实验方案.docx

1、实验方案实验方案1金沈锐,祝彼得,秦旭华,瞿燕.不同制备方法对西黄丸体外抑瘤作用影响的比较研究J.时珍国医国药,2008,18（7）:1735-1737.研究不同制备方法对西黄丸体外抑瘤作用的影响。方法采用3种制备方法, 即西黄丸浸提液、煎液、含药血清, MTT法分别测定其对两种人恶性肿瘤细胞株(人原发性肝癌细胞株SMMC7721、人早幼粒细胞白血病细胞株H L-60)增殖的影响，发现不同的制备方法对西黄丸体外抑瘤作用有明显的影响, 西黄丸浸提液和煎液均具有明显的抑瘤作用, 且浸提液的抑瘤作用优于煎液, 古人将西黄丸定位于丸剂, 确有其合理性和科学性。2戴一.西黄丸的药理作用及临床应用概况J.

2、 药物评价研究,2012,35（6）:473-476.西黄丸原名犀黄丸，出自外科证治全生集卷四，是清代名医王洪绪的祖传秘方。犀黄丸由牛黄、麝香、乳香、没药4 味中药粉碎研配以水泛丸而成，清热解毒、和营消肿，用于痈疽疔毒、瘰疬、流注、癌肿等。3金沈锐,秦旭华,肖桦,陈洁,秦健. 西黄丸对荷瘤小鼠生存质量的影响J. 中药药理与临床,2011,27（1）:7-8.采用体内研究方法,考查其对荷瘤小鼠生存质量的影响, 包括观察荷瘤动物一般情况, 计算荷瘤小鼠生存率和生命延长率。1.1试验药物西黄丸,九寨沟天然药物集团有限公司生产,批号: 080401,实验时用蒸馏水配制为混悬液予动物灌胃;注射用环磷酰胺

3、( 0.2g /瓶), 山西普德药业有限公司,批号20080807, 临用前用蒸馏水新鲜配制。1.2动物昆明种小鼠, SPF级,体重18 22g小鼠,雌雄兼用,由成都中医药大学实验动物中心提供, 动物合格证号SCXK( 川2004-11)。1. 3 细胞株小鼠肝癌细胞株H22、小鼠艾氏腹水瘤细胞株EAC,均由成都中医药大学病理教研室提供。1.4 方法将液氮冻存小鼠肝癌H 22瘤株进行复苏, 经体外培养增殖, 生长稳定后以5106 细胞量接种于昆明小鼠腹腔内, 待其长出癌性腹水后传代培养至3代, 取小鼠无血性的癌性腹水, 供接种使用。实验时将第3代的肿瘤小鼠癌性腹水用无菌生理盐水调整细胞数至51

4、06, 接种于昆明种小鼠腹腔注射接种( 每只注射0.2m l)。取体重为18 22g的小鼠(每次实验使用同一性别的小鼠), 常规消毒后每只小鼠腹腔注射H 22瘤液或EAC 荷瘤小鼠接种, 接种后次日, 将动物称重并分层随机分为4组, 分别为模型对照组、西黄丸高、低剂量组及环磷酰胺组。西黄丸各组给予西黄丸混悬液灌胃, 低剂量组给药剂量为1.08g /kg(西黄丸每日人用量6g, 以50kg 为正常人体重计算, 给药量相当于人用量9倍) , 高剂量组给药剂量为2.16g /kg (相当于人用量18倍), 环磷酰胺组予0. 02g /kg 环磷酰胺灌胃给药,模型对照组予等体积生理盐水灌胃。每日灌胃给

5、药1次, 连续10天后停药。观察动物的一般情况, 包括毛色、活动度、进食量、体重等, 并记录动物在接种肿瘤后的死亡时间。以对照组20%动物存活时间不得超过4周为依据, 故设第29天终止实验, 并计算小鼠生命延长率。抑瘤作用是西黄丸的主要药理作用，实验显示1.08、2.16 g/kg 剂量下西黄丸对H22荷瘤小鼠及EAC荷瘤小鼠的生存状态明显好于环磷酰胺组（0.02g/kg），同时，西黄丸在2.16 g/kg 剂量下，可明显延长荷瘤小鼠的生存时间，生命延长率可达30%以上。4徐浩,崔立然,刘吉成. 西黄丸对H_(22)荷瘤小鼠Bcl-2基因mRNA表达的影响J. 现代预防医学,2011,11:2

6、120-2121.本实验采用RT-PCR 法测定H22荷瘤小鼠瘤组织中bcl-2基因mRNA在给药前后的表达差异，为传统中成药西黄丸临床上治疗肿瘤提供更科学的理论依据。进一步研究发现西黄丸可下调H22 荷瘤小鼠瘤组织中凋亡相关基因bcl-2 基因mRNA 的表达。1.2 动物选用清洁级昆明种（KM） 小鼠， 体重（20 2） g， 68周龄，雌雄各半，黑龙江中医药大学药物安全评价中心（GLP）提供合格证号： 01-10-2。1.3 瘤株H22瘤株由齐齐哈尔医学院药物研究所提供。1.4 主要仪器及试剂离心机（Microfuge 18 Centrifuge， BECKMAN COULTER，德国）

7、； 超净工作台（苏州净化设备厂）； 可见 紫外分光光度计（765PC 型上海光谱仪器有限公司）； 电泳凝胶图象分析系统（ Backman 公司） ； 梯度PCR 仪（ EPPERFOR2002 型德国）； RT-PCR 试剂盒（美国Promega 公司）；PCR Marker 美国Promega 公司）；bcl-2、-actin 的引物（英骏生物技术有限公司合成）。1.5 实验方法1.5.1 分组及给药超级洁净工作台上无菌取接种于d 8 转移癌H22腹水（活细胞计数大于95%）， 用0.9氯化钠注射液稀释成2106 ml， 取清洁级KM 小鼠雌雄各半，共40 只，每只鼠右侧腋部皮下接种0.2

8、ml瘤细胞悬液。于接种24 h 后随机分4 组， 模型组（0.9%氯化钠注射液（LHN） ig 0.2 ml 10 g d， ip LHN） ； XHW 组（XHW ig 0.2 ml 10 g d， ip LHN） ；CTX 组（LHN ig 0.2 ml 10 g d， ip CTX 30 mg kg d）； 联合用药组（XHWCTX 组） （XHW ig 0.2 ml 10 g d， ip CTX 30mg kg d）， 连续给药10 d， 末次给药后禁食12 h， 颈椎脱臼处死， 以75%乙醇浸泡消毒后剥离瘤组织， 置于液氮中保存备用。1.5.2 RT-PCR 检测荷瘤小鼠bcl-2m

9、RNA 的表达按总RNA提取试剂盒操作步骤， 从100 mg 瘤组织中提取总RNA。取1l RNA 样品， 加入DEPC 处理水稀释至50 l， 混匀后加入比色杯中。在260 nm 和280 nm 分别3 次读取吸光度值， RNA纯度以OD260 OD280的比值表示。逆转录反应以总RNA 1 g 为模板， 分别加入10 mmol L dNTP 2.0 l、5 mmol L MgSO4 1.5l、25 buffer 4.0 l、AMV （逆转录酶） 1 l， 加DEPCH2O至终体积为20 l 并混匀。优化后的逆转录条件为42 1 h，合成第一条cDNA 链。分别取逆转录所得1、2、3、4 号

10、cDNA模板各2.0 l， 与bcl-2 及-actin 的上下游引物（表1） 各0.5 mol L 配制成25 l 的PCR 反应体系， 加入到96 孔板中，1、2、3、4 四个样本各设置6 个复孔， 加入循环参数为945 min， 然后94 30 s， 58 40 s， 72 50 s，共40 个循环，最后72延伸10 min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳并与DNA 标准分子量比较鉴定之后， 在数字成像仪上照相、扫描分析。5马杰,王一尧,杨伟,关硕,曾常茜,高文斌,梁文波. 西黄丸抗肿瘤作用及其免疫清除功能的实验研究J. 中国中药杂志,2014,39(8):163-165.目的:

11、探讨西黄丸对荷瘤大鼠的抗肿瘤作用及其对荷瘤机体免疫清除功能的影响。方法: 采用Walker256 建立大鼠荷瘤模型，随机分为空白对照组、模型对照组、香菇多糖组、西黄丸低、中、高剂量组，每组10 只。造模后连续治疗给药14d。腹主动脉取血，取瘤，计算抑瘤率; 采用流式细胞技术( FCM) 检测外周血中CD3 + ，CD4 + ，CD8 + T 细胞及黏附分子B7-1( CD80) 的含量; ELISA 测定外周血IL-2， IFN- 表达水平。结果: 西黄丸高剂量组抑瘤率为33. 1%; 与对照组比较，模型组大鼠外周血中IL-2， IFN- 水平及CD3 + ，CD4 + ，B7-1 含量明显降

12、低，差异有统计学意义( P 0. 05) ; 与模型组比较，西黄丸高剂量组大鼠外周血中IL-2， IFN- 水平及CD3 + ，CD4 + ，B7-1 含量增高( P 0. 05) 。结论: 西黄丸可通过提高外周血IL-2， IFN- 水平及CD3 + ，CD4 + ，B7-1 含量，增强免疫清除功能，发挥其抗肿瘤作用。6王志宏,王中霞,刘超,欧阳兵,李峰,王文苹,吴超,季旭明. 西黄丸滴丸抗肿瘤作用及对免疫功能的影响J. 山东大学学报(医学版),2013,04:18-20.摘要: 目的研究西黄丸滴丸抗肿瘤作用及对免疫功能的影响。方法将H22荷瘤小鼠模型分为模型组、西黄丸组、西黄丸滴丸不同剂量

13、组，干预10 d 后，测定各组小鼠的脾指数和胸腺指数，ELISA 法测定小鼠血清中TNF-、IL-1、IL-6、INF- 含量。结果西黄丸滴丸低、中、高剂量均对H22荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用，其抑瘤率分别为6245%、7061%、7693%; 各剂量西黄丸滴丸均能提高免疫器官的质量及血清中TNF-、IL-1、IL-6、INF- 含量。结论西黄丸滴丸具有明显的抑制肿瘤生长和增强机体免疫功能作用。1 材料与方法1 1 材料1 1 1 实验动物与瘤株昆明种小白鼠，体质量18 22 g，雌雄各半，山东中医药大学实验动物中心提供，SPF 级实验室喂养; 腹水型小鼠肝癌H22细胞株购自山东省医学科学院药

14、物研究所。1 1 2 实验药物与试剂西黄丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号: Z11020073; 西黄丸滴丸( 自制) ; 环磷酰胺( CTX) ，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号: 100231-201203。TNF-、IL-1、IL-6、INF-ELISA 试剂盒购自上海研辉生物科技有限公司。环磷酰胺是广泛应用的抗癌药物之一，治疗恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、尤文瘤、软组织肉瘤.1 2 方法1 2 1 西黄丸滴丸的制备工艺条件为PEG8000PEG10000 = 11 作为基质，药物与基质比为11 5，二甲基硅油100 作为

15、冷却剂，冷却剂温度采用梯度冷却方式( 上部温度30 ，下部温度0 5 ) ，药液温度75 ，滴速20 25 滴/min，滴距为4 cm。称取一定量的基质， 75 熔融后加入采用超临界CO2提取技术提取的乳香、没药中有效成分挥发油及超微粉碎技术制得的牛黄麝香粉末，混匀后滴制。1 2 2 移植瘤模型的建立无菌环境下，抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，生理盐水稀释，调整细胞浓度为( 2 3) 107 /mL，测定细胞活力，活细胞率95%。每只小鼠右腋下接种0 2 mL。1 2 3 西黄丸及滴丸对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用接种24 h 后，将小鼠随机分为6 组: 模型组，西黄丸组( 22 g /kg) ，滴丸

16、低、中、高剂量组( 15、3 0、60 g /kg) ，CTX 组( 20 mg /kg) ，每组10 只。西黄丸及滴丸各剂量组灌胃给药，模型组给予等容量生理盐水，每日1 次; CTX 组腹腔注射，每2 天1 次。给药10 d。停药次日脱颈椎处死荷瘤小鼠，剥离瘤块，称瘤质量，计算抑瘤率。抑瘤率( %) = ( 对照组平均瘤质量 治疗组平均瘤质量) /对照组平均瘤质量 100%。1 2 4 西黄丸及滴丸对小鼠免疫功能的影响按照上述方法制备荷瘤小鼠，分5 组给药干预: 模型组，西黄丸组( 2 2 g /kg ) ，滴丸低、中、高剂量组( 1 5、3 0、6 0 g /kg) 。西黄丸及滴丸各剂量组

17、灌胃给药，模型组给予等容量生理盐水，每日1 次，连续10 d，末次给药24 h 后摘眼球取血，静置4 h，3 000 r /min离心15 min，取血清置于 20 保存。采用ELISA法按照试剂盒操作说明书测定血清TNF-、IL-1、IL-6、INF- 含量。分离脾脏和胸腺，电子天平精确称量脾脏和胸腺的质量，计算每克体质量的脾指数和胸腺指数。7唐曦,胡娅,胡国清. 西黄丸与氟尿嘧啶联合应用的抗肿瘤作用J. 医药导报,2005,24(9):757-759. 摘要目的 研究西黄丸与氟尿嘧啶( 5Fu)联合应用对小鼠移植性肿瘤S180肉瘤生长的抑制作用。方法 小鼠S180细胞接种于昆明种小鼠右前肢

18、腋窝皮下, 建立S180实体瘤模型小鼠60只, 随机分为4组: 阴性对照组( 灌胃并腹腔注射0.9%氯化钠注射液)、西黄丸组( 2.0g /kg􀀁1, ig )、5Fu组( 0. 02 g/ kg 1, ip) 、联合用药组( 西黄丸, 2.0 g/ kg 1,ig; 5Fu, 0. 02 g/kg1, ip)。小鼠接种后开始给药, 每天1次, 连续7 d。观察各组小鼠移植瘤生长情况及体重变化。停药后第2天处死小鼠, 称瘤重, 计算瘤重抑制百分率。结果西黄丸组抑瘤率28.1%, 5Fu组抑瘤率35.3%, 联合用药组抑瘤率55. 4%,与阴性对照组比较,差异均有显著性(P 0

19、. 05); 联合用药组抑瘤率高于单用西黄丸或5Fu组(均P 0. 05)。结论 西黄丸和5Fu联合应用对小鼠移植性肿瘤S180有明显抑制作用, 两者有协同作用。1􀀁 材料与方法􀀁1. 1􀀁 材料􀀁 动物: 昆明种小白鼠, 雌性, 体重18 22g, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。试剂: 西黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂, 批号: 3030472), 5Fu(天津金耀氨基酸有限公司,批号: 0403312)。移植性肿瘤: 肉瘤S180, 华中科技大学同济医学院药学院肿瘤研究室提供, 昆明种小鼠腹腔传

20、代。1. 2􀀁 方法1. 2. 1􀀁 小鼠荷S180肉瘤模型的建立选择接种后10d、一般状况较好的瘤种动物, 仰卧固定, 消毒皮肤, 抽取腹腔积液, 以0. 9% 氯化钠注射液稀释, 计数, 调整细胞浓度至2. 0 107 mL 1, 于小鼠右前肢腋窝皮下接种S180细胞悬液0. 2 mL。1. 2. 2􀀁 实验动物分组与给药方法􀀁 昆明种雌性小鼠60只, 称重后随机分为4组, 每组15只。从接种次日开始给药, 3个药物组分别按以下3种方式给药, 西黄丸组: 按2.0 g/kg 1剂量灌胃给药; 5Fu 组: 按0. 02

21、 g/kg 1剂量腹腔注射给药; 联合用药组: 灌服西黄丸2. 0 g/kg 1, 同时腹腔注射5Fu 0.02 g/kg1。阴性对照组每天灌服并腹腔注射等体积的无菌0. 9%氯化钠注射液。每天给药1次, 连续7 d, 每天记录体重, 停药后第2天将各组动物称重并断髓处死, 钝性剥离瘤组织, 电子天平称重。1. 2. 3􀀁 检测指标 动物体重、瘤重, 计算肿瘤抑制率。瘤重抑制率(% ) = (阴性对照组平均瘤重- 药物组平均瘤重) / 阴性对照组平均瘤重100%1. 2. 4药效评价􀀁 阴性对照组小鼠肿瘤平均重量 20% 小鼠瘤重 20%, 或平均体重(去瘤

22、后)下降 15%, 表明该药物有毒性反应。如所试药品肿瘤抑制率 30% , 并经统计学处理差异有显著性时, 认为有效 5 。5Fu是临床常用的抗肿瘤药, 对多种消化系及头颈部肿瘤等有较好的治疗作用, 但其毒性反应较大, 其常见的不良反应有消化道反应、骨髓抑制、肝功能损害等。8王玉荣,曾繁涛,罗意文.西黄丸对细胞突变与肿瘤生长抑制的研究J.宜春学院学报,2008,30(4):99-100.摘要: 目的: 探讨西黄丸的抗突变和抗肿瘤作用。方法: 以小鼠骨髓细胞微核试验和睾丸染色体畸变实验观察西黄丸的抗突变作用; 以S- 180和H - 22移植性肿瘤观察西黄丸的抗肿瘤作用。结果: 西黄丸对环磷酰胺

23、诱发的小鼠骨髓细胞微核和丝裂霉素诱发的小鼠睾丸细胞染色体畸变均有明显的抑制效果; 对S- 180和H - 22小鼠移植性肿瘤生长有明显的抑制作用。结论: 西黄丸对体细胞和生殖细胞的DNA 损伤均有较好的保护作用;对小鼠移植性肿瘤较好的抑瘤作用。本研究以小鼠骨髓细胞微核率和小鼠睾丸染色体畸变率及对S- 180和H - 22小鼠移植性肿瘤的瘤重变化为观察指标, 对西黄丸的抗突变和抑制肿瘤细胞生长的作用进行研究, 以期为与其他抗癌药物的药效学作比较奠定基础。1 材料与方法1.1􀀁 实验材料: 西黄丸(通化金马药业股份有限公司, 批号: 20070821)。试验动物为昆明种小鼠, 由

24、广东省医学实验动物中心提供, 合格证号: 2006A018; S- 180和H - 22瘤细胞株均购自中国医学科学院药物研究所。1.2􀀁 实验方法1.2.1􀀁 小鼠骨髓细胞微核试验健康昆明种雄性小鼠40只, 体重为20 22g, 随机分为4组, 阳性对照组和西黄丸高、中、低3个剂量组, 每组10只。西黄丸高、中、低剂量分别为0.4g /kg、0.2g /kg、0.1g /kg, 经口灌胃, 连续21d, 对照组同时以蒸馏水灌胃。试验末期( 最后2d), 西黄丸各组及阳性对照组经口给予致突变物环磷酰胺( 40mg /kg体重) 2次( 中间间隔24h) 。第2

25、次给予环磷酰胺后6h颈椎脱臼法处死小鼠, 取股骨骨髓常规制片, 每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞,计数微核率,以表示。结果采用泊松分布统计法处理。1.2.2小鼠睾丸染色体畸变试验1健康雄性小鼠40 只,体重为20 22g, 分组和受试物剂量均同小鼠骨髓细胞微核试验, 经口灌胃, 连续21d, 第14d西黄丸各组及阳性对照组经口给予丝裂霉素( 2􀀁0m g /kg􀀁 体重) 1 次, 西黄丸各组继续给予受试物7d后处死动物, 处死动物前6h 腹腔注射秋水仙素( 4.0m g /kg), 取动物双侧睾丸, 去被膜, 分离曲细精管, 用0.1%的柠檬酸钠低渗,

26、甲醇和冰醋酸( 3: 1)固定, 制片, G im ese 染色, 油镜镜检各组分散良好的初级精母细胞畸变率, 结果采用泊松分布统计法处理。1.2.3􀀁 西黄丸对S- 180小鼠抑瘤试验雄性昆明种小鼠, 体重20 22g。实验动物随机分为阳性对照组和西黄丸高、中、低3 个剂量组, 每组10只动物, 西黄丸高、中、低剂量分别为0.4g /kg、0.2g /kg 、0.1g /kg, 经口灌胃, 阳性对照组同时以蒸馏水经口灌胃。连续14d。第15d, 在无菌条件下, 于右侧腋窝皮下接种S- 180肿瘤细胞悬液5 106 细胞0.2m ,l 接种后, 各组继续按前法灌胃, 7d 后

27、, 颈椎脱臼处死小鼠, 取出瘤体称重,结果采用单因素方差分析统计处理。1.2.4􀀁 西黄丸对H - 22小鼠抑瘤试验雄性昆明小鼠, 体重20 22g, 动物分组和剂量同西黄丸对S- 180小鼠抑瘤试验。经口灌胃, 第15d在无菌的条件下, 于右侧腋窝皮下接种H - 22 肿瘤细胞5 106 细胞0.2m ,l 接种后各组继续前法灌胃, 7d后, 颈椎脱臼处死小鼠, 取出瘤体称重, 结果采用单因素方差分析统计处理。中药抗肿瘤作用的有效成分, 可能是通过直接抑制肿瘤细胞的增殖 2 、抑制多种促肿瘤细胞生长激素和细胞因子释放 3 、抑制肿瘤血管生成4 和诱导肿瘤细胞调亡 5 , 从

28、而达到抗肿瘤作用, 其确切机制有待进一步研究。9李晓丽,宋振华. 加味保安方对带瘤C57小鼠肿瘤及肺组织VEGF表达水平的影响J. 江西中医学院学报,2007,19(4):70-71.摘要: 目的: 探讨加味保安方对Lw eis 肺癌C57 小鼠肿瘤和肺组织的VEGF 表达水平的影响。方法: 将Lweis 肺癌C57 小鼠分为加味保安方大、小剂量组, 西黄丸对照组, 模型组, 观察各组对Lw eis 肺癌C57 小鼠对肿瘤和肺组织的VEGF 水平的表达。结果: 加味保安方大、小剂量及西黄丸均抑制Lw eis 肺癌C57 小鼠肿瘤及肺组织的VEGF 水平的表达( P 0. 05) , 尤其是加味

29、保安方大剂量作用明显, 与西黄丸相当。结论: 加味保安方能明显降低Lweis 肺癌C57 小鼠肿瘤及肺组织的VEGF 水平的表达。探讨本方抗肿瘤转移的机制, 对带瘤C57小鼠瘤组织及肺组织VEGF 表达水平的进行了实验研究, 报道如下。1 实验材料1. 1 实验药物 加味保安方: 生大黄、干姜、炮附子、醋制鳖甲、冬凌草。西黄丸: 牛黄, 乳香( 醋制) , 没药( 醋制) , 麝香。吉林金泉药业股份有限公司生产。产品批号20030401。1. 2 实验仪器、试剂 RNA 提取试剂盒: MBI 公司。RT 试剂盒: Introgen 公司。PCR 试剂盒: 上海生物工程有限责任公司。引物合成:

30、上海生物工程有限责任公司。其他试剂: DEPC,EB, 琼脂糖, 异丙醇, 三氯甲烷, 醋酸钠, 硼酸, 异硫氰酸胍, SPS 等均购自上海生物工程有限责任公司。1. 3 实验动物 SPF 级雌性C57BL/ 6 小鼠40 只, 体重18 20 g, 购于中国科学院上海实验动物中心。合格证号:SCXK( 沪) 2002- 0010。Lew is 肺癌带瘤小鼠: 购于北京医科院药物所。2 实验方法2. 1 瘤细胞悬液制备 将Lewis 肺癌带瘤小鼠放入超净台内, 固定于蜡版上, 剖开皮肤, 无菌取瘤组织, 去掉包膜和坏死组织, 选取周围生长旺盛的瘤组织, 制成细胞悬液, 调整成细胞浓度为2 10

31、8 的肿瘤混悬液, 待用。2. 2 分组及肿瘤移植 将未带瘤C57 小鼠称重, 随机分为4组, 每组10 只, 加味保安方大剂量组、加味保安方小剂量组、西黄丸组及模型组, 均在右腋皮下接种肿瘤细胞悬液0. 2ml/ 只。2. 3 给药 加味保安方按成人体表面积折算小鼠加味保安方大、小剂量为14. 04、7. 02 g / kg; 西黄丸组剂量为0. 78 g/ kg 。根据临床应用方法西黄丸组口服灌胃, 模型对照组灌服等剂量的生理盐水。自种瘤第2 天起灌胃给药, 连续给药16d, 期间小剂量组因灌胃不当死亡1只。2. 4 取肿瘤组织及肺组织 给药第16 天, 处死小鼠, 放入超净台内, 固定于

32、蜡版上。剖开皮肤取瘤, 取带瘤各组肿瘤组织及各组肺组织, 置于冷冻管中, - 70 e 保存, 备用。2. 5 检测方法及步骤2. 5. 1 引物设计 参照有关文献合成引物 4 , 由上海生物工程公司合成。B-actin: 上游引物: 5. GGACTT GATTCCTTCATT CAGT C3 . , 下游引物: 5 . CTCCTCCTACTATAAGCTAAGA3., 扩增后DNA 片段长度为569bp;VEGF-C: 上游引物: 5 .CGCTTAGGBACGATTAGAGTAACC3. , 下游引物: 5 .TACGTCAGTAT CGCCGCAAAT TTC3. , 扩增后DNA 片段长度为497 bp。2. 5. 2 mRNA 提取 所有操作器械均经DEPC 处理或高温去Rnase 处理。取保存的肿瘤组织及肺组织, 用GIT 变性液冰浴研磨, 充分破碎, 加2M 醋酸钠( 1/ 10 体积) ,