生物工程复习资料缩.docx

1、生物工程复习资料缩第一章绪论第一节生物工程的概述1 .1生物工程的产生及定义.生物工程的定义：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的，即现代生物工程技术。1.2 生物工程的种类.基因工程.细胞工程.发酵工程.酶工程.蛋白质工程应用：农业、环境、食品、医药等多个方面基因工程.基因工程(gene engineering) 是指在基因水平上的操作井改变生物遗传特性的技术。细胞工程.细胞工程(cellengineering)是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特

2、性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁育动植物个体，或获得某种有用物质的技术。细胞工程主要包括动植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术(也称细胞杂交技术)、细胞器移植技术等。发酵工程发酵工程(fermentationengineering)是指利用包括工程微生物在内的某些微生物或动、植物细胞及其特定功能，通过现代工程技术手段(主要是发酵罐或生物反应器的自动化、高效化、功能多样化、大型化)生产各种特定的有用物质；或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。由于发酵多与微生物密切联系在一起，所以又有微生物工程或微生物发酵工程之称。酶工程.利用酶、细胞器或细胞所具有的

3、特异催化功能以及对酶进行的修饰改造，并借助于生物反应器生产人类所需产品的一项技术。.主要包括酶的固定化技术、细胞固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计技术等。蛋白质工程蛋白质工程(protein engineering)这一名称是1981年由美国基因公司的Ulmer提出的，它是指在基因工程的基础上，结合蛋白质晶体学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰、改造、拼接，以产生能满足人类需要的新型蛋白质的技术。生物工程发展的趋势.目前三个平台：DNA重组、细胞培养和DNA芯片.未来将会形成的几个新的平台1.基因组平台2.生物芯片3.干细

4、胞生物学4.生物信息学5.神经科学第二章基因工程第一节基因工程基础基因工程gene engineering.运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。基因工程的基本过程就是利用重组DNA（recombinant DNA）技术，在体外通过人工“剪切（cut）”和“拼接（splice）”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行增殖，并使重组基因在受体内表达，产生出人类需要的基因。基因工程是用

5、人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。基因工程研究的理论依据不同的基因有相同的物质基础基因是可切割的基因是可转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因工程技术路线1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）切2、DNA片段和载体的连接重组体DNA接3、外源DNA片段引入受体细胞基因克隆和基因文库-转4、选择基因（目的基因）-选5、目的基因表达-表达1.1基因工程的工具酶限制性核酸内切酶-基因的剪刀DNA聚合酶-基因

6、的针线DNA连接酶限制性核酸内切酶.一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶。.restriction endonuclease.这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。.根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶.型酶不适合做基因工程的工具酶.型酶在基因工程中也不常用.型酶是基因工程理想的工具酶型限制性核酸内切酶的基本特性1、识别序列和切割位点2、切割方式3、同尾酶和同裂酶4、限制性片段长度：经限制性核酸内切酶切割后产生的DNA片段。切割频率：某限制酶在该DNA切割位点出现频率1、识别序列.可识别长度为4-7bp的双链DNA特定序列，

7、该识别序列（识别位点）常呈旋转对称性。1、切割位点.切割位点与其识别序列一致，在其识别序列内切割DNA。2、切割方式3、同尾酶和同裂酶.指来源不同、识别序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。.同裂酶指来源不同、而识别序列和切割方式均相同的核酸内切酶。DNA连接酶.能够将两端DNA拼接起来的酶类.原核生物主要有两种类型的DNA连接酶：Ecoli DNA连接酶和T4DNA 连接酶。.最常见的是T4噬菌体DNA连接酶.DNA连接酶能够催化DNA链上彼此相邻的3-羟基（OH ）和5-磷酸基团（-P），形成磷酸二酯键。.DNA连接酶就可以用来在体外连接DNA片段.DNA连接酶的作用.是将双螺旋DNA

8、分子的某一条链上两个相邻核苷酸之失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口封闭起来，即催化3-OH和5-p之间形成磷酸二酯键，从而将具黏性末端的双链DNA、平末端双链DNA以及带缺口的双链DNA连接起来。原核生物主要有两种类型的DNA连接酶.Ecoli DNA连接酶.T4DNA 连接酶.催化反应能量来源不同.T4DNA连接酶用ATP，而EcoliDNA连接酶则用NAD .催化平末端连接的能力不同.只有T4DNA连接酶能够连接两条平末端的双螺旋的DNA片段DNA聚合酶催化DNA体外合成反应 (一)常用的DNA聚合酶：.大肠杆菌DNA聚合酶.大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶.T4噬菌体DNA聚合

9、酶.T7噬菌体DNA聚合酶.Taq DNA聚合酶DNA聚合酶I(DNasel)是一种单链多肽蛋白质，具有三种不同的酶催活性，即53的聚合酶活性、53的核酸外切酶活性和35的核酸外切酶活性。主要用途是通过DNA缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针Klenow酶的主要用途.修补经限制性内切酶消化或其他方法所形成的5或3突出末端，制备平末端。.对具有3隐蔽末端的DNA片段作放射性末端标记。.cDNA克隆中的第二链cDNA的合成。.DNA序列测定。T4DNA聚合酶.这是由T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物纯化而来，具有两种酶催活性，即53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。主要用途.可

10、将任何形式的双链DNA制备成平末端的双链DNA。.外切酶的活性比Klenow酶强200倍，并且在高浓度的dNTP存在时，降解作用即会停止.进行双链DNA的3末端标记。T7DNA聚合酶.具有53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性.主要用途：.用于拷贝大分子量模板的引物延伸反应；.如同DNA聚合酶一样，可通过单纯的延伸或取代合成的途径，标记DNA的3末端，也可用来将双链DNA的5或3突出端转变成平末端的结构。修饰的T7DNA聚合酶.对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去35的核酸外切酶活性.修饰的T7DNA聚合酶的加工能力以及在单链模板上的聚合作用的速率增加了39倍.测序时常用此酶，故亦称

11、测序酶TaqDNA聚合酶.最适的活性温度是72，连续保温30min仍具有相当的活性.在补加有四种脱氧核苷三磷酸的反应体系中，能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板，按5 3的方向合成新生的互补链DNA。 (二)分子克隆中常用的其他工具酶.甲基化酶.末端转移酶.碱性磷酸酶.逆转录酶.S1核酸酶.Bal31植酸酶1.2基因工程的载体.Vector，本质是DNA .携带外源基因进入到受体细胞的运载工具载体的功能：.运送外源基因高效转入受体细胞.为外源基因提供复制能力或整合能力.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因克隆载体具备条件.在克隆载体合适的位置含有允许外源DNA片段组入的克隆位点

12、，并且这样的克隆位点应尽可能的多。.克隆载体能携带外源DNA片段进入受体细胞，或停留在细胞质中进行自我复制；或整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA同步复制。基因克隆载体具备条件.具有能够直接观察的表型特征.克隆载体必须是安全的。.易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。2基因克隆载体分类根据导入的受体生物。可以分为：.大肠杆菌载体.植物载体.酵母载体.动物载体将外源DNA导入原核生物细胞大肠杆菌载体.质粒载体.噬菌体载体.柯斯质粒载体1、质粒载体质粒（plasmid）是指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质，一般为双链的共价闭合环状DNA。pBR322质

13、粒载体：“P”表示是一种质粒；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。质粒载体的条件一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几方面的条件。1具有复制起点2具有抗菌素抗性基因3具有若干限制酶单一识别位点4具有较小的分子量和较高的拷贝数pBR322质粒载体的优点：1、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识

14、别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，3、具有较高的拷贝数,经过氯霉素扩增后,每个细胞中可积累1000-3000拷贝。2、噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒的总称.噬菌体颗粒的外壳是蛋白质，内部是核酸。.噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期。.只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。.具有溶原周期的噬菌体称为温和噬菌体。2、噬菌体载体.噬菌体载体.M13噬菌体载体.噬菌粒载体3、柯斯质粒载体.也称黏粒载体，是指一类由人工构建的含有DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体.噬菌体

15、基因组是一长度为48 502bp的线性双链DNA分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链，称为粘端(cohesive end，cos)。这是将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。.噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以以环状形式存在，并且能够自然成环。噬菌体载体的类型.1插入型载体.插入型的载体又分免疫功能失活和大肠杆菌半乳糖苷酶失活两种亚型。.前者凡有外源DNA插入的重组体都能形成清晰的噬菌斑.后者形成无色(浅蓝色)的噬菌斑.2置换型载体.在载体非必要区的两侧含有核酸限制性内切酶两个切点，两个切点间的片段被取代后不影响噬菌体生活力的载体。可插入长度约为20kb的外源DNA。在可取代的区段中

16、带有lacZ基因的相应序列时，重组体亦可用半乳糖苷酶失活法进行筛选。核酸分子探针的标记.探针是指在化学及生物学意义上能与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法所测定的分子。.核酸分子探针是指能与互补核酸系列复性杂交的特定已知核苷酸片断。核酸分子探针的标记.切刻平移法.随机引物法.末端标记法.随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物。.随机引物法是近年发展起来的一种较理想的核酸探针的标记方法。核酸分子的杂交核酸分子.是基因工程及分子生物学领域中最常用的基本技术之一.是基于在适宜的温度及离子强度等条件下，具有一定同源性的两条核苷酸单链可按碱基互补原则复性杂交形成双链的原理

17、建立的.杂交的两条单链分别是核酸探针和待测核酸杂交的分类.核酸原位杂交.菌落原位杂交.斑点狭缝杂交.膜上吸印杂交(目前最常用的一种核酸分子杂交方法)第二节基因工程研究.目的基因的分离与制备.目的基因与载体的重组.将重组体导入受体细胞.重组转化体的筛选和鉴定.克隆基因的表达2.1目的基因的分离与制备.外源基因（Foreign gene）：插入到载体内的非自身的DNA片段.目的基因（Objective gene）是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。.基因化学合成法DNA自动合成仪.基因生物制备法.cDNA文库法.PCR法.基因组文库法.基因分离的物理化学方法.鸟

18、枪法(shot gun).cDNA文库的建立与基因的分离.直接从特定的mRNA分离基因.基因组文库的建立和基因的分离.从蛋白质人手分离编码此蛋白的基因.基因化学合成法.利用PCR法或RT-PCR分离基因基因分离的物理化学方法.根据DNA分子的两条链存在着GC、A=T(分别代表GC间的三个氢键、AT间二个氢键)碱基配对。如DNA分子中某段的GC碱基对含量高，则其热稳定性就高，即其熔解温度(Tm)值就高。这样，人们可以通过控制熔解使富A=T区解链变性，而富GC区仍维持双链。当利用单链核酸酶s1酶去除解开的单链部分，得到富GC区的DNA片段。海胆rDNA基因的分离就是一例。鸟枪法(shot gun)

19、.这一方法又叫霰弹法。这一方法是绕过特定基因分离这一关口，用生物化学方法，如用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上同一般基因大小相当的DNA片段(o81069106道尔顿)。然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌(如Ecoli)中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出你所要的基因。.基因组文库法.直接从基因组中分离目的基因的方法.以适当的目的基因片段作探针，利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增，提取其中的重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。.cDNA文库法.cDNA：具有与某RN

20、A链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementaryDNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。.以适当的目的基因片段作探针，利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增，提取其中的重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。cDNA文库的建立方法.1分离表达目的基因的组织或细胞.2从组织和细胞中制备总体RNA和mRNA.3第一条cDNA链的合成.4第二条cDNA链的合成.(i)自身引导法(图1-15) .(ii)cDNA第二条链的置换合成法.(iii)引物一衔接头法合成双链cDNA

21、.5cDNA的甲基化和接头的加入.6双链cDNA与载体的连接第一条互补DNA链的合成需要RNA模板、cDNA合成引物、反转录酶、4种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液(Mg2+)等。作为第一条链合成反应产物的cDNA：mRNA杂交分子充当切口平移的模板。基因的化学合成1基因片段的全化学合成：所谓基因片段的全化学合成是首先合成组成一个基因的所有片段，相邻的片段间有46个碱基的重叠互补，在适当的条件下(主要是温度条件)经退火后，用T4 DNA连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因。.2基因的化学一酶促合成：.此方法的特点是不需要合成组成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片

22、段，相邻的3末端有一短的顺序相互补，在适当的条件下通过退火形成模板引物的复合体(template-primer complex)，然后在存在四种dNTP的条件下，用Ecoli的DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)去填补互补片段之间的缺口，最后用T4DNA连接酶连接及适当的限制性内切酶切割后重组入载体.PCR法.通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。2.2目的基因与载体的重组黏性末端连接1、由同一种限制性核酸内切酶切割的不同DNA 片段具有完全相同的末端；2、由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段具有相同类

23、型的黏性末端；.如果目的基因的DNA片段是用限制性内切酶切割并有黏性末端，则用同一种限制性内切酶处理载体DNA，使其成为黏性末端。切下的目的基因的片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成一个重组DNA分子。平末端连接连接平末端DNA分子的方法有4种：（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用衔接物连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。（1）T4DNA连接酶除了能够封闭具有3，一OH和5一P末端的双链DNA的缺口之外

24、，在存在ATP和加入高浓度酶（10-100倍）和低浓度的聚乙二醇PEG8000存在的条件下，它还能够连接具有完全碱基配对的平末端的DNA分子。这种反应的原因目前尚不清楚。但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。且外源DNA不能原位删除下来。（2）同聚物加尾连接平末端DNA片段运用末端核苷酸转移酶，能够将核苷酸(通过脱氧核苷三磷酸前体)，加到DNA分子单链延伸末端的3，一OH基团上，它并不需要模板链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸。.优点在于：不易自身环化，这是因为同一种DNA分子两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。因为载体和外源片段的末端是互补

25、的黏性末端，所以连接效率较高。用任何一种方法制备的DNA片段都可以用这种方法进行连接。.同聚物加尾法的不足之处：方法烦琐；外源片段难以回收。另外由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。还要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会重新产生某种核酸限制性内切酶的切点。.(3) 用衔接物连接平末端DNA分子.如果重组体DNA是用T4DNA连接酶的平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么就无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决这个问题，可采用衔接物法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。.所谓衔接物(linker)，是指用化学方法合成的一段

26、由1012个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。.衔接物的5，末端和待克隆的DNA片段5，末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来（4）DNA接头连接法.DNA衔接物连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也就会把克隆基因切

27、成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。.当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的衔接物，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头(adapter)连接法。.DNA接头(adapter)连接法于1978年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。导入方法.1CaCl2处理后的细菌转化或转染。.2高压电穿孔法。.3聚乙二醇介导的原生质体转化法。.4磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。.5原生质体

28、融合。.6脂质体法。.7细胞核的显微注射法。.1CaCl2处理后的细菌转化或转染。这是将重组的质粒或噬菌体DNA导入细菌中所用的常规方法，前者叫转化(transformation)后者叫转染(transfection)。作为受体细胞的细菌经一定浓度的冰冷CaCl2(50-100mmolL)溶液处理后变成所谓感受态细胞(Competent cells)处在感受态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。.注意以下几点：(a)用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在OD 600为04左右为好。(b)制备受体细胞的整个过程要在4进行，并尽量避免污染。如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培

29、养基上不生长。(c)为了提高转化率，可选用复合CaCl2溶液如“分子克隆”一书所介绍的FSB溶液。2高压电穿孔法。通过调节外加电场的强度、电脉冲的长度和用于转化的DNA浓度可将外源DNA导入细菌或真核细胞。用电穿孔法实现基因导入比CaCl2法方便，对细菌而言其转化效率可达1091010转化体微克DNA，但必须有专门仪器3聚乙二醇介导的原生质体转化法。这种方法常用于转化酵母细胞以及其它真菌细胞。活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶(如driselase)处理变成球形体后，在适当浓度的聚乙二醇6000(PEG一6000)的介导下将外源DNA转化入受体细胞中。.4磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染

30、。这是将外源基因导入哺乳类细胞中进行瞬时表达的常规方法。用磷酸钙和DNA共沉淀方法时是将被转染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内吞作用进入受体细胞。5原生质体融合。通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。经过细胞膜融合，细菌内容物转入动物细胞质中，质粒DNA被转移到细胞核中。.6脂质体法。将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入。.7细胞核的显微注射法。即将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中。2.4重组转化体的筛选和鉴定筛选和鉴定遗传检测核酸分析法物理检测法目的基因转录产物检测目的基因翻译产物检测一、遗传检测根据载体表型特征的筛选抗药性标记半乳糖苷酶显色反应根据插入基因遗传性状的筛选二、核酸分析法(一) PCR法(二)核酸杂交法菌落印迹原位杂交斑点印迹杂交Southern印迹杂交 (三)DNA测序法(一)PCR法.根据含目的基因两端或两侧已知核苷酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的总DNA为模板进行扩