Lost in Transit LongDistance Trafficking and Phloem.docx

1、Lost in Transit LongDistance Trafficking and Phloem 伴胞是伴随筛管而产生的薄壁细胞。伴胞与筛管分子的侧壁之间通过许多胞间连丝连接。 水从根部向叶部的输送叫蒸腾流，糖从叶向枝、干、根部的输送叫易位流。Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and PhloemUnloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts运输过程中的丢失：蛋白质信号在拟南芥嫁接体中的长距离运输和韧皮部的卸载。除了运输糖分和营养物质，韧皮部也运输许多大分子物质。虽然嫁接和蚜

2、虫侵染试验已经鉴定到许多进入韧皮部的大分子物质，但是韧皮部中运输这些物质的功能还不清楚。为了深入研究蛋白质的运输机制，进行拟南芥嫁接试验，接穗表达叶绿体转运多肽的GFP蛋白，并受35S启动子驱动，嫁接到非转基因砧木上。嫁接10天后在根尖的质体中检测到荧光信号。采用伴胞特异性启动子SUC2也得到相同的结果，这些信号可以将蛋白质靶向过氧化物酶体，肌动蛋白和细胞核。在砧木中，没有检测到对应的mRNA，表明韧皮部中蛋白质存在广泛的运动。从根原生韧皮部的向外运输，仅限于中柱鞘与内皮层之间，并通过胞间连丝进行大分子物质交换。引导蛋白质从细胞膜核糖体到内质网和高尔基体的信号分子并没有运输到根部。这表明细胞器

3、靶向序列并不能阻止这些蛋白进入韧皮部的易位流（蒸腾流）。因此，从伴胞到筛管分子的蛋白质的非特异运输可以解释在韧皮部中鉴定到大量大分子物质。 韧皮部是连接植物远距离不同器官的重要载体。除了主要运输可溶性物质外，韧皮部在运输各种大分子物质（如蛋白质和RNA）方面也其作用。近来，韧皮部中运输的大分子的真实性才开始明了。例如，菟丝子侵染拟南芥，检测到超过9000mRNA从宿主到病原体。然而，嫁接植物的蛋白质组学数据表明，一些RNA在目标位点已经翻译。除了mRNA，韧皮部汁液充满了各种蛋白，许多蛋白在长距离运输中并不起明显的作用。总之，这些数据揭示了大分子在韧皮部的运输。 对韧皮部中出现的大分子，关心的

4、主要问题是：默认而不是定向情况下，有多少大分子进入易位流？之前的研究中，一些结合GFP的可溶性蛋白，在伴胞中翻译后可以进入易位流并到达根尖。检测的所有融合蛋白，一部分从根的初生韧皮部卸载。然而，只有自由的GFP向根尖运输。这些数据表明，伴胞合成的蛋白进入筛管分子是非特异的，进入易位流的蛋白经过默认的路径，而不是翻译过程中强烈靶向伴胞或筛管中。尽管没有直接检测，但是存在于伴胞中的mRNA也可能通过这个默认路径。最近的一项研究表明，mRNA进入韧皮部可能与其在伴胞中的丰度和半衰期直接相关。在这一背景下，伴胞中产生的许多大分子信号在长距离信号传输中起重要作用。一个研究透彻的案例就是控制开花的FT蛋白

5、的运输，它在伴胞中翻译合成并运输到茎尖诱导开花。这里，我们展示了大量GFP标签蛋白，靶向茎部细胞内的细胞器，进入易位流并通过嫁接部分。这一现象经常发生在细胞膜核糖体翻译的蛋白质，而不是那些在内质网核糖体合成的蛋白质。这些蛋 白质通过嫁接部分并在根部原生韧皮部卸载。没有蛋白质穿过中柱鞘与内皮层，表明胞间连丝在这一界面的分子扩增上限（SEL）是重要调节因子。我们的结果表明细胞器靶向蛋白在伴胞细胞质翻译后经常进入易位流。重要的是，这些蛋白并不局限于韧皮部，但是进入中柱旁边的细胞。表明，根原生韧皮部附近的细胞确保韧皮部筛管分子的末端不是被大量的蛋白运输堵塞的。我们的数据表明，可溶性物质和靶向蛋白持续进

6、入易位流，使得将来鉴定独特的系统韧皮部信号充满挑战。图1 嫁接试验设计A表达荧光蛋白的接穗嫁接到非转基因砧木，使用塑料项圈连接，嫁接10天后检测根部荧光信号；B嫁接部分的接穗荧光信号（中括号是项圈部分，箭头是嫁接部分）图2 tpFNR-GFP从接穗到砧木的运输A嫁接10天后，在韧皮部筛管分子末端发现强烈的荧光信号；B A图的放大效果，荧光质体在韧皮部周围。C 根部卸载区域，荧光质体仅限在中柱内，ep表皮，co皮层，en内皮层，pe中柱鞘，x木质部；D虽然根持续伸长，荧光信号仅在中柱以内；E侧根中的韧皮部周围表现出荧光信号；F轰击tpFNP进入叶子的表皮细胞（点线），并不能向周围细胞移动；G S

7、UC2启动子结合tpFNP检测的荧光信号与35S启动子结果一致。图3 细胞器靶向融合蛋白从接穗到砧木的运输荧光信号从转基因接穗（A到D）与非转基因砧木（I到L）的比较。通过韧皮部运输穿过嫁接部分的荧光蛋白，E F G H.方框区域是较大的放大倍数。表1 本研究中融合蛋白的属性图4 转基因转录本在嫁接拟南芥中的移动性嫁接5周后不同嫁接组合的RT-PCR结果，检测与转基因接穗对应的mRNA在砧木中的表达情况，分别是tpFNR-eGFP, CP-eGFP，A5-eGFP。右图是对应的荧光蛋白在根中的定位情况。图5 在韧皮部中发现的蛋白质的生物信息学和统计学分析，考虑它们的分子重量，基因表达，亚细胞定

8、位A生物信息学分析展示的韧皮部表达的蛋白与韧皮部汁液特异检测的蛋白的关系，大部分在韧皮部移动的蛋白其分子大小在20-70kD。远处的箭头指示的是一个179kD叶绿体靶向蛋白，绿色点对应的是SUC2的表达。红点表示细胞器靶向序列蛋白，区别与黑色无该信号的蛋白。B 韧皮部分泌液与拟南芥蛋白质组中的蛋白质对应不同细胞器的相对比例。C 基于表达量和分子质量在韧皮部分泌物中检测到该蛋白质的可能性，基因表达与分子质量用lg10的对数表示。叶绿体蛋白在细胞质核糖体翻译，然后转运到叶绿体的外模。我们检测靶向其它细胞器的蛋白是否也与叶绿体转运肽存在相同的运输路径。接穗表达的荧光蛋白结合以下细胞器的靶向信号，氧化

9、物酶体（A5-eGFP）细胞核（H2B-YFP）肌动蛋白结合域（FABD2-GFP）,然后嫁接到非转基因砧木上。图3对接穗与砧木检测到的荧光信号进行了比较。以上结合蛋白，均在韧皮部附近的中柱细胞中检测到等量的带标签的子结构体。他们使用的一些融合蛋白也编码靶向蛋白的重要区域。分子质量最大的是FABD2-GFP, 67kD 除了能够穿过嫁接结合部分也能从原生韧皮部卸载。然后他们又检测了那些在内质网核糖体翻译的，靶向细胞内膜系统的蛋白质是否能够穿过嫁接结合部分并完成卸载。分别嫁接HDEL-GFP（内质网内腔）, RTNLB6-GFP（内质网膜），ST跨膜区域的-GFP（高尔基体）到非转基因砧木，然而

10、嫁接10天后并没有在根部检测到荧光信号。mRNA分析对18-24个嫁接体的非转基因砧木进行RT-PCR检测，以证明mRNA的转运。试验中，使用两个叶绿体信号肽（tp-FNR-GFP和CP-eGFP），还有结合过氧化物酶体信号序列的GFP（A5-eGFP），它们均能持续通过嫁接结合体。然而，嫁接5周后在根部并不能检测任何结合蛋白的mRNA。为了证实在这个时间点蛋白表达是可见的，使用共焦显微镜观察根部，均能在韧皮部附件观察到清晰的荧光信号，尽管这些信号比嫁接10天前要弱一些。生物信息学和统计分析在嫁接试验中，GFP结合蛋白在强启动子35S和SUC2作用下能够表达，也就提高了这种可能性，就是伴胞中蛋

11、白的过表达有助于其进入筛管分子。为解决这个问题，我们分析了与韧皮部易位流中发现的蛋白质相关的已报道数据，这不同于GFP结合蛋白表达的方式。对韧皮部中出现的mRNA和蛋白质的分子质量进行生物信息学分析。将带有已知细胞器靶向序列的韧皮部移动蛋白与不带有这类序列的蛋白分离出来。最终，150个蛋白（52%）含有细胞器靶向序列。与拟南芥蛋白质组的相比，这些蛋白在不同细胞器中的相对分布，如图5B所示。主要差异是蛋白质分配到细胞器的比例，尤其是叶绿体，线粒体和过氧化物酶体。这可能反应出伴胞特殊的蛋白组分。韧皮部中带有和不带有靶向序列的基因表达水平没有显著差异，这就排除了韧皮部中带有细胞器靶向序列的移动蛋白只

12、在基因高表达的时候存在。这些数据也揭示了进入易位流的蛋白的分子质量主要在20-70kD，表明分子质量或更精确的说是蛋白质半径可能影响伴胞与筛管分子的通道。使用逻辑回归模型分析蛋白大小和转录丰度与在韧皮部发现该蛋白的可能性，进一步确认了上述观点。这个模型表明，对于低于70kD的蛋白，基因表达水平与蛋白大小存在指数关系。蛋白丰度越高越容易进入易位流。70kD以上的蛋白，进入筛管分子的可能性显著降低，这与基于筛管与伴胞之间的胞间连丝分子扩散上限（SEL）的简单扩散模型一致。少数超过70kD的蛋白在韧皮部中检测到，一个例子就是叶绿体靶向蛋白（AT5G04140，179kD）。讨论过去十年，大量的研究表

13、明韧皮部易位流充满mRNA和蛋白质。奇怪的是，韧皮部存在各种各样的大分子物质，导致得出以下猜测，韧皮部起着信息高速公路的功能。比较明确的是，许多系统大分子信号参与发育和防御机制。研究透彻的例子是控制开花信号的FT蛋白，这个蛋白在伴胞中合成并运输到茎尖分生组织，然后激活响应。目前，FT蛋白从原生韧皮部末端到茎尖分生组织的通路还不清楚，FT可能启动下游信号导致开花。其它与发育相关的长距离运输大分子就是mRNA。例如，BEL1类的同源蛋白被认为是长距离运输的信号并参与块茎形成，而且Mouse ears的mRNA影响番茄叶子的发育。这些RNA在流组织中的翻译情况仍不清楚。在病原菌侵染过程中，蛋白质信号

14、进入易位流，然后远距离的组织抵抗病原菌的侵入，启动系统性抵抗。在大多数案例中，蛋白信号在进入筛管前在伴胞中合成。不管是生长发育还是病原菌诱导的信号都有个共同特征，它们的产生是不连续的，与环境变化和病原菌侵染有关。因此，可以猜想蛋白信号在韧皮部中的运动是由它们在伴胞内的翻译时间调控的。但是，并不是所有在韧皮部汁液中的蛋白有明显的信号功能，许多可溶性的蛋白可能既定的进入筛管。在Stadler的研究中，一些受SUC2启动子表达的可溶性蛋白从伴胞进入筛管，并运输到根部。只有自由的GFP（27kD）在所有根部组织卸载，较大的结合蛋白也能从原生韧皮部进入一个独特的后生韧皮部区域。近来，Calderwood

15、基于mRNA在伴胞中的丰度和半衰期，提出一个默认的通路，可能适用于许多在韧皮部运输的mRNA。但是，他也发现一些转录本能够在韧皮部移动但是它们的运动不能仅用丰度来解释。最近，Zhang研究表明，tRNA相关序列可能引起mRNA进入易位流，提供了一个潜在的解释大量的内在转录本进入穿过嫁接结合体。我们的数据表明，除了转录丰度外，分子质量也是蛋白能否进入筛管的重要决定因素。有趣的，少数分子质量大于70kD的蛋白也能检测到。这些蛋白值得进一步研究，引为它们较大的分子质量不能通过简单扩散的方式从伴胞到筛管。因此，一些特殊的蛋白和mRNA可能通过一种特定的未知的途径进入韧皮部。大分子物质进入韧皮部的最终入

16、口就是筛管与伴胞之间的胞间连丝，胞间连丝的SEL是非特异进入筛管的决定因素。 伴胞含有一整套细胞器和质体。我们的研究表明，靶向蛋白到细胞器的信号序列不能够阻止蛋白进入筛管。35S和SUC2启动子都能在伴胞中高表达。例如，35S启动子调节FT蛋白诱导开花，与伴胞启动子SUC2具有相同的方式，表明35S启动子在伴胞中足以促使FT高表达并进入筛管。在表皮细胞，结合35S启动子的亚细胞靶向蛋白可以阻止自己通过胞间连丝到达附近的细胞，在这些细胞中的靶向信号足够强大，能阻止向邻近细胞的扩散。然而，这一结果似乎并不适用于在伴胞中翻译的蛋白质。可以得出这样的结论，在伴胞中，强启动子通过增强蛋白质的表达从而促进

17、它们进入韧皮部。除了SUC2启动子外，没有伴胞内在启动子调控蛋白表达的数据。然而，对已发表数据的生物信息学分析表明，分子质量低于70kD的蛋白质，其转录丰度与在韧皮部中出现的概率呈指数关系。 重要的是，我们发现在细胞质核糖体翻译的蛋白质能够进入筛管，在内质网核糖体翻译的蛋白质不能进入筛管。在叶绿体蛋白结合GFP后，除了CT-GFP外，都能穿过嫁接结合体。这个蛋白不能移动原因不清楚。它的靶向序列可能足够强大使它留在伴胞内，或者可能和其它蛋白一样，通过分泌途径靶向到叶绿体。在本研究中，分子质量达到67kDGFP结合蛋白从伴胞进入易位流，接近生物信息学预测的临界70kD。在嫁接试验中，由于结合了GF

18、P蛋白，显著增加了分子质量。而且，GFP荧光蛋白可能掩盖了内部蛋白信号与胞间连丝的作用。我们并不认为，韧皮部汁液中存在的大量各种蛋白质都含有与胞间连丝作用的信号，而是因为蛋白质的细胞器靶向序列不能够阻止它们进入易位流。 在之前的研究中，一般认为韧皮部分泌出的蛋白质带有的细胞器靶向序列可能是样品制备过程中人为因素，来自茎或叶柄切口处的非韧皮部部分，或者在受伤过程中，韧皮部的瞬间压力释放。相同的，蚜虫侵染过程检测的一些蛋白可能是人为造成的，因为它们在筛管内没有明显的信号传输或蛋白质转换功能。我们当前的数据表明，这些蛋白可能不是异常现象，而是代表了分子质量较小蛋白的日常运输。在GFP结合试验中，所有

19、进入易位流的蛋白质，都能够离开根部原生韧皮部并靶向中柱细胞适当的细胞器。我们的数据表明后生韧皮部的大分子运输仅限在中柱鞘和内皮层之间。我们并没有韧皮部汁液检测出蛋白质的相关数据，但是这些蛋白可能仅限在中柱。然而，植物病毒作为内部的转录因子能够穿过这个界限，例如SHOT ROOT，能够在中柱中翻译。因此，在这个界面的胞间连丝必须被调控，以使中柱和皮层之间的大分子物质交换。 组成型蛋白与mRNA在韧皮部运输的重要性是什么？大分子物质进入易位流可能是伴胞与筛管复合体存在的必然设计，它们之间的胞间连丝具有较大SEL。韧皮部一个基本的作用就是运输可溶性物质从植物的源到流。为了使压力流运转，运输路径中需要

20、存在梯度，伴随着可溶性物质在流中的移动。如果筛管分子中的蛋白和mRNA不能移除，那么大分子物质持续进入易位流可能妨碍流的运行。我们数据表明，从伴胞持续进入筛管的蛋白，在原生韧皮部末端输出，确保物质流和卸载的畅通。因此，原本定向去叶片伴胞的蛋白，可能最终出现在根的中柱鞘细胞。离开原生韧皮部的可溶性蛋白的命运目前还不清楚，对将来研究这一问题提出挑战。相同的，是否韧皮部分泌液检测出的所有mRNA都进入了后生韧皮部，这还有待说明。 本研究表明，许多低于70kD的大分子物质通过默认的途径进入韧皮部，我们的生物信息学分析也支持这一观点。当菟丝子侵染拟南芥，宿主一半的转录本通过韧皮部进入病原菌。从信号传输的

21、角度看，这一水平的运输并不重要，而表现出在两个物种间大规模的大分子物质交换，这与本试验中蛋白穿过嫁接结合体的报道类似。当植物遭到菟丝子侵染，韧皮部汁液在此处收集，大分子物质也被截取，从而不能到达韧皮部末端的后生韧皮部。因此，它们在易位流中不足以说明它们在流中的作用。在韧皮部汁液中发现的大量蛋白和mRNA中，其中一些很可能是选择的而不是默认的。将来从伴胞产生的所有物质中鉴定此类系统信号是一个艰巨的工作。长距离运输：进入易位流还是停留在胞间连丝？近来，Paultre利用拟南芥嫁接做了一个突破性研究，就是接穗表达结合了信号肽的荧光蛋白，能够在野生型的根部卸载。这一发现表明，在伴胞中形成的标签蛋白能够

22、通过胞间连丝孔隙单元（PPUs）进入筛管分子，并能与韧皮部易位流穿过嫁接结合体进入根部。这些可移动的多肽与韧皮部渗出液发现的蛋白质使作者得出以下结论：伴胞既定的将可溶性的标签蛋白进入易位流。然而，得出这一结论尚早，韧皮部切口造成压力释放，来自伴胞的大分子可能污染易位流，也就解释了这些蛋白存在于韧皮部中。事实上，我们发现伤口产生的压力对筛管分子和伴胞都有影响，通过比较韧皮部渗出液与完整对照的超微结构。另外，需要进一步实验排除以下因素：过表达，细胞内结合位点的饱和度，缺乏被胞间连丝识别标签蛋白，这些可以导致污染韧皮部易位流和信号肽进入根部。伴胞形成大分子的移动性大分子物质进出韧皮部是如何控制的？几

23、十年来一直没有解决。筛管分子与伴胞由筛孔相连，这些筛孔在伴胞的一侧又分支出许多胞间连丝，叫作胞间连丝孔隙单元（PPUs）。这些PPUs在伴胞和筛管之间形成决定性的界面，一侧是静态的伴胞，一侧是动态的易位流。这是韧皮部装载和运输的先决条件，在叶脉韧皮部PPUs能够自由地运送糖和其他小分子。然而，活性韧皮部的载荷同时取决于在伴胞形成的丰富能量成份（分别是UDP-半乳糖和ATP）。在韧皮部汁液中检测到植物激素、核苷酸、质量和半径较小的分子物质，但是还不清楚什么调控它们的进入和排出韧皮部。在长距离信号传输中，一个有趣的问题就是细胞质蛋白或者靶向细胞核或其它细胞器的蛋白能否自由的通过PPUs。在最近的研

24、究中，Paultre通过实验解决了这一问题。作者通过拟南芥嫁接检验结合了GFP标签的转运肽能否再韧皮部中移动。嫁接是检测韧皮部移动的金标准，因为它可以辨别长距离运输来的给定大分子物质。用这种方法，前人研究发现在葫芦科中的P蛋白PP1和PP2能在韧皮部中移动。嫁接也首次提供证据表明选择的RNA和RNA结合蛋白能在韧皮部中移动。Paultre在接穗表达结合了强启动子的标签蛋白，并检测能否在非转基因砧木中出现。惊奇的是，大部分多肽不仅穿过嫁接的界面并且从韧皮部卸载，还能够靶向报告蛋白到根尖中柱的质体、细胞核和过氧化物酶体。卸载最大的是丝束蛋白的细胞质肌动蛋白结合域2，有67kD。（在肌动蛋白丝之间形

25、成横桥，使肌动蛋白丝连接成紧密的束）相比之下，靶向分泌途径的荧光蛋白没有穿过嫁接结合体。作者得出以下结论，细胞器靶向的和细胞质蛋白持续进入易位流，使得辨别系统的韧皮部信号充满挑战。文章提出了以下问题，伴胞中任何给定的细胞质大分子能否非特异的进入筛管？或者，PPUs可能有一种机制，选择保留一些大分子或者允许其它进入韧皮部。文章确实表明，选取的报告蛋白能够进入韧皮部，这仅涉及选择性保留的问题。这个问题值得深入研究，对其评论如下。内在蛋白保留在伴胞，而没有从伴胞中释放存在以下条件时，伴胞形成的蛋白倾向于进入长距离的运输流。1.在细胞质核糖体中高表达；2在伴胞中细胞内靶标的结合位点是饱和的；3不能被P

26、PUs识别并且分子质量比扩散上限小。很显然，Paultre报道的能在韧皮部移动的信号肽满足以上条件。1，受35S和SUC2启动子调控，标签转运肽在转基因茎部高表达。检测的转运肽，没有一个在自身启动子下表达。2，选择的多肽主要引导荧光蛋白到目标细胞器，并结合上相应的导入受体。与光合作用相关的叶绿体蛋白（FNR，质体蓝素，RBCS1a），可能是TOC159受体，它引导蛋白前体到易位子TOC75。（易位子是位于内质网膜上的与新合成的多肽进入内质网有关的蛋白复合体）过表达的转运肽与细胞内高丰度的光合作用相关的蛋白前体可能导致缺乏结合位点。当过表达H2B-GFP和丝束蛋白肌动蛋白结合位点很可能分别使核定

27、位信号受体和G-actin饱和。奇怪的是，来自DNA修复蛋白靶向叶绿体的RecA同源物1多肽在根尖没有检测到。和其它管家质体一样，它可能结合了TOC132受体而不是TOC159。可以推测，细胞内的蛋白前体很少占用TOC132，因此它能结合RecA的信号肽并使其留在伴胞中。3，如果PPUs对大分子物质有保留机制，它就不肯能识别自由的荧光蛋白或者那些带有N端转运肽：即伴胞中低于67kD受SUC2启动子调控的荧光蛋白。由于是结合了荧光蛋白的信号肽，从而能够在根部韧皮部卸载。然而，这些转运肽的转录本不能通过RT-PCR检测到，表明mRNA留在伴胞中。因此，可以这样解释Paultre的结果，就是在基因表

28、达水平和可用性的细胞内结合位点的不平衡，或缺乏PPU保留蛋白在伴胞中的信号，这种信号可以区分伴胞的内在蛋白与其它蛋白。PPUs能够控制细胞内大分子物质的输出伴胞不能承担细胞质蛋白持续往韧皮部输出。然而，一个特殊的开门机制可以为蛋白单体打开PPU的通道，这些单体需要在筛管中周转，例如PP1和PP2（分别88和24kD）。这些蛋白的转录本定位在伴胞，并且任何进入易位流的蛋白都能通过伴胞的转录和翻译得到补充。RT-PCR证实，是蛋白质而非转录本穿过嫁接界面。后来发现，例如开花蛋白FT的移动，而不是它的转录本，这可以用PPUs的开门机制解释，PPUs保留特定的大分子（例如PP1和PP2转录本），但是允

29、许其它分子的通过（例如PP1和PP2单倍单体，FT,CmPP16蛋白，CmPP16或者CmNACP转录本等）CmPP16蛋白是在南瓜中发现的一种类病毒运动蛋白它(们)可以非序列特异性的结合RNA分子(也包括其自身的mRNA),形成核糖核蛋白复合物,并且具有扩大胞间连丝运输通道的作用,从而完成其系统性运输,在植物的系统发育及信号转导过程中发挥重要作用PPU的过滤机制可能受到质疑，因为在拟南芥嫁接体中鉴定到大量的移动mRNA。然而，移动RNA从伴胞到易位流直接或间接的通过tRNA类结构体。例如FT蛋白重伴胞的输出依赖于定位在内质网和胞间连丝的FTIP1蛋白的存在。给定的关于韧皮部内在运输大分子物质

30、的案例中，表明PPUs存在通过机制，控制着大分子物质从伴胞到筛管，或者可能相反的方向。韧皮部蛋白组数据包含筛管和伴胞的蛋白Paultre分析了蛋白组数据，以反驳这种观点，进入韧皮部并达到根尖的标签蛋白仅仅是因为它们在伴胞中过表达。这些数据来自激光显微解剖和渗出液。在其它蛋白组学的研究中，切割韧皮部并用EDTA促进汁液渗出，然后收集渗出液。数据分析表明存在分子质量较小的蛋白（小于70kD）。作者把分子量小、高表达的蛋白与其在筛管中发现的可能性做分析，表明移动蛋白代表了小蛋白从伴胞到筛管的日常转运。这些数据是有争议的，因为显微解剖技术不能区分筛管分子，伴胞和韧皮部薄壁细胞产生的蛋白质，并且渗出液很

31、容易受到伴胞组份的污染。即使用滤纸去除了第一滴渗出液（这些汁液可能来自切口处的其它细胞），伴胞的成份可能间接污染渗出液。可以这样认为，丧失的渗透压，汁液在筛管上游扩散，几乎同时导致附近伴胞的压力释放，随后伴胞组份进入筛管。所有关于韧皮部蛋白组的文章讨论了，在韧皮部中发现的蛋白来自伴胞的可能性，尤其是与保存能量、蛋白合成、核定位相关的蛋白。这些蛋白被认为在伴胞中很丰富，而不会在筛管中存在，因为筛管中没有细胞核、蛋白合成的细胞器、高尔基体、叶绿体和液泡。然而，基于蛋白质组学的分析，Lin猜测一些蛋白可能再筛管中合成，筛管甚至可能含有高尔基体、核内体（指的是一种真核细胞中的膜结合细胞器，属于一种囊泡

32、结构）和较小的液泡。这一假设既不能被在最佳条件下拍摄的电子显微照片证实，也不能被渗透液抑制核糖体活性的这一事实支持。这使得样品制备过程中伴胞的组分进入筛管，这些组份很可能是上述蛋白的主要来源。切口的压力释放影响筛管分子和伴胞为了观察突然的压力释放影响筛管和伴胞，我们研究了蓖麻幼苗渗出时的超微结构。当切割韧皮部，亚麻渗出同时发生。参考前人的研究，我们固定渗出的幼苗和对照。和其它破坏性的制备方法一样，固定可导致韧皮部渗透压丧失，从而切口处会有人为因素产生的杂质。因此，我们固定维管束的方法通常在植入之前去除纵向的末端部分，从而减小远离切口处韧皮部人为造成的改变。图1A展示了对照的典型韧皮部超微结构：筛管是电子半透明的，它的细胞器在细胞的边缘而不是覆盖筛板。这个筛管有5个伴胞，内有球形的细胞核，明显的核仁，以及比邻近的薄壁组织的细胞质密度稍高。图1B呈现了切口1.15mm远的筛管，它们受到挤压，3个伴胞任意的占据其它空间。每一个伴胞都是质壁分离的，远离筛管-伴胞界面的细胞质膜向内收缩（1B星号），稠密的细胞质趋向筛管。筛管两侧覆盖胼胝质，没有使孔道压缩，孔道充满着P蛋白细纤丝（1C箭头）。1D展示的是切口0.25mm远处的伴胞，其超微结构的改变包括 细胞核的性状从球形到瘦长并凹陷，线粒体密度降低，细胞质和内质网