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1、125二羟维生素D3对屋尘螨香烟提取物所致气道上皮屏障损伤的保护作用及机制探讨1,25-二羟维生素D_3对屋尘螨/香烟提取物所致气道上皮屏障损伤的保护作用及机制探讨研究背景及意义:慢性气道疾病（主要包括支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病）已成为世界性的重大公共卫生问题。近年研究证实,气道上皮的完整性损伤及免疫功能紊乱是慢性气道疾病启动的关键环节,其参与了气道炎症、气道高反应性及气道重塑等病理过程。因此,关于气道上皮屏障损伤及修复的研究对完善慢性气道疾病发病机制,寻求有效的新治疗靶点尤为重要。气道上皮屏障是呼吸系统抵御外界病原体的第一道防线,其不仅包括由粘液冲刷,纤毛运动以及气道上皮连接组成的机械屏障

2、,还包括了由多种免疫细胞及气道上皮细胞参与的免疫屏障。气道上皮屏障损伤和修复取决于气道内部的保护因素与外来损伤因素之间的平衡。气道上皮屏障功能主要靠上皮顶端的紧密连接蛋白（TJs,主要由胞质紧密粘连蛋白（Z0）1-3和闭合紧密连接蛋白（occludin）1-5组成）和粘附连接蛋白（AJs,主要由 E-cadherin,-catenin和-catenin组成）维持。许多研究表明,各种哮喘致敏原（如最常见的尘螨）、刺激物（如香烟烟雾）以及病毒等均可通过改变连接蛋白结构和表达水平从而破坏气道上皮屏障的完整性,使过敏原更容易到达粘膜下层激活树突状细胞（DC）,活化Th1或Th2免疫反应,促发炎症级联反

3、应并导致一系列病理过程,且使气道持续处于高敏状态。由此可见,如何避免和修复气道上皮的损伤是慢性气道疾病防治的关键。近年研究表明:维生素D能够增加诸如人肠道、角膜上皮细胞的跨膜电阻及相关连接蛋白的表达,降低上皮通透性,增强其屏障功能。同时,本课题组前期研究首次证实:活化形式的维生素D（1,25（OH）2D3）不但可以显著提高正常气道上皮细胞的跨膜电阻,也可以修复甲苯二异氰酸酯（TDI）所致的气道上皮屏障功能的破坏及连接蛋白E-cadherin的表达和分布异常,但其对慢性气道疾病常见危险因素（如尘螨、吸烟烟雾）损伤模型下的屏障保护作用和具体调控机制尚不完全明确。屋尘螨（HDM）是哮喘最常见的过敏原

4、之一,其通过破坏气道上皮细胞间连接,激活DC启动Th2免疫反应。研究发现:在哮喘的病理过程中,HDM可以刺激气道上皮细胞、巨噬细胞以及Th2细胞分泌产生VEGF,VEGF 一方面参与形成气道和血管重塑等哮喘病理过程,另一方面又可反作用于气道上皮细胞介导炎症反应。临床的相关研究甚至发现,VEGF水平的高低与哮喘的严重程度呈正相关关系。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/AKT通路作为各种免疫反应和炎症过程的经典通路,其可通过调控VEGF的表达调节气道上皮内高反应、炎症以及血管通透性。同时相关研究已明确:气道上皮内PI3K/Akt通路活化可上调VEGF表达,后者可加重上皮的损伤。我们前期的实验也发现:T

5、DI和HDM可显著增加气道上皮通透性及VEGF的表达,而VEGF中和抗体可显著的抑制气道上皮的损伤;VEGF单独作用即可破坏正常人支气管上皮细胞的屏障功能,利用PI3K抑制剂能显著降低VEGF的表达及气道上皮的损伤。由此可见,在气道上皮损伤的病理过程中,PI3K/VEGF通路确实与上皮细胞屏障损伤相关,同时维生素D还可以显著降低TDI诱导的气道上皮细胞VEGF和VEGFmRNA的表达。基于上述实验结果,我们猜想:在HDM诱导气道上皮损伤的病理过程中,PI3K/Akt通路参与了 VEGF表达的调控,同时1,25（OH）2D3可通过PI3K/Akt通路下调VEGF的表达,从而发挥保护上皮屏障的作用

6、。慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一种以持续性气流受限为特征的慢性气道疾病,与气道和肺脏对有害气体及有毒颗粒的异常炎症反应有关,致残率和病死率很高,全球40岁以上发病率已高达9%10%。COPD的确切病因尚不清楚,已经发现的危险因素大致可以分为外因（即环境因素）与内因（即个体易患因素）两类。外因包括吸烟、粉尘和化学物质的吸入、空气污染、呼吸道感染等。内因包括遗传因素、气道反应性增高者等。其中吸烟烟雾是COPD最常见的危险因素之一。现研究普遍认为,吸烟烟雾与COPD,哮喘,支气管炎等慢性呼吸道疾病相关。研究证实,香烟提取物

7、（CSE）可通过促钙激活中性蛋白酶（calpain）活化,剪切上皮细胞连接蛋白,破坏气道上皮间的连接,导致上皮功能障碍并激发粘膜下层的病理性改变,使气道上皮下组织长期处于应激及炎症状态,最终导致慢性呼吸道疾病的发生和进展。由此可见,calpain激活是CSE诱导气道上皮屏障损伤的途径之一。calpain是钙离子活化的半胱氨酸蛋白酶,基本在所有组织中均有表达,其活性主要受MAPK通路调控。最近研究表明,维生素D可以抑制calpain活化后E-cadherin裂解所导致的胆道上皮损伤。因此,我们假设:在CSE诱导气道上皮损伤的病理过程中,MAPK通路参与了 calpain活化的调控,同时1,25（

8、OH）2D3可通过MAPK通路下调calpain的表达,从而发挥保护上皮屏障的作用。本课题拟在体外实验探讨:1.HDM诱导的气道上皮屏障破坏与VEGF、PI3K/Akt通路之间的关系;2.1,25（OH）2D3是否可以抑制HDM诱导的气道上皮屏障破坏?其作用机制是否与VEGF、PI3K/Akt通路有关?3.进一步明确气道上皮损伤病理过程中,PI3K/Akt通路的活化与VEGF表达之间的关系。4.在CSE诱导的气道上皮屏障破坏中,进一步明确1,25（OH）2D3是否可以抑制CSE诱导的气道上皮屏障破坏?其作用机制是否与MAPK通路调控的calpain活化有关?方法:1.培养正常人支气管上皮细胞株

9、16HBE及BEAS-2B。将细胞接种在含10-15%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中,培养皿平放置于37、5%二氧化碳培养箱培养。当细胞融合至90%-95%后,消化后用细胞计数板计数,按2.5104/cm2的密度将细胞按实验需要的密度接种于所需培养皿中,用于下一步实验。本实验均使用3-10代以内的支气管上皮细胞,以避免细胞老化对实验结果的影响。2.MTT比色法检测各种浓度的干预因素处理后的支气管上皮细胞的活力3.观测1,25（OH）2D3对HDM导致对气道上皮细胞屏障功能的修复作用。实验分4组:正常对照组;HDM组（400U/mL,处理24小时）;1,25（OH）2D3单纯处理组（10

10、nM,处理24小时）;1,25（OH）2D3预处理组（1,25（OH）2D3预处理后予HDM作用）。屏障功能评价指标主要有:1）细胞跨膜电阻（TEER）用Millicell电阻仪进行测定,求得标准化电阻值。异硫氰酸萤光素（FITC）-右旋糖酐透过率（Pa）用于研究单层细胞通透性的变化,实验结果均以Pa/对照组PaX 100%表示。2)Western Blot法检测支气管上皮细胞粘附连接蛋白（E-cadherin,-catenin）及紧密连接蛋白（Occludin,ZO-1）的表达水平,用图像处理软件分析连接蛋白/内参蛋白条带灰度值及其比值。3)细胞免疫荧光法检测支气管上皮细胞连接蛋白（E-ca

11、dherin,-catenin,Occludin和ZO-1）的分布情况。4.观察1,25（OH）2D3对HDM促进VEGF释放的抑制情况及PI3K/Akt通路在此过程中的作用。实验分组:正常对照组;HDM组;1,25（OH）2D3单纯处理组;1,25（OH）2D3预处理组（1,25（OH）2D3预处理后予HDM作用）。Western Blot法检测磷酸化Akt（Thr308和Ser473位点）及VEGF蛋白表达水平;实时定量荧光PCR用于检测VEGFmRNA表达,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞上清中的VEGF释放水平。5.为进一步评价PI3K/Akt通路在促进上皮细胞释放VEGF

12、及损伤上皮屏障中的作用,并证实1,25（OH）2D3经PI3K/Akt通路下调VEGF释放,从而发挥气道上皮屏障保护的功能。分别在支气管上皮细胞株16HBE和BEAS-2B细胞予PI3K通路抑制剂LY294002及PI3K通路激动剂IGF-1进行验证,实验分6组:正常对照组;HDM组（400U/mL,处理24小时）;LY294002单纯处理组（50M,处理1小时）;LY294002预处理组（LY294002预处理后予HDM作用）;IGF-单纯处理组（100ng/ml,处理24小时）;IGF-1预处理组（IGF-I预处理后予1,25（OH）2D3作用）。细胞跨膜电阻及FITC-右旋糖酐透过率用于

13、评估气道上皮屏障功能;实时定量荧光PCR和ELISA法分别用于检测VEGF mRNA表达及细胞培养上清VEGF释放水平。6.进一步验证1,25（OH）2D3对VEGF导致的气道上皮屏障破坏的保护作用。16-HBE细胞在实验中分成四组:正常对照组;VEGF组;1,25（OH）2D3单纯处理组;1,25（OH）2D3预处理组（1,25（OH）2D3预处理后予VEGF作用）。评价气道上皮屏障功能（方法同3）;Western Blot法检测磷酸化Akt（Thr308和Ser473位点）蛋白表达水平,用图像处理软件分析磷酸化Akt蛋白（Thr308和Ser473位点）/总Akt蛋白条带灰度值及其比值。7

14、.验证1,25（OH）2D3对CSE导致的气道上皮屏障破坏的保护作用。16-HBE细胞在实验中分成四组:正常对照组;CSE组;1,25（OH）2D3单纯处理组;1,25（OH）2D3预处理组（1,25（OH）2D3预处理后予CSE作用）。评价气道上皮屏障功能（方法同3）;Western Blot法检测上皮连接蛋白（E-cadherin和b-catenin）,钙蛋白酶-1（calpain-1）和MAPK通路相关蛋白（ERK,JNK,和p38）磷酸化的表达水平,用图像处理软件分析蛋白条带灰度值。8.应用SPSS13.0统计软件分析数据,计量资料用均数标准差（x s）表示,方差齐时,总体均数的比较采

15、用单向方差分析（one-way ANOVA）,各组间多重比较采用Bonferroni法;方差不齐时,总体均数的比较采用Welch法,各组间多重比较采用Durnnett T3检验。实验单位为两个及以上因素多水平测量时,数据使用析因设计的方差分析,两样本均数比较用两样本t检验,P<0.05为具有统计学意义。结果:1.不同浓度的1,25（OH）2D3和HDM对支气管上皮细胞系16HBE和BEAS-2B细胞活力影响:1,25（OH）2D3（100nM及以下浓度）和HDM（600U/mL及以下浓度）对细胞活力无显著影响（均P>0.05,n=6）。2.1,25（OH）2D3可部分修复HDM所致

16、的气道上皮屏障的破坏:与对照组比较,HDM（400U/mL,处理24小时）可导致人支气管上皮细胞16HBE和BEAS-2B单层细胞 TEER 显著下降（t=9.016,P=0.001 和 t=36.366,P=0.000）,和 FITC-右旋糖苷通透性（Pa/Pc）显著增加（t=-4.022,P=0.016 和 t=-4.657,P=0.010）;E-cadherin及ZO-1表达水平减少。细胞免疫荧光显示HDM可促进正常分布于细胞膜的连接蛋白（E-cadherin,-catenin,Occludin和ZO-1）连续性及完整性破坏,并向胞浆弥散。而予1,25（OH）2D3预处理后,可修复HDM

17、所致电阻值（t=11.750,P=0.020和 t=17.000,P=0.000）和 FITC-右旋糖苷通透性（t=-3.355,P=0.028 和t=-3.615,P=0.022）改变,并逆转连接蛋白表达和分布的异常。3.1,25（OH）2D3可抑制HDM所致的VEGF释放及磷酸化Akt高表达:Western Blot结果显示,HDM作用可使人16HBE和BEAS-2B细胞系VEGF表达增高,Akt（Thr308 和 Ser473 位点）的磷酸化增强（PT308=0.018,P s473=0.013 和 P T308=0.012,PS473=0.011）,与正常对照组比较有统计学差异。予1,

18、25（OH）2D3预处理后可降低VEGF的高表达（P=0.000）并降低Akt磷酸化水平（PT308=0.012,P s473=0.016和Pr308=0.042,Ps473=0.011）,与HDM组比较有统计学差异。与之相对应,实时定量荧光PCR和ELISA结果显示,与正常对照组比较,HDM可显著增加 VEGFmRNA 表达（t=-11.078,P=0.000 和 t=-17.662,P=0.000）及 VEGF释放（t=-17.902,P=0.000 和 t=-53.445,P=0.000）,而 1,25（OH）2D3 预处理后可部分逆转这一过程（t=-14.025,P=0.000 和 t

19、=-20.313,P=0.000）。4.1,25（OH）2D3经PI3K/VEGF途径参与修复HDM导致的气道上皮屏障破坏:在16HBE和BEAS-2B细胞系,PI3K通路激动剂IGF-1（100ng/ml）单纯处理24小时后,TEER显著降低（P=0.000和P=0.000）,FITC-右旋糖酐透过率显著升高（P=0.000 和 P=0.014）,VEGFmRNA 表达（P=0.003 和 P=0.004）及 VEGF释放增加（P=0.000和P=0.000）,与正常对照组比较有统计学差异（P<0.01）。与IGF-1单纯处理组比较,1,25（OH）2D3预处理后TEER显著回升（P=

20、0.001和P=0.000）,FITC-右旋糖酐透过率显著降低（P=0.002 和 P=0.019）,VEGFmRNA表达及VEGF释放减少（P=0.000和P=0.000）,差异有统计学差异。与HDM组比较,PI3K通路抑制剂LY294002（50M）预处理1h可显著逆转这一结果,有统计学差异（P=0.000和P=0.000）。5.1,25（OH）2D3修复VEGF所致的气道上皮屏障破坏:与VEGF组比较,1,25（OH）2D3 预处理后可修复 VEGF 所致的 TEER 降低（t=8.600,P=0.001）和 FITC-右旋糖酐通透性增高（t=-5.361,P=0.006）。VEGF与1

21、,25（OH）2D3对支气管上皮细胞连接蛋白的表达量没有影响。细胞免疫荧光结果示VEGF作用后可以使沿细胞膜分布的连接蛋白绿色荧光减弱,结构疏松甚至出现连续性破坏,且绿色荧光在细胞浆中弥散增多;而予1,25（OH）2D3（10nM,处理24小时后加VEGF刺激）预处理后,可部分修复VEGF所致的连接蛋白分布异常。Western Blot结果显示,1,25（OH）2D3预处理后可降低VEGF所致的Akt（Thr308和Ser473位点）磷酸化水平增高,与VEGF组比较有统计学差异（P=0.030和P=0.000）。6.不同浓度的CSE对支气管上皮细胞系16HBE细胞活力影响:CSE（2.5%及以

22、下浓度）对细胞活力无显著影响（P>0.05,n=6）。7.1,25（OH）2D3可部分修复CSE所导致的气道上皮屏障的破坏:与对照组比较,2.5%CSE可导致人支气管上皮细胞16HBE单层细胞TEER显著下降（t=6.930,P=0.002）,和 FITC-右旋糖苷通透性（Pa/Pc）显著增加（t=-12.954,P<0.001）;黏附连接蛋白E-cadherin及b-catenin表达水平减少。细胞免疫荧光显示CSE可促进正常分布于细胞膜的连接蛋白（E-cadherin和-catenin）连续性及完整性破坏,并由胞膜向胞浆移位。而予1,25（OH）2D3预处理后,可修复CSE所致

23、电阻值（t=-4.323,P=0.012）和FITC-右旋糖苷通透性（t=-3.629,P=0.022）改变,并逆转连接蛋白（E-cadherin和-catenin）表达和分布的异常。8.1,25（OH）2D3可抑制CSE所致的calpain-1表达及ERK磷酸化水平高表达:Western Blot结果显示,CSE作用可使人16HBE细胞系calpain-1表达增高,MAPK通路（ERK,P38和JNK）的磷酸化增强,与正常对照组比较有统计学差异（均P<0.05）。予1,25（OH）2D3预处理后可降低calpain-1的表达及ERK磷酸化水平,与CSE组比较有统计学差异（均P<0

24、.05）。9.1,25（OH）2D3经ERK/calpain-1途径参与修复CSE导致的气道上皮屏障破坏:在16HBE细胞系,ERK通路抑制剂U0126（10uM）和calpain-1抑制剂ALLM（10nM）可降低CSE诱导的TEER降低,FITC-右旋糖酐透过率显著升高和calpain-1的高表达,与CSE组比较有统计学差异（均P<0.05）。同时,ERK通路抑制剂U0126还能抑制CSE诱导的ERK磷酸化水平,与CSE组比较有统计学差异（P<0.05）。结论:1.1,25（OH）2D3可修复HDM所导致的气道上皮屏障功能的破坏。表现为1,25（OH）2D3部分抑制HDM所致的

25、跨上皮细胞电阻值（TEER）下降,FITC-右旋糖苷通透性增加,连接蛋白（E-cadherin及ZO-1）表达降低和连接蛋白（E-cadherin,-catenin,Occludin及ZO-1）分布的异常。HDM可通过促进VEGF的高表达及其上游主要调节通路PI3K/Akt的激活破坏气道上皮屏障,1,25（OH）2D3可通过抑制这一途径发挥屏障保护的功能。1,25（OH）2D3可减轻外源性VEGF所导致的气道上皮屏障功能的破坏。2.1,25（OH）2D3可修复CSE所导致的气道上皮屏障功能的破坏。表现为1,25（OH）2D3部分抑制CSE所致的TEER下降,FITC-右旋糖苷通透性增加,连接蛋白（E-cadherin和-catenin）表达降低及分布的异常。CSE可通过促进calpain-1的高表达及激活其上游主要调节途径MAPK通路破坏气道上皮屏障。1,25（OH）2D3可下调ERK/calpain-1通路发挥屏障保护功能。