木豆叶提取物主要成分的抗氧化活性研究.docx

1、木豆叶提取物主要成分的抗氧化活性研究木豆叶提取物主要成分的抗氧化活性研究摘要：用DPPH自由基清除法和-胡萝卜素漂白法检测木豆叶的水提取物和乙醇提取物以及从乙醇提取物中分离的乙醚层组分，乙酸乙酯层组分，正丁醇层组分，水层组分和从乙醇提取物中分离出的四种主要化合物木豆素，球松素，牡荆苷，荭草苷的抗氧化活性。在DPPH系统中，乙醇提取物的抗氧化活性高于水提取物的活性，乙醇提取物的IC50值为404.91ug/ml，水提取物的IC50值为242.01ug/ml。在乙醇提取物中分离的四种组分中，乙酸乙酯层组分的抗氧化活性最高，其IC50值为194.98ug/ml。木豆素（302.12ug/ml）和荭草

2、苷(316.21ug/ml)比球松素和牡荆苷表现出更有效的清除自由基能力。在-胡萝卜素漂白法测试中，乙酸乙酯层组分（94.13%3.41%）的抑制率是最高的，相当4mg/mlBHT（93.89%1.45%）所达到的抑制效果。球松素和牡荆苷与木豆素和荭草苷相比，没有表现出显著的抗氧化活性。总之，从乙醇提取物中的乙酸乙酯组分表现的活性高于在两个系统中所含的主要化合物，这个结果可能是由于各成分之间的协同作用。所有抗氧化活性试验的样本都是高度浓缩的。根据所获得的结果，我们可以推断出木豆叶的提取物可能是有价值的天然抗氧化剂的来源，并且可能应用于医药业和健康食品工业。关键词：木豆；抗氧化活性；DPPH；-

3、胡萝卜素Antioxidant Activities of Extracts and Main Components of Pigeonpea Cajanus cajan (L.) Millsp. LeavesAbstract: Antioxidant activities of the aqueous and ethanol extracts of pigeonpea Cajanus cajan (L.) Millsp leaves, as well as petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol and water fractions and th

4、e four main compounds separated from the ethanol extract, i.e. cajaninstilbene acid (3-hydroxy-4-prenylmethoxystilbene-2-carboxylic acid), pinostrobin,vitexin and orientin, were examined by a DPPH radical-scavenging assay and a-carotene-linoleic acid test. In the DPPH system, the antioxidant activit

5、y of the ethanol extracts was superior to that of the aqueous extracts, with IC50 values were 242.01 and404.91 g/mL, respectively. Among the four fractions, the ethyl acetate one showed the highest scavenging activity, with an IC50 value of 194.98 g/mL. Cajaninstilbene acid(302.12 g/mL) and orientin

6、 (316.21 g/mL) showed more efficient radical-scavenging abilities than pinostrobin and vitexin. In the -carotene-linoleic acid test, the inhibition ratio (%) of the ethyl acetate fraction (94.13%3.41%) was found to be the highest, being almost equal to the inhibition capacity of the positive control

7、 BHT (93.89%1.45%) at 4 mg/mL. Pinostrobin (500 g/mL) and vitexin (500 g/mL) showed insignificant antioxidant activities compared with cajaninstilbene (321.53 g/mL) and orientin (444.61g/mL). In general, the ethyl acetate fraction of the ethanol extract showed greater activity than the main compound

8、s in both systems, such results might be attributed to the synergistic effects of the components. The antioxidant activities of all the tested samples were concentration-dependent. Based on the results obtained, we can conclude that the pigeonpea leaf extracts may be valuable natural antioxidant sou

9、rces and are potentially applicable in both medicine and the healthy food industry.Keywords: Cajanus cajan (L.) Millsp.; Antioxidant activities; DPPH; -Carotene. 前言 木豆Cajanus cajan是一种多年生的豆科植物。其他的常见名为红克，刚果豆，贡戈豆，贡噶豆和无眼豆。木豆是一种重要的热带和亚热带水田豆类农作物。相比于其他豆类植物，木豆的种植面积和产量仅仅排在第六位，但木豆比其他豆类植物有更多不同的用途1-4。木豆的提取物或成分在

10、全世界内普遍用来治疗糖尿病，痢疾，肝炎和麻疹，还治疗月经不调 5-8。木豆叶做为一种传统中药，广泛用于止血，止痛和杀虫9。如今，木豆叶用于治疗外伤，口疮，褥疮和疟疾，以血胆脂醇过多引起的厌食，等10-13。现已经报道了木豆叶提取物对缺氧缺血脑损伤和酒精性肝损伤有防护作用14,15。化学成分研究组织已经指出木豆叶富含黄酮类化学物和苯二烯类化合物，他们是木豆叶对人体健康有益的主要成分16-18。抗氧化剂做为食品添加剂广泛应用于保护食物由自由基引起的氧化降解19。自从古代，香料添加于不同类型的食物改善味道也是用了它们的抗氧化能力20。最近十年里，由于精油和各种植物提取物具有良好的抗氧化性质可以做为天

11、然抗氧化剂而引起了人们对它们极大的研究兴趣。当前有几种合成的抗氧化剂用来延长食物的储藏期，例如BHT和BHA，但是随着最近研究指出它们的毒性影响了人类的健康和环境，这些物质可能不适合人类的长期食用21，22。因此，筛选天然抗氧化物的来源的研究已经引起了相当大的关注，并且普遍被认为有理想的发展。虽然一大部分植物普遍表现出强烈的抗氧化活性24，25，但是在这之前木豆叶提取物抗氧化性质还没有阐述过。因此，本研究的目的是研究通过DPPH自由基清除法和-胡萝卜素漂白法来检测木豆叶的水提取物和乙醇提取物以及其乙醚层组分，乙酸乙酯层组分，正丁醇层组分，水层组分和从乙醇提取物中分离出的木豆素, 球松素，牡荆苷

12、，荭草苷四种主要化合物的抗氧化活性。本研究将为木豆叶做为一种可能的天然抗氧化剂应用于食品工业和制药工业提供基本数据，同时为木豆资源的利用和开发提供科学依据。Figure 1. Chemical structures of (a) cajaninstilbene acid（木豆素）, (b) pinostrobin, （球松素）(c) vitexin（牡荆苷） and (d) orientin（荭草苷）. Glu: glucose.结果与讨论总黄酮以及所含主要成分的含量根据各种提取物溶液的的吸收值，并与芦丁标准品溶液进行等值对比，本研究获得结果表明木豆叶提取物乙酸乙酯层所含的总黄酮类化合物浓度很

13、高（表一）。水提取物的总黄酮类化合物浓度为（146.323.28mg/g提取物），乙醇提取物总黄酮类化合物浓度为（293.453.12mg/g提取物），乙醚层总黄酮类化合物浓度为（151.291.55mg/g提取物），正丁醇层黄酮类化合物浓度为（211.372.19mg/g提取物）和水层总黄酮类化合物浓度为（52.431.64mg/g提取物），它们所含的总黄酮类化合物浓度全都低于乙酸乙酯层黄酮类化合物的浓度，乙酸乙酯层黄酮类化合物浓度为（384.431.58mg/g提取物）。植物通常含有大量丰富的抗氧化剂，包括维生素E，类胡萝卜素 ，维生素C ，黄酮类化合物和鞣质26。根据这个实验的收率，乙醇

14、提取物总黄酮类化合物的浓度为（293.453.12mg/g提取物）相当于57.57mgRE/gdw，这个数值高于已经报的其它豆科植物所含抗氧化物质的量。例如肉桂种子为(47.412.17mgRE/gdw)，葛根为(2.660.05mgRE/gdw)，红小豆为（5.380.15mgRE/gdw），豆豉（1.960.01mgRE/gdw） ，白风信子种子(2.270.09mgRE/gdw)27。表一同时表明木豆叶乙醇提取物分离出的四种组分中主要成分的含量。乙醚层中木豆素和球松素的含量很高，大约是乙酸乙酯层中木豆素和球松素含量的两倍，然而，乙醚层中牡荆苷 和荭草苷 的含量少于乙酸乙酯和正丁醇中牡荆苷

15、 和荭草苷的含量。总之，乙酸乙酯层组分中四种化合物的含量很大，分别是木豆素37.7952.13mg每g提取物，求松素12.3392.53mg每g提取物，牡荆苷21.032.23mg每g提取物和荭草苷18.821.13mg每g提取物。表一. 木豆叶提取物和四种分离组分中总黄酮以及主要化合物的含量（n=3）SampleContent（mg/g extract）Flavonoids Cajaninstilbene Pinostrobin Vitexin Orirntin AcidAqueous extracts 146.323.28 0.5450.12 0.890.69 1.250.21 1.070

16、.32Ethanol extracts 293.453.12 32.761.67 11.851.41 6.210.35 6.132.21 Petroleum ether 151.291.55 69.931.39 30.292.09 0.2530.07 0.1220.09franctionEthyl acetate 384.431.58 37.7952.13 12.3392.53 21.032.23 18.821.13fractionn-Buthanol 211.372.19 - - 5.6973.26 8.831.08 fractionWater fraction 52.431.64 - -

17、- 4.3830.24图二.木豆叶中四种主要成分，四种分离组分，提取物的抗氧化活性。（A-C：DPPH自由基清除试验；D-F：-胡萝卜素漂白法试验）（n=3）。P0.05.抗氧化活性用DPPH自由基清除法和-胡萝卜素漂白法检测木豆叶的水提取物和乙醇提取物以及从乙醇提取物中分离的乙醚层组分，乙酸乙酯层组分，正丁醇层组分，水层组分和从乙醇提取物中分离出的四种主要化合物的抗氧化活性，所有数据都列在了图二和表儿中。在DPPH实验系统中，乙酸乙酯组分的IC50值为194.98ug/mL，其自由基清除活性高于其它实验样品，但低于维生素C。从提取物中分离出的单体化合物木豆素和荭草苷 同样也表现出一定的抗氧化

18、活性IC50值分别为302.12ug/ml和316.21ug/ml）。其他样品的IC50值在242.01ug/mL和388.31ug/mL之间。表二. 木豆叶中四种主要成分，四种分离组分，提取物的IC50值。Sample DPPH radical scavenging -Carotene-linoleic acid test assay IC50 (ug/mL) IC50(ug/mL)Aqueous extracts 404.91 475.26+Ethanol extracts 242.91 256.88+Petroleum ether fraction 553.41 581.99+Ethyl

19、 acetate fraction 194.98 213.89+n-Butanol fraction 382.23 410.47+Water fraction 2388.31 2663.91+ Cajaninstilbene 302.12 321.53+ Pinostrobin 500 500+Vitexin 500 500+Orientin 316.21 444.61+Ascorbic acid 201.29 BHT 195.74+符号*和+表示极显著的区别（P0.01）在-胡萝卜素漂白法实验中，我们可以推断出的结果与从DPPH实验中得到的数据一致。乙醇提取物（91.23%0.42%）表现出

20、显著的抗氧化活性，与浓度为4mg/ml水提取物（89.32%3.28%）的抗氧化活性相当。乙酸乙酯组分（94.13%3.41%）的抑制率是最高的，几乎相当于BHT（93.89%1.45%）的抑制活性能力。在实验中，牡荆苷和球松素表现出的活性弱。 Ganiyu Oboh研究了一些普通热带豆科植物的清除自由基能力28。根据他的研究结果，木豆的甲醇提取物表现出很高的清除自由基能力（54.5%）。这个数值显著（P0.05）的低于我们实验中的木豆的乙醇提取物的清除自由基能力。除了提取物的不同以外，这个区别可能还来自于提取溶剂和方法，环境因素和不同种植物，这些因素应该考虑在内。迄今为止，很多作者已经做了很

21、多豆科植物抗氧化活性的报道。一些植物表现出了比木豆叶提取物更强的清除自由基能力。例如，Caesalpinia digyna 根的甲醇提取物和水提取物（IC50值为4.860.90和89.721.05），Pseudopiptadenia contorta，Platypodium elegans叶的乙醇提取物以及花生皮的乙醇提取物（各自的值为13.840.30ug/ml,184.922.69和30.80ug/ml）（P0.05）。同样，许多植物表现出弱的清除自由基能力，例如，葫芦巴种子的乙醇提取物（350ug/mL），pueraria lobata（2482.00766.11ug/ml）和puer

22、aria mirifica(2904.5230.37ug/ml)块茎的乙醇提取物（P0.05）29-33。从数据的对比我们发现木豆叶可以做为一种天然抗氧化剂而应用于许多领域。我们可以根据实验结果得出一个结论。那就是总黄酮含量与抗氧化活性之间有一个显著的关系。乙酸乙酯组分的高抗氧化活性可能归因于其含有很高含量的总黄酮。Arora等和van acker等已经分析了总黄酮的化学结构和抗氧化活性之间的关系34,35。根据这些研究的结果，B环上出现一个catechol或者一个pyrogall取代基，那么总黄酮就有抗氧化活性。总黄酮骨架上有hydroxyl取代基，那么活性增强，相反，methoxyl取代基

23、使活性减弱。我们实验中的乙酸乙酯组分拥有强烈的抗氧化活性可能归因于其所含的化合物拥有这些增强活性的化学结构。在我们试验，。球松素，牡荆苷和荭草苷都是黄酮类化合物，但是只有荭草苷表现出缓和的抗氧化活性。产生这一现象的原因之一可能是因为其化学结构中缺少羟基基团。虽然在我们的定量分析试验中没有检测到球松素具有抗氧化活性，但是一些报道中说，球松素 是一种强烈的黄酮类抗氧化剂诱导酶36。基于以上实验结果，我们同时发现二苯乙烯类化合物 木豆素 表现出与天然抗氧化剂白藜芦醇相当的抗氧化活性37。这个实验结果促使我们在以后的实验中来研究其抗氧化活性的机制。可是木豆素IC50值低于其他三种成分，石油醚组分含有大

24、量的木豆素表现出弱的抗氧化活性。这些结果说明黄酮类化合物和二苯乙烯类化合物之间存在协同作用。事实上，很难将总提取物的抗氧化作用归因于其所含有的一种化学成分或所含成分的一些活性规律，因为提取物通常是一些不同种类化合物的混合物。除了主要成分以外，一些微量成分也可能具有明显的抗氧化活性。遵循以上实验结果，我们可以推断木豆叶的抗氧化活性可能是由组分间的协同作用引起的。总之，这个实验结果可以是一个关于木豆叶抗氧化性的介绍，并且为木豆叶乙醇提取物乙酸乙酯组分中所含的物质做为应用于食品工业和其他领域的一种天然抗氧化剂提供理论依据。然而，急需用以后的研究来寻找增强木豆叶抗氧化活性的活性成分。实验药品与仪器分析

25、纯级别的乙醇，甲醇，氯仿，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇均购买于北京化学试剂公司（中国，北京）。DPPH，-胡萝卜素，BHT，VC,均购买于SIGMA-ALDRICH(德国)。实验用水为二次蒸馏水。CSA（98%，色普级）,pinostrobin（95%，色普级）vitexin（98%，色普级）和orientin（98%，色谱级）均由森林植物生态学重点实验室分离纯化。化学结构得到了红外，碳氢核磁共振和质谱数据的认证。11,38,39。植物材料干燥木豆叶收集于中国海南省，由中国东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室的聂少权教授鉴定。鉴定材料存放于重点实验室的植物标本室中。木豆叶粉碎成40目，使用前

26、保存在室温下干燥的地方。乙醇提取物和水提取物的制备用逆流提取来制备木豆叶的乙醇提取物：木豆叶5og加入80%的乙醇400ml，提取温度80，时间为1h。经过真空蒸发乙醇来获得残余物（12.29w/w）。残余物使用前存放在温度为4的地方。用同样的方法制备木豆叶的水提取物：木豆叶5og加入煮沸蒸馏水400ml，提取温度80，时间为1h，然后经过过滤和冷冻干燥获得粉末。粉末（8.6%w/w）使用前存放在温度为4的地方。干燥的80%乙醇提取物残余物混悬于100ml蒸馏水中。室温下，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，溶剂比为1：1，每种溶剂萃取三次。三种萃取溶液和水溶液经过真空蒸发，挥散出石油醚，

27、乙酸乙酯，正丁醇，水而成为粉末。这些粉末进一步分析前存放在温度为4的地方。分离目标化合物木豆叶乙醇提取物用二氧化硅凝胶柱饱和色谱进行分离流动相为色谱石油醚和甲醇。色谱石油醚分离组分中含有球松素和木豆素，色谱甲醇组分中含有牡荆苷和荭草苷。两种分离组分在中压二氧化硅凝胶柱饱和色谱上进行进一步分离，各自流动相为有浓度梯度的色谱石油醚和色谱甲醇。然后经过结晶和重结晶纯化得到pinostrobin（180.00mg），cajaninstilbene acid（230.60mg），vitexin（19.30mg）orientin（15.80mg）。它们都通过红外，核磁共振和质谱得到了认证. HPLC分析用

28、于HPLC分析的系统为配有model delta600泵，2996光电二极管定量检测器和millennium32软件系统的沃特斯高效液相色谱仪系统。色谱柱为HIQ Sil C18V反相色谱柱。流动相为A溶液（甲醇）和B溶液（0.1%甲酸水溶液）的混合溶液，根据设置的洗脱梯度，分析持续65min，在20min内A溶液的浓度由90%减少到33%，流速为1.0ml/min。样品的检测收集波长为259.2nm（cajaninstilbene acid）290nm、（pinostrobin）330nm（vitexin）345nm（orientin）。总黄酮含量测定由于黄酮类化合物结构复杂，我们根据Ord

29、on-Ez等的分光光度法来确定提取物中总黄酮的含量40。2%ALCL3乙醇溶液（0.5ml）添加到0.5ml样品中。室温下1h后，在420nm洗进行吸收检测。黄色斑点代表总黄酮类化合物。提取物组后浓缩成浓度为0.1mg/ml。总黄酮含量参照物为芦丁。抗氧化剂活性测定DPPH清除自由基定量分析：用紫色的DPPH乙醇溶液漂白的方法来检测提取物以及从乙醇提取物中分离的四种组分（石油醚组分，乙酸乙酯组分，正丁醇组分，水组分）和单体化合物的氢原子或者电子转移能力。这种分光光度的定量分析的试剂为DPPH41。100ul样品用乙醇定溶至1.4ml后加入0，004%DPPH乙醇溶液。混合物剧烈振荡后立刻放入紫

30、外-可见光分光光度计中在517nm下进行含量监测。反应进行70min直到反应达到平衡。抗坏血酸，一种稳定的抗氧化剂，用于对照组实验。样品的自由基清除活性用DPPH抑制率来表示，根据一下的公示进行计算：抑制率=(AB-AA)/AB*10042.AB代表70min后空白样品的吸收值，AA代表70min后试验样品的吸收值。-胡萝卜素漂白试验：-胡萝卜素漂白试验可以用来测定样品的抗氧化活性43。将10mg左右的-胡萝卜素溶解于10ml氯仿中。取胡萝卜素-氯仿溶液0.2ml注入装有20mg亚油酸和200mg吐温-40的烧瓶中。氯仿用旋转蒸发仪进行回收，操作条件为40下5min，回收所得的残余物溶解于50

31、ml的蒸馏水中并缓慢的大力振摇使其形成乳化剂。取一部分乳化剂大约5ml装入装有0.2ml样品溶液的比色皿中并立即测量其在检测波长为470nm以空白试剂为对照条件下的吸光度，空白试剂中只含有乳化剂而没有-胡萝卜素。比色皿放于50的水浴中，乳化剂中的氧化剂含量通过分光光度法测量，检测波长为470nm，检测时间超过60min。控制样品的含水量在200ul。BHT是一种稳定的抗氧化剂用来做为实验对照。用60min后对照组的抑制率来表示抗氧剂的活性。根据以下公式计算：AA=100（DRC-DRS）/DRC这里AA=抗氧化活性；DRC =降解控制率=In(a/b)60；DRS =实验中样品的降解率=In(

32、a/b)60；a=0min时溶液的吸光度；b=60min时溶液的吸光度。统计分析我们只用了ANOVA这一种方法检验了这个研究结果的显著性。不同实验数据的P0.05，表示每一个实验数据都具有统计学意义 致谢郑重感谢中国自然科学基金（30770231），黑龙江省杰出青年科学基金（JC200704），中国教育部重点项目（108049），国家关键技术的研发项目（2006BAD18B0405），林业局国际先进农业科学技术创新项目（2006-4-75）哈尔滨科技创新人才研究基金（2006RFXXS001）对我的资助。参考文献1. Chakraborty, S.K.; Kumbhar. B.K.; Sarkar, B.C. Process parameter optimization for i