三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨.docx

1、三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨（作者： 单位： 邮编： ）作者：马陶陶 张群林 李俊 孟晓明 黄成 陈玉璞【摘要】 目的探讨以芦丁作为对照品，采用三氯化铝（A1C13 ）比色法测定中药总黄酮含量的专属性，并建立A1C13比 色法测定中药总黄酮含量的最优条件。方法通过对几类典型结构的黄 酮类及多酚类化合物A1C13显色前后的吸收峰（2 0 0 6 00 nm）进行比较，分析以芦丁为对照品的A1C13 比色法测定中药总黄酮的合理性。结果A1C13 显色后，部分黄酮类物质在421 nm处有较强吸收。结论采用A1C13 比色法测定中药总黄酮的含量具有合理性

2、，并建立了A1C13 比色法测定中药总黄酮含量的最优条件。【关键词】 A1C13比色法总黄酮芦丁Abstract : Objective To discuss the speci a1ity of A1C13 co1orimetry with rutin as reference substance fo r eva1uation on the content of totai flavonoids and investigate the optimum condition of A1C13 c olorimetry. MethodsTomake a series of flavonoids

3、and polyphenols with typical structure with AlCl3 and measure their absorption curves at the r ange of 2 0 0 600 nm. Results At the wavelength of 421 nm,some flav ono id-like compo unds showed the similar absorption with rutin . Con clusi on It is reasonabl e to determine the total flavonoi ds by us

4、ing AlCl3 colorimetry wi th rutin as reference substance and establish the optimum condi tion of AlCl3 colorimetry.Key words: AlC3 c olorimetry; Total f lavonoids; Rutin黄酮类化合物(Flavonoids )是以C6 C3-C6结构为基本母核的色原烷或色原酮的衍生物，以其广泛的药 理作用倍受青睐，而中药材中总黄酮的含量测定成为近年来研究黄酮 化合物所关注的焦点。中药总黄酮的含量测定一般采用比色法、 高效液相色谱法等1。比色法是被

5、中国药典所采用的最常见的 总黄酮测定方法，其中又以NaNO2 -A1（NO3 ）3 NaOH比色法常用2。这种方法以NaNO2 A1（NO 3 ） 3为显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮物质生成红色铝螯 合物为特征，以芦丁为对照，在5 10 nm处测定吸光度，从而得 到待测物质总黄酮的含量。郭亚建等3 曾对这种方法的专属性进行了讨论，发现具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在芦丁显色的最大 波长处（5 10 nm左右）也有较强吸收，而黄酮类成分黄芩素、 山柰酚在此波长处没有吸收，从而说明采用NaNO2 A1（NO3 ） 3 NaOH 比色法，以芦丁作为对照，不能排除非黄酮 类物质的干扰，这种方法测定中

6、药总黄酮含量的专属性不强。因此，本实验采用另一种常用的比色法：A1C13 比色法，对几类典型结构的黄酮类化合物（芦丁、儿茶素、木犀草素、鼠 李素、山柰奈酚、槲皮素、葛根素、金丝桃苷、橙皮苷）及多酚类化 合物（2，3 二羟基苯甲酸，绿原酸，和厚朴酚，阿魏酸）A1 C13显色前后的吸收峰（2 0 0 600 nm）进行比较，分析以芦丁为对照品的A1C13 比色法测定中药总黄酮的合理性， 并对芦丁显色的pH 值，A1C13浓度、显色温度等条件进行优 化研究。1仪器与试药Agilent 8 4 5 3 紫外分光光度计；PHS 3 C精密pH计（上海雷磁仪器厂）。试剂：芦丁，葛根素，2,3 二羟基苯甲酸

7、，绿原酸， 和厚朴酚，阿魏酸，儿茶素，木犀草素，异鼠李素，山柰奈酚，槲皮 素，金丝桃苷，蒙花苷、橙皮苷均购自中国药品生物制品检定所。三 氯化铝，醋酸钠，冰醋酸，甲醇均为分析纯，水为双蒸水。2方法2.1供试品的制备以芦丁为例，精密称取芦丁标准品（12 0 C 烘干至恒重）10. 0 mg，甲醇定容至50 ml，配成0 .2m g/ml的芦丁母液。2.2显色试剂的配置精密称取A1C13 1.34 g，甲醇定 容至10 0ml，配成0. 1 mol/L 的溶液。精密称取CH3COONa3H2O 2.72 g，双蒸水溶解至100 ml， 配成0.2 mol/L 的溶液。精密量取1 .15 ml冰醋酸，

8、 双蒸水稀释至10 0 ml配成0. 2 mol/L 的醋酸溶液4, 5。2.3芦丁紫外吸收峰的扫描精密量取1 ml芦丁母液溶液，置于10 ml 容量瓶，加入2 ml 0. 1 mol/L 的AlCl 3溶液，甲醇定容，充分显色2 0 min6，在2 0 060 0 nm范围扫描，记录吸光度值。2.4供试品紫外吸收峰的扫描精密量取1 ml供试品（芦丁,葛根素，2,3 二羟基苯甲酸、绿原酸、阿魏酸、和厚朴酚、儿 茶素、木犀草素、异鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、金丝桃苷、蒙花苷、 橙皮苷)，按“2.3” 项下方法，在2 0 0 6 0 0 nm扫描样品的紫外吸收峰。2.5标准曲线及可行性考察从芦丁母液

9、中精密移取0.0， 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml 溶液，平行两份， 第1份直接加入2 ml 0. 1 mol/L 的A1C13 显色2 0 min;第2 份加入2 ml 0. 1 mol/L A1C13 ，1ml pH为5.2 的NaAC HAC缓冲溶液，40C水 浴显色10 min，分别做标准曲线，并以金丝桃苷为样品，考察 方法的可行性。3结果3.1芦丁显色的紫外光谱图在黄酮类化合物的紫外光谱图上， 主 要有苯甲酰基部分引起的吸收带I (3004 0 0 nm)和桂 皮酰基部分引起的吸收带II (2402 8 0 nm)，加人铝盐 可使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的络合物，带

10、I 红移，吸光度 明显增大。当加入AlCl3 充分显色后，芦丁吸收峰从359 n m红移至4 2 1 nm，且吸光度有所增加。见图1。图1芦丁加入AlCl3 前后的紫外光谱图(略)3.2AlCl3 比色法专属性探讨在2 0 0 6 0 0 nm对几种典型结构的黄酮类物质及多酚类物质AlCl3 显色前后的 紫外吸收峰进行比较，结果发现显色后金丝桃苷、异鼠李素、山柰奈 酚的吸收峰位置和芦丁的相似，都在4 2 1 nm左右，而其他物质 的与芦丁的不同。如图2 为显色后各物质的紫外光谱图。图2 14种物质显色后的紫外光谱图(略)3.3显色条件的优化331 pH值的影响采用NaAc -HAc缓冲盐溶液调

11、节 溶液的pH 值，实验表明，当缓冲盐的pH 值小于5.2时，芦 丁的吸收峰在4 0 2 nm 左右，且吸光度值较小；当pH 值在5.26.0 时，吸收峰在421 nm 左右，吸光度值增大，如图3(a)。且当pH值为5.2时，吸光度值最大，因此选择p H为5. 2的NaAc -HAc缓冲盐体系作为优化的显色条件 之一。3.3.2A1C13 的浓度以2 X10-5 g/ml 的芦丁溶液，pH 值5. 2的NaAc -HAc 缓冲盐为条件，在6. 6 X10-5 0 .33 mol/L 范围内讨论A1C13 浓度对芦丁吸收峰的位置及吸光度大小的影响， 结果发现：1：6 0 0 W n 芦丁： nA

12、1C13W1：2 时，即A1C13 浓度为3.3 X 10-40.1 mo1/L 时，吸收峰在421 nm 左右，且 吸光度的值随A1C13 浓度的增加而变大。如图3(b )所示。n 芦丁 ： nA1C13 1:2，即 A1C13 浓度小于 3.3 X1 0-4 mo1/L 时，吸收峰在3 6 5 nm 左右，且吸光度减小。 n 芦丁： nA1C13v1: 600，即 A1C13 浓度大于0. 1mo1/L，吸收峰移至4 0 4 nm 左右，且吸光度减小。因此选择A1C13 浓度为0.1 mol/L 为芦丁显 色的优化条件之一。333显色温度对吸光度的影响实验中由于显色时间较长， 为了提高效率

13、，采用水浴加热。加热10 min,考察水浴温度对吸收峰位置及吸光度大小的影响。如图3(c)。结果表明，水浴温度4 0C是芦丁显色的优化条件之一。图3显色条件对芦丁吸光度的影响(略)3.4显色稳定性考察以2 X10-5 g/ml 芦丁溶液，0.1 mo1/LA1C13 ，pH 值5.2NaAc -HAc 缓冲溶液为条件，考察显色的稳定性，结果表明，显色15 0 min，吸光度变化的RSD为2.862%，说明以芦丁为对照，A1C 13比色法显色稳定。3.5线性及可行性考察以一定浓度的金丝桃苷作为样品， 直接加入2 m1 0.1 mo1/L 的 A1C13 ，显色20 min， 其标准方程：Y= 0

14、.0 0 7 79 + 27 3 5 1.1 9 0 4 8 X，RA = 0.9 9 9 22，测得的金丝桃苷的浓度是2.75 X104 g/m1，回收率为12 1.15% ;而优化后的方法：2 m1 0.1 mo1/L A1C13 ， 1 m1 pH 为 5.2 的NaAc HAc 缓冲溶液，4 0C水浴显色10 min， 其线 性方程为 Y= 0.0 0 1 53 +29 5 9 5.2 0 9 3 2 X，RE=0. 9 9 9 7 2,测得的金丝桃苷浓度为2. 3 0 6 X 1 0 4 g/ml，回收率为10 1.58%。由此说明0.1 mol/L A1C13, pH5.2 的Na

15、Ac -HAc 缓冲盐溶液，40C 水浴显色10 min,方法的准确度更高，为A1C13 比色法的 优化方法。4讨论葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入A1C13 ，反应前后紫外吸收峰的位置没有发生改变，而其余物质的紫外吸收峰均发生红移。 从结构上分析，葛根素、蒙花苷、橙皮苷只存在5 位羟基，不存在邻二酚羟基和3 位羟基，由此可见A1C13 的显色反应主要发生 在3位羟基、4位羰基和邻二酚羟基，只存在5 位羟基、4 位羰 基时黄酮类物质与A1C13 不发生反应。芦丁与A1C13 发生显色反应，生成黄色络合物，在421 nm左右有较强吸收。实验对几种常见的多酚类化合物紫外光 谱图进行了扫描，结果表明对于含

16、邻二酚羟基的非黄酮化合物：2，3 二羟基苯甲酸、阿魏酸、和厚朴酚、绿原酸，A1C13 显色 前后在4 2 1nm 左右均没有吸收峰，消除了非黄酮类化合物对显 色的干扰。槲皮素为芦丁的苷元，显色后在437 nm左右有较大吸收，而芦丁的最大吸收峰在4 2 1 nm，说明黄酮的苷和苷元的极 性相差较大，槲皮素3 位羟基可能对反应有影响。木犀草素的结构 和芦丁相比，3 位没有羟基，显色后在4 14 nm有最大吸收， 从而进一步说明3 位羟基可能对A1C13 显色反应有影响。具有典型结构的常见的黄酮类苷和苷元：金丝桃苷，芦丁， 异鼠李素，山柰奈酚，A1C13显色前在4 2 1 nm处无吸收， 显色后均在

17、芦丁的最大吸收峰421 nm左右有较大的吸收。在现 今的实验条件下，对于大多数黄酮类中药材而言，多含有黄酮苷，常 见的苷在此波长处有较强吸收，而非黄酮类物质在此处无吸收。因此 以芦丁作为对照，A1C13比色法可以成为测定中药总黄酮含量的 理想方法。对于任一络合反应，溶液的酸碱度会影响金属离子的水解及存在形式，影响络合物的组成。当采用盐酸（氢氧化钠）调节显色溶液pH值时，因其酸（碱）性较强，破坏络合物的结构，无法测得 中药总黄酮含量的真实值，而采用NaAc -HAc缓冲盐溶液时，加入前后芦丁的吸收峰位置不变，仍在3 5 9 nm处，所以采 用NaAc -HAc缓冲盐调节显色溶液的pH 值。从方法

18、的可行性考察结果可以看出， 以金丝桃苷为样品，采 用2种方法考察回收率，优化的方法准确度更高，所以加入0. 1 mo1/L A1C13 ，pH 为5. 2 的NaAc -HAc 缓冲 溶液，40C水浴加热10 min为A1C13 比色法的优化显 色条件。【参考文献】:1郑健，陈焕文，刘宏伟，等.紫外可见分光光度法在药物分析中的应用J.分析科学学报，2 0 0 2，18(2): 15 8.:2国家药典委员会.中国药典，1 部S.北京：化 学工业出版社，2 0 0 5:2 5 6.:3郭亚健，范 丽，张珍兰，等.关于比色法测定总黄酮方法的探讨J.药物分析杂志，2002，22(2) : 9 7.:4

19、 丁明玉，赵纪萍，李擎阳.贯叶金丝桃提取物中总黄 酮的测定方法J.分析实验室，2001，20(6) : 4 5.:5张锡瑜.分析化学原理，第2 版M.北京：科学 出版社，2 0 0 0:3 9 8.:6刘斌，石任兵，王 伟.蒲黄总黄酮含量测定方法的研究J.北京中医药大学学报，2001，24(4) : 2 3.溶液，40C水浴加热10 min为A1C13 比色法的优化显色条件。【参考文献】 1 郑 健，陈焕文，刘宏伟，等紫外可见分光光度法在药物分析中的应用J.分析科学学报，2 0 0 2,1 8(2):15 8.:2国家药典委员会.中国药典，1 部S.北京：化 学工业出版社，2 0 0 5:2 5 6.3郭亚健，范 丽，张珍兰，等关于比色法测定总黄酮方法的探讨J.药物分析杂志，2002,22(2) : 9 7.4丁明玉，赵纪萍，李擎阳.贯叶金丝桃提取物中总黄酮的测定方法J.分析实验室，2001,20(6) : 4 5.:5张锡瑜.分析化学原理，第2 版M.北京：科学 出版社，2 0 0 0:3 9 8. 6 刘 斌，石任兵，王 伟.蒲黄总黄酮含量测定方法的研究J.北京中医药大学学报，2001，24(4) : 2 3.