微生物限度方法学验证完整版.docx

1、微生物限度方法学验证完整版 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度方法学验证微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。二、菌种、培养基及稀释液表1菌种菌种名称菌种代数菌种状态厂家大肠埃希菌 CMCC(B)441023正常浙江省食品药品检验研究院金黄色葡萄球菌CMCC(B)260033正常枯草芽孢杆菌CM

2、CC(B)635013正常白色念珠菌CMCC(F)980013正常黑曲霉CMCC(F)980033正常乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)500943正常表2培养基培养基名称批号厂家营养肉汤培养基150222北京三药科技开发公司改良马丁培养基150134北京三药科技开发公司改良马丁琼脂培养基150215北京三药科技开发公司营养琼脂培养基150317北京三药科技开发公司玫瑰红钠琼脂培养基150323北京三药科技开发公司胆盐乳糖培养基150127北京三药科技开发公司胆盐硫乳琼脂培养基150214北京三药科技开发公司四硫磺酸钠亮绿培养基150416北京三药科技开发公司MUG培养基150122北京三药科技开

3、发公司曙红亚甲蓝琼脂培养基150137北京三药科技开发公司三糖铁琼脂培养基150207北京三药科技开发公司表3对照用培养基对照培养基名称批号厂家营养肉汤对照培养基中国食品药品检定研究院营养琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院玫瑰红钠琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院胆盐乳糖对照培养基中国食品药品检定研究院胆盐硫乳琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院四硫磺酸钠亮绿对照培养基中国食品药品检定研究院MUG对照培养基中国食品药品检定研究院曙红亚甲蓝琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院三糖铁琼脂对照培养基表4试剂试剂名称批号级别磷酸二氢钾130826分析纯氢氧化钠分析纯氯化钠分析纯聚山梨酯80化学纯9

4、5%乙醇药用级二甲氨基苯甲醛分析纯盐酸分析纯稀释液：（1）缓冲液 取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。（3）（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。（4）靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小

5、时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在28可在24小时内使用。2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用%无菌氯化钠溶液制成每

6、1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在28可在24小时内使用。四、验证内容1、计数方法验证将制备好的菌悬液用%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于10cfu-100cfu的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近100cfu/ml。2、适用性检查细菌、霉菌、酵母菌取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备

7、2个平皿，混匀，凝固，置3035培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2328培养72小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不小于对照培养基的70%。细菌、霉菌及酵母菌培养基适用性检查培养基名称菌种名称测试培养基（cfu）对照培养基（cfu）回收率(%)大小形态标准结论碟1碟2平均碟1碟2平均营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌878385959997一致大小形态一致且回收率7

8、0%符合规定金黄色葡萄球菌888285949896一致大小形态一致且回收率70%符合规定大肠埃希菌8386959595一致大小形态一致且回收率70%符合规定玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌84879994一致大小形态一致且回收率70%符合规定金黄色葡萄球菌9086889710199一致大小形态一致且回收率70%符合规定大肠埃希菌88839299一致大小形态一致且回收率70%符合规定培养基中细菌、霉菌、酵母菌的生长情况良好，回收率在80%，且与对照培养基状态一致，证明此批次培养基可以准确的检测出相应微生物情况。控制菌2.2.1促生长能力取大肠埃希菌菌悬液（内含菌约10100cfu），分别置于胆盐乳糖培

9、养基、MUG培养基、营养肉汤培养基中；取乙型副伤寒沙门菌（内含菌约10100cfu），分别接种于营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，取乙型副伤寒沙门菌（内含菌约10100cfu）涂布于胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基中；于35培养18小时，同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照，每个培养基平行制备2个平皿。胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基、MUG培养基与对照管比较，被检培养基管试验菌应生长良好；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。2.2.2抑制能力取金黄色葡萄球菌100 cfu左右，注入无菌平皿中，立即倾注胆盐乳糖

10、培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，每个培养基平行制备2个平皿，混匀，凝固，置35培养18小时，应不得有菌生长。2.2.3指示能力取乙型副伤寒沙门菌10100cfu，接种于三糖铁琼脂培养基中，每个培养基平行制备2个平皿，混匀，凝固，置3035培养18小时；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基指示能力见2.2.1中乙型副伤寒沙门菌测试结果，MUG培养基指示能力见中大肠埃希菌测试结果。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反映情况等应与对照培养基一致。控制菌培养基适用性检查培养基名称促生长性（与对照比较）抑制性（与对照比较）金黄色平葡萄球菌指示性（与对照比较）乙型副伤

11、寒沙门菌结论菌种名称形态大小形态大小指示反应胆盐乳糖培养基大肠埃希菌一致一致无生长-符合规定MUG培养基大肠埃希菌一致一致-一致一致一致符合规定营养肉汤培养基大肠埃希菌一致一致-符合规定乙型副伤寒沙门菌一致一致-符合规定四硫磺酸钠亮绿培养基乙型副伤寒沙门菌一致一致无生长-符合规定胆盐硫乳琼脂培养基乙型副伤寒沙门菌一致一致-一致一致一致符合规定曙红亚甲蓝琼脂培养基乙型副伤寒沙门菌一致一致-一致一致一致符合规定三糖铁琼脂培养基-一致一致一致符合规定培养基的促生长性及指示性菌落生长状态一致，抑制性均无菌落生长，说明培养基适用性良好。3、抑菌性：取连续生产的三批样品进行测定细菌 、霉菌、酵母菌3.1.

12、1供试液的制备：称取本品10g，加缓冲液100ml，混匀，制成1：10的供试液。3.1.2试验组：取大肠埃希菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和枯草芽孢杆菌菌悬液各1ml，分别加上述供试液1ml，注入平皿中，立即倾注1520ml温度不超过45溶化的营养琼脂培养基培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。菌液组：取上述各试验菌液1ml，加入相应的培养基培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。3.1.4供试品对照组：取供试液1ml，分别注入1520ml温度不超过45溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基培养，每个培养基平行制备2个平皿。3.1.5回收率标准以供试品对照组为样

13、品空白(C0)、以菌液组为对照(T)、以试验组为测试品(C)计：(C-C0)/T70%细菌、霉菌及酵母菌抑菌性检测结果统计批号培养基名称菌种培养时间（h）菌液组菌数Cfu试验组菌数Cfu供试品对照组菌数回收率%数值平均数值平均数值平均150804营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌72848690810728895金黄色葡萄球菌7286849372829012大肠埃希菌72849192728793玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌120868485001208786金黄色葡萄球菌12087858612088870大肠埃希菌1208783831208483150805营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌7288859565

14、728690金黄色葡萄球菌7285957284924大肠埃希菌728189728794玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌120838587001208788金黄色葡萄球菌12086848812082850大肠埃希菌120888486881208090150806营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌72879466728497金黄色葡萄球菌72838696967289966大肠埃希菌72859596728697玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌12084848587001208489金黄色葡萄球菌12085908912086880大肠埃希菌1208289871208585 通过连续三批次不同种菌类的加样，回收率均在90%

15、以上，说明本产品对于细菌、霉菌及酵母菌不具备抑菌性。控制菌3.2.1大肠埃希菌取10 ml供试液（制备方法同3.1.1）及大肠埃希菌菌悬液1ml(10100cfu)加入胆盐乳糖培养基100ml，于35培养24小时。取上述培养物，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。紫外灯照射时管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性；加入靛基质试液时液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。3.2.2沙门氏菌取10 ml供试液（制备方法同3.1.1）

16、及乙型副伤寒沙门菌1ml(10100cfu)，直接接种至200ml的营养肉汤培 养基中，混匀，于35培养培养24小时，取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，35培养24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂培养基和曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上，35培养24小时。合格标准若上述试验检测出试验菌，则按此供试液制备方法和控制菌检查方法进行供试品的该控制菌检查。控制菌抑菌性检查大肠埃希菌试验组（+/-）阴性对照组（+/-）MUG+ +- -靛基质+ +- -沙门氏菌试验组（+/-）阴性对照组（+/-）四硫磺酸钠亮绿培养基+ +- -胆盐硫乳琼脂培养基 + +- -曙红亚甲蓝琼脂对照培养

17、基+ +- -三糖铁琼脂对照培养基+ +- -经控制菌的验证，当样品被1:10稀释时，本品不具有抑菌性，可以直接采用平皿法进行检验而不对检测结果造成假阴性的影响。五、本品微生物限度检查方法的确定综上所述，本品细菌、霉菌及酵母菌检查采用常规平皿法，取1：10稀释级供试液1ml置90mm的无菌平面皿中，注入1520ml培养基进行培养；大肠埃希菌按常规法检验。1ml供试品中，细菌数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出；每10ml不得检出沙门菌。六、样品微生物限度检查结果取3批样品，按验证过的方法进行微生物限度检查，结果如下。 微生物限度检查结果批号细菌数（cfu/ml）霉菌和酵母菌数（cfu/ml）大肠埃希菌沙门菌生产验证15080410010 未检出未检出1508055010未检出未检出1508066010未检出未检出结果，三批样品的微生物限度均符合规定。