细胞培养完整手册.docx

1、细胞培养完整手册细胞培养完整手册常用设备 准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、 PH 计（测量培养用液 PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备： 液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（ -80 ）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、 CO2 孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、 4 冰箱（放置 serum 和培养用液）。无菌操

2、作基本技术 无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用 3 来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5 过氧乙酸擦拭。2.CO2 孵箱（培养箱）灭菌：先用 3 新洁尔灭擦拭，然后用 75 酒精擦拭或者 0.5 过氧乙酸，再用紫外灯照射。3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟 。4.实验后灭菌：用 75 酒精（ 3 新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 5.定期检测下列项目：钢瓶之CO2 压力；CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；无菌操作台内之airflow 压力，定

3、期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。 2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75 酒精棉球擦净双手。 无菌操作的演示： 1.凡是带入超净工作台内的酒精、 PBS 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 酒精擦拭瓶子的外表面 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6.吸取两种以

4、上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消： 一、新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。 2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5 稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。 3.刷洗、烘干： 12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g ：浓硫酸 200ml ：蒸馏水 1000ml ）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。 5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消毒：包装好的器

5、皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向 15 磅 时，维持 20-30 分钟。 7.高压消毒后烘干 二、旧的玻璃器皿的洗消： 1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。 2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液）， 12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗 3 次。 3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。 4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖

6、好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向 15 磅 时，调节电开关维持 20-30 分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上） 5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75 酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅 高压（ 30 分钟）消毒，再烘干备用。 橡胶和塑料： 橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和

7、蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1.针式滤器帽不能泡酸液 , 用 NaOH 泡 6-12 小时 , 或者煮沸 20 分钟 , 在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上 ( 凹向上 ) ，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内 15 磅 30 分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 2.胶塞烘干后用 2 氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟（用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 3.胶帽，离心管帽烘干后只能在

8、 2 氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 4.胶头可用 75 酒精浸泡 5 分钟，然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶，培养板，冻存管.6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70 酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用 23 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000100000rad 的 r 射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒

9、发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻 (CoC126H2o) 2g ，30盐酸 10m 1，蒸馏水 88m1 。注意事项： 1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡： A. 泡酸时要戴耐酸手套，防

10、止酸液溅起伤害人体。 B. 从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。 C. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止 泡酸不彻底。细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 PH 计、磁力搅拌器。 具体步骤：一、水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。二、PBS 的制备与消毒 ( 也可用于其它 BSS ，如： Hanks ， D-Hanks 液的配制 ) ：1.溶解定容：将药品（ NaCl 8.0g ， KCl 0.2g ， Na2HPO4H2O 1.56g ， KH

11、2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml ，摇匀即成新配制的 PBS 溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅 消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为 37 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时

12、间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 ，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右）或 PBS （ D-hanks ）液中。搅拌混匀，置于 4 内过夜。 2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（ 0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于 -20 保存以备使用。四、

13、抗生素溶液的配制1.所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅 高压 20 分钟灭菌。 2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位 / 瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位 / 瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。 3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml 。 1 单位 1 微克？ 4.细胞库之细胞培养基不加抗生素 5.培养自ATC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。6.培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通 过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。7

14、.寄送活细胞时，须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml +streptomycin 100 ug/ml) 8.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。9.去除细菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml 注意混合使用后药物毒性会增强。10.抗生素使用种类与浓度：工作浓度.

15、储存温度. 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fun

16、gizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds 五、RPMI1640 的制备与消毒：1.溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 ( 冲洗液一并加入培养基中 ), 充分搅拌至粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位 /ml 。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml ，摇匀。 2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤

17、器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4 冰箱内待用。 5.使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4 时两周有效）。六、血清： 1.血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56 水浴中灭火 30 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。 血清必须贮存于20 -70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，必须预留此膨胀体积

18、之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 3.瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 或70 至4冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般 50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡 ，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由 直接 至 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4.heat-inactivation 是指56 , 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目

19、的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagytosis, chemotaxis and activation of lymphytic and macrophage cell type。5.勿将血清置于太久，若在 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较

20、不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。 6.血清之沉淀物 6.1 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性 及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。6.2 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是小黑点 ，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在中欲培养此微生物“，但

21、在37 环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品应立即停用，更换另一批号的血清。七、HEPES 溶液： HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（ N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH 范围。使用终浓 度为 10-50mmol/L ，一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下：准确称取 HEPT

22、S 238.3g ，加入新鲜三蒸水定容至 1L 。过滤除菌，分装后 4 保存。 注意：因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如：称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，过滤除菌后可完全（ 20ml ）加入 1L 培养液中，或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。 八、谷氨酰胺： 合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨

23、酰胺在溶液中很不稳定， 4 下放置 1 周可分解 50 ，故应单独配制，置于 -20 冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在 4 冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 1 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶， -20 保存，使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。 九、肝素溶液的配制： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液

24、中最终浓度为 50ug/ml 。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 0.56 克 / 瓶，配制时，可将其溶于 100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 。使用时，向 100ml 培养液中加入 1ml （精确可加入 0.9ml ）即可。 十、型胶原酶： 0.1 型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为 型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶 -20 保存。 十一 、明胶溶液： 因为明胶难于过滤，所以配制 0.1 明胶溶液必须用无菌的 PBS 配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确

25、称量 0.1 克 （配成 100ml 溶液） 即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是 01. 的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入 50ml 小瓶中， 4 保存。注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对

26、开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程

27、度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。

28、细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（I

29、mmortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?196，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 细胞原代培养 一、原理将动物机体的各种

30、组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 ?uD3 二、仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至 37），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37）材料：胎鼠或新生鼠试剂：1640培养基（含 20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒三、操作步骤（一）胰酶消化法1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置 75%酒精泡 23秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（

31、或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。2、用 Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。附：Hanks液配方：5m KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4H2O 0.06g，加 H2O至 1000mlG1 注：Hanks液可以高压灭菌。4下保存。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用 Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入 56倍的 0.25%胰酶液，37中消化 2040分钟，每隔 5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。5、加入 35ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。6、静置 510分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7、1000rpm，离心 10分钟，弃上清液。8、加入 Hanks液 5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9、加入培养液 l2 ml（视细胞量），血球计数板计数。10、将细胞调整到