神经医学常用抗原修复方法汇总分析解析.docx

1、神经医学常用抗原修复方法汇总分析解析抗原修复大全组织在福尔马林或其它固定液中固定会引起位于蛋白内或蛋白间的亚甲基桥的桥连，引起许多抗原决定簇被封闭。如在组织切片前未进行某种形式的抗原修复，免疫染色结果将不能令人满意甚至不能成功。最常用的抗原修复技术是酶消化和热引导的抗原决定簇的修复(heatinduced epitope retrieval,HIER)，但其它技术，如声波处理抗原修复技术也在某些实验室应用。有些抗体则适宜于几种抗原修复技术的联合使用，如酶消化加HIER可使anti-calponin抗体的染色效果最佳。有关抗原修复的基本要素如下：1足够的抗原修复是影响免疫组化染色结果最重要的因素

2、，总的说来，较检测系统更为重要。2尽管某种形式的抗原修复对大多数抗体有益，但有些抗体经抗原修复后不再发生反应(例如某些不需要抗原修复的抗体)。3主要的抗原修复形式包括：。酶处理，如：胰蛋白酶、胃蛋白酶、pronase。热引导的抗原决定簇修复，使用湿热。HIER对大多数的抗体有益，特别是核抗原(对它们来说，HIER可能是抗体工作的前提条件，如Ki-67、雌激素)。4某些抗体适宜于几种抗原修复方法联合使用，如anticalponin抗体经酶处理及HIER联合修复后抗体工作效果最佳。5抗某一抗原的不同抗体可能需要不同的抗原修复方式，如有些抗CD21的抗体可能需要酶消化，而另一些则需要HIER。6使用

3、HIER时，要注意两个基本点：。抗体孵育前每一步操作均勿使组织干燥，否则免疫反应可能完全不能进行。加热后放置足够的时间(至少1020 min)使之变凉是必需的，可假设为允许蛋白恢复到它的自然结构，否则HIER将无任何效果。目前常见的抗原修复液，如：枸橼酸缓冲液、尿素、EDTA、Tris-HCl、氯化铵和商品化靶修复液。作者选择压力锅HIER方法，结果表明在pH8.0 1 mmol/L EDTA溶液中修复的效果最佳，特别是与常用的枸橼酸缓冲液(pH6.0)比较。有人认为EDTA-HIER的作用机制是通过钙离子的鳌合而实现的，而且这种鳌合作用只有在碱性pH值下才起作用(注意：枸橼酸缓冲液作用似乎也

4、是通过钙离子的鳌合而实现的，并且也是在高pH值下工作的效果最好)。形成于hydromethylene、羧基及磷酸基团间的钙离子配体复合物通过空间排列的障碍作用，封闭了抗原决定簇的位点。因此去除了钙离子即打碎了混合物。然而，对于酸性的抗原修复液，如Tris-HCl，抗原修复似乎是通过高浓度的氢离子离解了钙离子复合物或打断了福尔马林固定产生的交联而实现的。如果一个实验室想将枸橼酸缓冲液换为EDTA溶液作为抗原修复因子，大多数抗体的稀释度将被提高，这就是说，每个抗体的稀释度将要重新估测。这样不仅可以节省抗体，而且可使免疫染色更加稳定。pH值(碱性范围)非常重要，因为对有效的抗原修复来说，pH值似乎比

5、抗原修复液的化学成分更为重要。对大多数抗体，抗原修复液全范围pH值均使HIER进行有效的修复，而对某些抗体，(如：Ki-67、ER)，中间范围的pH值(3.06.0)会降低染色的强度，高于或低于此临界带均使染色强度增强。极少数抗体(CD34、HMB45)，用HIER时，在低pH值(1.02.0)下染色效果不好，在高pH值下的染色效果极佳。因此，尽管pH值6.0的枸橼酸缓冲液可使大多数抗体良好地工作，但不可能总是工作良好。作为通用的修复液，碱性pH值的修复液远较枸橼酸缓冲液有效，而固定了很长时间或是非常旧的档案资料，酸性pH值的抗原修复液的工作效果优于碱性pH值的修复液(包括EDTA)，因此在通

6、用抗原修复液不能进行免疫染色或染色效果不佳时，酸性抗原修复液可作为替代物。(湖北省十堰东风汽车公司中心医院病理科李金范摘译自John KC Chan刊登在Advances in Anatomic Pathol上的文章)抗原修复方法 抗原修复方法，大家共享。Proteolytic antigen retrieval using Trypsin Reagents:Calcium Chloride 0.1gTrypsin (Sigma Type II) 0.1gDistilled Water 100 mlSodium Hydroxide (0.1 M)Method:1.Dissolve calciu

7、m chloride in distilled water and pH to 7.8 with sodium hydroxide. Store at 37oC.2. Dissolve trypsin in calcium chloride solution.3. Place sections in Trypsin solution at 37oC and incubate for pre-determined optimum time (approximately 20-30 minutes).4. Wash in TBS and proceed with staining.Proteoly

8、tic antigen retrieval using pronaseReagents:Calcium Chloride 0.1gPronase 0.1gDistilled Water 100 mlSodium Hydroxide (0.1 M)Method:1. Dissolve calcium chloride in distilled water.2. Dissolve pronase in calcium chloride solution and pH to 7.8 with sodium hydroxide.3. Place sections in pronase solution

9、 at room temperature and incubate for pre-determined optimum time (approximately 10 minutes).4. Wash in TBS and proceed with stainingHeat mediated antigen retrievalHeat mediated antigen retrieval may be used in many cases to enable staining of certain antigens in paraffin embedded tissue sections, o

10、r in some cases to improve results when staining is weak or inconsistent. A number of buffers may be used for this purpose. The choice of buffer should be as recommended on product specific datasheets, or determined experimentally by the customer. Serotec offer a range of pre-prepared antigen retrie

11、val buffers, or alternatively customers may prefer to prepare their own buffers using the recipes provided below.Reagents Antigen retrieval bufferMethod: 1. Place slides in suitable container of prepared buffer, cover with cling-film (vented) and heat to 90oC (Please note buffer must boil). Keep at

12、this temperature for 10 minutes2. Let sections stand for 15 minutes to cool.3. Wash in TBS/tween and proceed with staining.Note: Actual heating times may vary depending on the antibody being used and the fixation processes that have been utilised.Solutions used: TBS (Tris buffered saline) (stock sol

13、ution x10 concentrated) Sodium chloride 87.66 gTris 60.55 gDistilled water 1 litreAdjust pH to 7.4 using concentrated HCl.TBS/Tween Working strength TBS1 litreTween 200.5 ml0.01M Citrate buffer for antigen retrievalAnhydrous citric acid 3.84 gDistilled water 1800 mlAdjust pH to 6.0 using concentrate

14、d NaOH.Make up to 2 litres with distilled water0.001M EDTA buffer for antigen retrievalEDTA 0.37 gDistilled water 1000 mlAdjust pH to 8.0 with 1 M NaOH抗原修复：在进行石蜡切片标本或回顾性研究时，一般均用甲醛固定。由于部分抗原在甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。内源性酶处理：粒细胞，巨噬细胞等存在内源性过氧化物酶，能够与DNA-H2O2反应，导致假阳性，

15、所以含此类细胞丰富的肝脏、脾脏、骨髓等组织在进行免疫组织化学时，最好做内源性酶阻断。因此，这两者没有前后顺序，但必须在加一抗前完成。其实很多时候不需阻断，也能使阳性片做的很好，主要是因为你做的组织细胞中内源性酶本身就比较少，因此不需阻断3H2O2是在脱蜡水化后用的，灭活内源性过氧化物酶，然后才是抗原修复抗原修复液配方：EDTA 0.186 g蒸馏水 500 mlpH 9.09.5 (一般根据实际情况确定）抗原修复液配方：柠檬酸钠 0.51g柠檬酸 0.095g一蒸水 250mlTris 30.27g EDTA（乙二胺四乙酸）1.461g 蒸馏水 定容至500ml用前稀释10倍4.抗原修复液必须

16、遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的。 抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其慢慢地降温，决不能为了争取时间，强行用冰块或冷水令其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。如果用冰块和冷水强行令其降温，松开后的蛋白分子肽链突遇降温而固定下来，恢复不了原有的构型，达不到预想的效果。抗原修复组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新

17、暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。 在免疫组化染色后的镜下观察中，有发现这样的结果，阳性物反应不强，时隐时现，表达不均匀，有时可出现假阴性，这是因为： 1.组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封闭抗原的决定族。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键8。这也是甲醛的一个作用，因为它是一种聚合固定剂，因而能在相邻的蛋白质键间形成桥键的作用。 2. 甲醛在保存进程中会形成羟甲基，也可封闭抗原决定族。据French和Edsall的研究认为，最常遇到的甲醇反应，就是加到一个含反应性氢原子的化合物中，形成一个羟甲基化合物。 3.在组织固定

18、过程中，甲醛与蛋白质发生交联，形成醛交联蛋白，这种化合物封闭了抗原，使之无法表达出来。 为了解决上述存在的问题，更好地暴露出抗原，将其很好地显示出来，目前世界上公认的方法就是必须进行抗原修复。 至今为止，抗原修复有许多种方法，在这些方法中，有的是根据抗体的要求来进行，有的是根据抗原的表达程度来进行，我们则对每种病例每项检测，都要求必须进行抗原修复，以达到抗原全面表达的最佳状态。 一、物理化学试剂抗原修复法。 1. 真空负压抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预先调至95，真空负压处理

19、10分钟。 待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。 这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。该法的最大的特点有四：一是各物质的分子在失重的情况下四处飘游，增加各分子间的碰撞机会；二是有恒定的温度，既能使甲醛固定的蛋白发生变性，又不需要使抗原修复液达到沸腾，不会导致切片因抗原修复液的沸腾而离开载片，保证了染色的成功率，减少了因掉片而反复制片的麻烦，保证了病理报告的及时发生，为病人争取更多的时间；三是不受条件限制，不管是金属性的不是非金属的都可以进行操作；四是可以一次性制作大批的切片。 2.微波辐射抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%

20、H2O2甲醇处理10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。 待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。 该法与上法相比，从实验结果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。当然，光靠微波的作用是不够的，还必须依靠热的作用，方能达到目的。应用微波辐射，它有双重作用，微波辐射可以使各物质分子作极性运动。促进形成的醛键断裂开。分子间运动所产生的瞬间热，当达到有效的温度后，就可导致甲醛固定后的蛋白的变性。该法的特点是：产热迅速，容易操作，也

21、容易引起抗原修复液的沸腾，使用微波炉时禁止使用金属性的器皿，以防引起失火或爆炸。 3.高压抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续14分钟。 待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。 该法高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度已达121左右。该法被应用于一些较难修复的抗原，经多次实验认为，该法效果不错。 4.隔水热抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，

22、蒸馏水洗。 切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92）。即开始计时，持续40分钟。 待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。 该法应用隔水热方法，效果不及前面三种方法，它需要较长时间的热的作用，在早期应用于Er和Pr染色的抗原修复时，我们的修复时间为40分钟，如果达不到这时间，效果将不理想。 5.电炉加热抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度

23、，当达92后，即可拔离电源，当温度低于92时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。 待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。 对各种抗原修复方法的评价。 该法是在没有上述的设备时才选用的一种方法，当然效果是最差的，因为它只是单靠热的作用，这是远远不够的，另外，电炉加热必须常用温度计来测量温度，对其温度不好控制，有时需要多次关闭电源来维持所需的温度。 抗原修复，必须注意以下问题： 1.PH值的应用范围及选择。 应用于抗原修复的物质很多，但至今为止，大家公认的最好的抗原修复液还是柠檬酸盐缓冲液PH6.0，据多年来的实践认为，该液确实很好，它适合于大多数的抗原

24、，在常规应用的临床标记抗体中基本都适用，经用该液修复后的抗原表达增强，抗原的定性和定位很理想，结果不错。但近来也有文献报道，应用抗原修复液PH8.0的效果也不错。 2.抗原修复时应选择最佳温度。 据Masson等研究表明：7090的温度对没有经固定的蛋白可发生变性，但经福尔马林固定的蛋白，要使其发生变性，温度必须在92。据实验认为温度在9298是合适的，尤其在95为最好，这是因为：这种温度未达沸腾，切片不容易脱离裁片；能够解离和破坏与蛋白交联的甲醛醛键等，处理时可以随意选择和确定抗原修复的作用时间。 3.抗原修复时有效温度所需持续时间根据各单位的设备条件以及使用的仪器不同，抗原修复时在有效的温

25、度范围内所持续的时间也不一样。例如：真空负压抗原修复法，当达到预定的温度和所需的负压（66.7KPa）后可持续5-10分钟，微波辐射抗原修复法温度不好控制，抗原修复液容易沸腾，如果切片附贴任凭其沸腾持续5-10分钟。如果切片附贴很牢固，为了防止脱片，一发现抗原液已沸腾，即可关掉电源，待温度下降后，又可重开电源。如此反复数次，使之持续10分钟。不过似这种停停开开着的做法效果不如开着的，因为开着的除了热效应以外，还有足量的微波辐射。应用高压抗原修复法，当发现抗原修复液沸腾后，加上压力阀，出现喷气后，可持续时间达2-4分钟。隔水热加热抗原修复法，要特别注意内外液体的温度，内液指抗原修复液，外指浸泡抗

26、原修复液容器的水，应用时用温度计浸入抗原修复液测试，使之保持在有效的温度（92）范围内。持续时间在40分钟，电炉加热抗原修复法，其持续时间在10分钟以上。由于效果较差，该法目前较少使用。 4.抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的。 抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其慢慢地降温，决不能为了争取时间，强行用冰块或冷水令其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。如果用冰块和冷水强行令其降温，松开后的蛋白分子肽链突遇降温而固定下来，恢复不了原有的构型，达不到预想

27、的效果。 5.尽量使用足量的抗原修复液。 抗原修复的方法，都采用加热的方法，尤其是微波辐射加热法，该法由于产热快。液体容易挥发直至干涸。因此，应用于抗原修复的液体，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修复的切片，如果由于液体少而导致切片的干涸，则应丢弃切片，因为热干涸的切片中的抗原是没办法补救的，因它是一种不可逆的现象。据实验认为，用于微波辐射抗原修复的液体，量大可多至1000ml。应用大量的抗原修复液时，由于它的量较大，可延缓了液体的沸腾时间，增加了切片受微波辐射的量，对抗原修复将达到彻底。 6.切片必须附贴牢固。 用于抗原修复的切片，必须附贴牢固，否则发生掉片，则前功尽弃。 二、化学试剂抗原

28、修复法： 1. 胃蛋白酶消化法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 PBS洗3次，1分钟/次。 滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20分钟左右。 PBS冲洗3次，2分钟/次。 后按选择好的免疫组化该法进行染色。 2.胰蛋白酶消化法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 PBS洗3次，1分钟/次。 滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20分钟左右。 PBS洗3次，2分钟/次。 后按选好的免疫组化染色方法进行染色。 评价：上面介绍了胃蛋白酶和胰蛋白酶两种酶的使用方法，因这两种酶在平常较常被使用，故而专门进行

29、介绍，除此之外，无有几种酶如链霉蛋白酶，无花果蛋白酶菠萝蛋白酶等也可被用来消化切片。其用法基本一样。 现今应用酶来消化切片，主要是根据抗体的要求来进行的，否则都应用物理化学试剂抗原修复法来进行。因为酶消化不适合于多数的抗体，效果也没有其它方法好，因此临床上都较好用它。 作好免疫组化染色必须注意的问题 I、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。 在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞

30、中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。 II、组织脱水必须彻底干净 组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，