的视野，引起了研究者的广泛关注和兴趣，开始重视对放线菌的选育研究。叶姜瑜从田土中分离到纤维酶活性较高的放线菌菌株。周新萍等人从朽木中分离到l株产纤维酶活力高的放线菌NC一7菌株经形态观察和生理生化测定，初步鉴定为放线蒲，链霉菌属。3.2纤维素高产菌的选育方法3.2.1自然选育菌种的选育是纤维索酶生产的基础性工作，为了生产高质量的纤维素酶产品，许多专家进行了大量研究。尹磋利用纤维素为唯一碳源的选择性培养基，通过平板分离法，从造纸废水

26、处理池中分离出l株产纤维素酶菌株，经菌落及菌的形态观察，生理生化实验和16SrDNA鉴定，判断其为1株荧光假单胞菌，被命名为Pseudomonas fluorescens spstrainYL，通过对其生长曲线和产酶动力学的研究发现，对数期比生长速率约为0125 h一。纤维素酶的产生与细菌的生长紧密相关联，该菌在摇瓶培养中以微品纤维素为唯一碳源时，粗酶液的最高CMC酶活出现在培养78 h，达到17。12 UmL”。潘建梅通过刚果红染色鉴定和液体发酵法，从连云港郊区采集的腐烂苹果、橘子、葡萄、枣、红薯、树根等样品中分离筛选出l株产纤维素酶高的细菌。摇瓶产酶试验结果表明，该菌株在培养摹初始pH值8

27、0，温度35，培养30 h的产纤维素酶活力最高，达70 UmL。韩立荣，张双玺等人采用纤维素刚果红平板培养基，对采自陕西秦岭山区的七样和腐烂枝干进行初筛，再以川楝残渣为唯一碳源进行摇瓶培养复筛。最后对获得的高纤维素酶活力菌株进行形态学和分子生物学鉴定，得到4株纤维素酶活性较高的菌株，分别为枝状枝孢菌、萨氏曲霉菌、瓦克青霉菌和小不整球壳属，从而为植物源农药残渣的资源化利及其他废弃有机物的合理利用提供了依据。张秋卓经纤维素刚果红平板初筛及摇瓶发酵复筛，从菜地、腐烂的树根及朽木周围的土壤中筛选出l株高产纤维素酶真菌ZM一4，经鉴定为里氏木霉。以稻草与麸皮质量比3：1为碳源、硫酸铵为氮源，用ZM一4在

28、初始pH值45，温度30，转速200 rmin摇床中降解稻草96 h，产还原糖量达1842 sL，羧甲基纤维素酶活及滤纸酶活分别达5307UmL，974 UmLtl31。3.2.2诱变育种自然选育是利用菌种的自发突而选育出优良菌种的。自发突变的频率较低，出现优良性状的可能性较小，需坚持相当长的时间才能收到效果，并且选育出来的野生菌种大多产酶量少，且活性较低。而诱变育种则是得到高产菌株的一种简单有效的方法，能够大幅度改变菌种的遗传特性，从而获得高产突变菌株，具有方法简单、快速、收效显著等特点。为得到纤维素酶活力较高的菌株，诱变育种是获取优良菌株的重要方法之一，在实际中应用广泛。诱变育种的方法包括

29、物理诱变、化学诱变和物理化学复合诱变。物理诱变是指用紫外线、吨。一1射线、特定电磁波幅射和线性加速器等手段处理原始菌株而使其产生诱变。化学诱变是用一些化学试剂对菌株进行作用的一种诱变方法，这些化学试剂主要有硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)、氯化锂(“C1)和亚硝酸盐等。鲁东大学的冯如勇等人以l株黑曲霉(Aspergillus nigerFl)为出发菌株，经过亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯(DES)和氯化锂(LiCl)诱变处理，选育出l株纤维素酶高产菌株L1，在适宜条件下，其产CMC酶活是出发菌株的1 5021151。物理化学复合诱变即是物理诱变和化学诱变结合交替处理菌株，以求获得高产菌

30、株。目前采取单一的方法来进行诱变的较少，大部分应用多种诱变技术相结合进行复合诱变。侯红萍等人以产纤维素酶的黑曲霉菌株D2为出发菌，进行了微波一亚硝基胍复合诱变，筛选到了遗传性状稳定的高产纤维素酶的突变菌株N14，在最佳的产酶条件下，此菌株的滤纸酶活最高，达到3653 UmL，是出发菌酶活的3，5倍”61。李素波首先对酶活高的菌株康氏木霉(Trichodema koningii，34261)进行亚硝酸、紫外线和硫酸二乙酯复合诱变，然后通过羧甲基纤维素钠培养基、刚果红纤维素培养基进行初筛和液态发酵复筛，得到2株酶活较高的菌株，命名为E202和E404，对相对活性更高的E202进行发酵条件优化，其最

31、适条件为：麸皮与麦秸杆的质量比为3：7，固液比为l：(4一113)，发酵时间5d，初始pH值60，Tween一80质量分数为0。10，培养温度28，其CMCase和FPA最高分别可达654 ug和69 us，分别较出发菌株提高230和72旧。3.2.3基因工程技术纤维素酶基因工程工作起始于20世纪70年代末几十年来发展迅猛，自1982年Whittle等人首次报道Cellulomonas mi的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌与真菌中发现分离纤维素酶系。据报道，到目前为止已有近100多个纤维素酶及木聚糖酶基因都可在大肠杆菌中克隆和表达，主要是内切葡聚糖酶和B一葡萄糖糖酶。这些工作为我们了解纤维素酶基因的遗传背景，进而构建高活性的菌株奠定了良好的基础。通过基因工程手段，可以快速、定向地改造发酵菌株，表达出我们需要