国家基金研究内容资料.docx

1、国家基金研究内容资料 (一) 立项依据1、植物化学物联合（诱导）作用研究尚欠缺有效方法，其整体性“预防”（而非“治疗”）作用还未见有力的时效性研究证据大量人群流行病学和实验研究表明，膳食中非营养生物活性成分（植物化学物）对心脑血管、糖尿病肾病及癌症等慢性非传染性疾病（NCD）具有很好的预防作用。植物化学物已成为现代营养学和食品检验研究热点1-4。膳食中植物化学物种类较多，而每种化学物因为组成和结构等不同具有不同的生物活性。由于技术原因，目前对植物化学物的研究多囿于单一成分或总提取物分析，并缺乏时效性关系描述的有力证据。单一成分的生物学效应不能完整地反映作为食品或膳食的总体作用；而对植物化学物总

2、提物的分析则无法阐明每个成分的生物学作用途径。例如，对茶汤中EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）调控恶性肿瘤血管生成作用不能代表绿茶中茶多酚群物质群的整体作用；而对茶多酚总提物的生物学效应观察也不能说明其中每个儿茶素的作用方式。另一方面，由于结构组成、代谢途径和作用靶点等不同，植物化学物可能以非原型或代谢产物形式发挥作用。虽然最近有人5对植物化学物进行了定量-结构-活性关系的探讨，但对多成分植物化学物整合作用研究鲜见报道。植物化学物联合（诱导）作用及机制研究成为该领域研究的难点。研究证明，NCD的形成有个较长时间的“酝酿”期（窗口期）。在适宜的时间干扰和阻断NCD的“酝酿”及发生过程是植物化学

3、物预防NCD的关键。正由于缺少植物化学物时效性作用证据，人们对植物化学物健康促进作用的认识尚不清晰，同时严重制约了我国NCD膳食干预的进程。2、基于化学模式识别和仪器联用的指纹图谱（FG）技术的出现为多成分植物化学物联合作用及整体时效性研究提供了可能近年来，作为天然产物多成分整合作用和化学混合物联合毒作用研究需要，基于模式识别和仪器联用的FG技术应运而生6-8。但由于技术和学科交叉等原因，目前的大部分研究还只是对化学物进行单纯FG化学构建，FG与生物学效应相关性模糊，无法从FG中解析“指纹区”或结构峰域所代表的生物活性或毒性。因此，将FG技术与生物活性模型相关联，发展多成分植物化学物FG调控N

4、CD整合效应的新方法和新原理，可能从整体上揭示其多组分复杂体系的生物效应，做到见“谱”识“效”。基于此，本项目将以咖啡酸低聚物及代谢物（以下简称“CA物质群”）为例，将标示CA物质群及代谢物的特征指纹图谱与具体生物效应研究结合起来，拓展植物化学物联合（诱导）作用及整体时效性研究新途径。3、多酚植物化学物多成分联合调控氧化应激损伤作用及时效性研究尚未见报道作为植物化学物的一大类群，多酚化合物在结构上具有多个-OH而具有明确的清除自由基和抗氧化作用。大量实验2-6,9-11已对茶多酚、果蔬多酚、葡萄酒多酚、谷物多酚等进行了提取、分离、抗氧化效果评价及构效关系研究。但膳食多酚多成分联合调控氧化应激损

5、伤作用及时效性研究尚未见报道。以CA物质群为例：这类多酚化学物广泛存在于以唇形科、菊科、蔷薇科、十字花科等植物性食品中。咖啡酸（CA），化学名为3-（3，4-二羟苯基）-2-丙烯酸，是许多植物化学物的骨架，形成了由单聚体到多聚体的多种低聚物（oligomers）。例如，以单体形式存在的咖啡酸、绿原酸（咖啡鞣酸）、阿魏酸、香豆酸；以二聚体形式存在的迷迭香酸；以三聚体形式存在的紫草酸；以四聚体形式出现的丹酚酸B等13。研究表明，这些CA物质群对心脑血管疾病（CAD）、糖尿病综合症损伤、细胞损伤恶变引发的肿瘤等NCD有良好防治作用。目前，已从十字花科植物卷心菜、唇形科鼠尾草植物中发现多种CA类物质，

6、其种类不同、数量消长、化学和生理环境改变而发生的结构及代谢变化等直接影响其生物活性14-15。本课题组用不同自由基生成体系研究了其种类与抗氧化、保护DNA损伤的关系，某一种CA效应不能全面说明CA物质群的作用16。目前，基于HPLC及联用技术的CA物质群指纹图谱相继建立7,17-19，但结合分子、细胞和整体动物水平上的生物活性模型进行CA物质群指纹图谱与时效性研究尚未见报道。植物化学物种类和分子结构不同，通过膳食进入动物体后经过消化及多种酶作用等转化成不同的物质。这种转化可能是原型植物化学物发挥活性作用的过程，也可能是原型非活性化学物生成活性小分子的过程。研究植物化学物代谢指纹图谱有助于从整体

7、上解析每种化学物内源性变化和生物效应作用机制，发现植物化学物的活性存在形式。研究发现15,17，CA物质群经口进入动物体后，在受试动物体内检测到了CA物质群原型和阿魏酸相关代谢产物。经口给予大鼠迷迭香酸，其血浆中发现甲基化及共轭成分，在尿中发现其单聚体降解产物咖啡酸、阿魏酸及其共轭成分20。说明迷迭香酸活性可能通过其小分子代谢产物发挥作用；同时，由于代谢动力学方面的原因，代谢物生物活性作用存在时间-效果依赖性。同天然药物代谢相似，因代谢形式不同可能导致膳食植物化学物在生物体内的生物学效应存在时效性21。可见，植物化学物对不同组织靶点的作用差异及不同代谢产物的生物活性，可能存在多种相似结构物质群

8、的联合诱导，或植物化学物中可能存在某种生理活性前体物，或具有引起某种病理效应改变的标志物。结合某一病理模型探讨植物化学物在生物体内的转化及引起的内源物质活性变化有利于阐明其可能的谱-效关系并对其指纹图谱进行活性标识。4、本项目的学术思想及研究意义氧化应激是生物体罹患NCD的共同作用机制，而ROS介导血管损伤的途径已得到证明。在小分子甚至原子水平上、分时段解除造成疾病的高氧化应激状态既能消除NCD表象，又能同时根除产生疾病的基础原因。现代分析化学指纹图谱技术结合氧化应激标记物的变化有希望用于跟踪和标识植物化学物的时效性联合（诱导）作用。因此，课题组提出如下假设: 食品/膳食多成分植物化学物针对某

9、个靶点的时效性联合（诱导）作用可被其特定指纹图谱所表达和标识，植物化学物及代谢物指纹图谱的变化可用于解析其生物活性作用过程，并用于预测植物化学物调控NCD的整体性和时效性。本项目探索指纹图谱预测和同时表征多成分植物化学物生物活性谱-效关系和时效性研究新模式，在国内尚未见相关文献报道。本研究构建的植物化学物联合诱导作用研究方法及在调控氧化应激方面的应用范例，将为重新解释、认知和评估膳食植物化学物生物效应提供新思路和新技术，定会有助于推动植物化学物物质基础和膳食干预研究进程。主要参考文献：1. Loo G. Redox-sensitive mechanisms of phytochemical-m

10、ediated inhibition of cancer cell proliferation. Journal of Nutritional Biochemistry, 2003, 14: 64-732. Martn M., Serrano A.B.G., Ramos S., et al. Cocoa flavonoids up-regulate antioxidant enzyme activity via the ERK1/2 pathway to protect against oxidative stress-induced apoptosis in HepG2 cells. Jou

11、rnal of Nutritional Biochemistry, 2010, 21: 196-2053. Nicholson S.K., Tucker G.A., Brameld J.M. Effects of dietary polyphenols on gene expression in human vascular endothelial cells. Proceedings of the Nutrition Society, 2008, 67: 42-474. Okarter N., Liu C.S., Sorrells M.E.,et al. Phytochemical cont

12、ent and antioxidant activity of six diverse varieties of whole wheat. Food Chemistry, 2010, 119: 249-2575. Rastija V. QSAR study of antioxidant activity of wine polyphenols. European Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 44: 400-4086. Hoai N. N., Dejaegher B., Tistaert C., et al. Development of HPLC

13、 ngerprints for Mallotus species extracts and evaluation of the peaks responsible for their antioxidant activity. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2009, 50: 753-7637. Fan X.H., Cheng Y.Y., Ye L.Z., et al. Multiple chromatographic fingerprinting and its application to the quality co

14、ntrol of herbal medicines. Analytica Chimica Acta. 2006, 555: 217-2248. Han C., Shen Y., Chen J.H.,et al. HPLC fingerprinting and LC-TOF-MS analysis of the extract of Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax root, Journal of Chromatography B,2008, 862 (1): 125-1319. Bandoniene D., Murkovic M. On-Line

15、 HPLC-DPPH Screening Method for Evaluation of Radical Scavenging Phenols Extracted from Apples (Malus domestica L.). J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 2482-248710. Bruckdorfer K.R. Antioxidants and CVD. Proceedings of the Nutrition Society (2008), 67, 214-22211. Esmaeili M.A., Sonboli A. Antioxidant, f

16、ree radical scavenging activities of Salvia brachyantha and its protective effect against oxidative cardiac cell injury. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48: 846-85312. Sadava D., Whitlock E., Kane S.E. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate inhibits telomerase and induces apoptosis

17、 in drug-resistant lung cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 360:233-23713. Lu Y.R., Foo L. Y. Polyphenolics of Salvia-a review. Phytochemistry, 2002, 59: 11714014. Bors W., Michel C., Stettmaier K., et al. Antioxidant Mechanisms of Polyphenolic Caffeic Acid Oligo

18、mers, Constituents of Salvia officinalis. Biol Res, 2004, 37: 301-31115. Zhang J.L., He Y., Cui M., Li L.,et al. Metabolic studies on the total phenolic acids from the roots of Salvia miltiorrhiza in rats. Biomedical Chromatography, 2005, 19(1): 51-5916. Dai J.F., Li L., Wu F.Q, et al. Antioxidant a

19、nd the protection against DNA damage of Polyphenolic Caffeic Acid Oligomers. Food Chemistry, 2010 (Submitted).17. Zhang J.L., Cui M., He Y, et al. Chemical fingerprint and metabolic fingerprint analysis of Danshen injection by HPLC-UV and HPLC-MS methods. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Ana

20、lysis, 2005, 36: 1029-103518. Hu P.,Liang Q.L., Luo G.A. Multi-component HPLC Fingerprinting of Radix Salviae Miltiorrhizae and Its LC-MS-MS Identication. Chem. Pharm. Bull. 2005, 53 (6): 677-68319. Luo X.B., Chen B., Yao S.Z., et al. Simultaneous analysis of caffeic acid derivatives and alkamides i

21、n roots and extracts of Echinacea purpurea by high-performance liquid chromatographyphotodiode array detectionelectrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2003, 986: 73-8120. Baba S.,Osakabe N,Natsume M.,et al. Orally administered rosmarinic acid ispresent as the conjugated and/or me

22、thylated forms in plasma,and is degraded and metabolizedto conjugated forms of caffeic acid,ferulic acid and m-coumaric acid. Life Sci, 2004, 75: 165-17821. Lampe J.W., Chang J.L. Interindividual differences in phytochemical metabolism and disposition. Seminars in Cancer Biology, 2007, 17: 347-353(二

23、)项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题研究目标：创建具有在体可预测活性的多酚植物化学物多成分联合抗氧化活性指纹图谱及标识方法，获得多酚物质群在分子、细胞和整体动物模型上调控氧化应激谱-效作用相关关系及预防机体慢性损伤的时效性证据。研究内容：围绕课题假设和目标，主要研究以下内容:1、在体可预测的抗氧化活性指纹图谱构建及DNA分子氧化应激损伤保护谱-效相关性研究模拟体内自由基清除环境，利用色-质串联仪器偶合自由基模模型，创建一种全新的具有在体可预测抗氧化活性的U/HPLC-ESI-MRM-DAD/MS指纹图谱。用不同指纹构成的多酚植物化学物进行自由基诱导的DNA分子损伤保护比较研究，以神

24、经网络和化学模式识别法解析指纹图谱-抗氧化应激损伤保护相关性。内容包括仪器联用方式、样品和自由基偶联条件、氧化损伤模型建立及DNA损伤检测等。2、具有确定指纹图谱的多酚植物化学物在细胞水平上调控氧化应激损伤与时效性研究在不同的时间、以不同水平和不同组成的多酚物质群（具有确定的指纹图谱和抗氧化指数）孵育经处理分组的大鼠心肌细胞株H9c2，探讨多酚植物化学物在细胞水平上调控氧化应激损伤作用及时效性。研究观察和检测各组细胞及植物多酚分时参与孵育的细胞氧化应激相关指标。内容包括：对照组、孵育组和氧化损伤组心肌细胞活性氧（ROS）含量、细胞抗氧化酶活力（SOD、CAT、GSH、GPx、GST）、细胞凋亡

25、等。3、多酚植物化学物及代谢物调控整体动物氧化应激损伤谱效关系与时效性观察在指纹图谱构建和解析的基础上，进一步探索多酚植物化学物体内代谢物和代谢指纹图谱，并与原指纹图谱进行比较分析多酚植物化学物可能的抗氧化应激前提物。以链脲佐菌素(STZ)糖尿病模型鼠作为氧化应激状态和窗口期干预NCD时效性模型，研究植物多酚物质群对模型鼠氧化损伤的联合保护作用，并根据作用的时间窗口及相应氧化应激参数的变化，分析其时效性。利用神经网络识别抗氧化应激损伤活性指纹组分（指纹区）。拟解决的关键问题：本项目拟解决的关键问题是：创建U/HPLC-ESI-MRM-DAD/MS指纹图谱的仪器联用接口方式及植物化学物与ROS反

26、应产物的鉴定方法。经预试验，采用流动注射、蠕动泵辅助、多通阀衔接、MRM-MS检测反应物进行解决。(三)拟采取的研究方案及可行性分析1、研究方案1.1 在体可预测的抗氧化活性指纹图谱构建及DNA分子氧化应激损伤保护谱-效相关性研究1.1.1 创建多酚植物化学物在体可预测的抗氧化活性指纹图谱本项目以CA物质群作为研究对象，涉及的主要CA类物质包括从咖啡酸单聚体到咖啡酸四聚体的代表性品种（见“立项依据”）。CA物质群及代谢物单体等购自相关试剂公司。不同浓度与比例的CA物质群来源于市售的用于保健食品生产的鼠尾草（Salvia）提取物或根据实验需要用CA单聚体混配或用半制备HPLC收集特定指纹峰。区别

27、于单纯的化学指纹图谱的构建，本研究将二苯基三硝基苯肼（DPPH）自由基反应模型偶联到指纹图谱构建流程中，同时用生理微环境模拟溶液取代传统的甲醇反应体系，携带DPPH自由基导入，与CA物质群发生作用，创建在体可预测的抗氧化活性指纹图谱。串联仪器偶合DPPH自由基反应模型的流程见图1。图1由两台LC联用或一台LC和另二个恒流泵完成样品及反应物导入，并后接UV、DAD和MS检测器，MRM检测模式对物质群产物进行确认，结合相关活性标志物进行标识。图1在线U/HPLC-ESI-MRM-DAD/MS抗氧化活性指纹图谱构建流程（1）CA多酚物质群U/HPLC-DAD/UV分离条件的优化：包括流动相及流速、色

28、谱柱及柱温、梯度洗脱程序、进样量等。（2）特定ROS的选择与导入：基于二苯基三硝基苯肼（DPPH）自由基良好的稳定性，本研究选用DPPH作为特定的ROS，用蠕动泵流动注射导入，优化流速（约0.1ml/min）。（3）生理微环境模拟溶液选择和导入条件：鉴于前期对ROS清除反应体系的模拟研究，宜以60%甲醇-40%柠檬酸盐缓冲液配制成pH7.4生理微环境溶液，优化导入流速（约0.35ml/min）。（4）流动注射条件和图谱获取样品溶液经 U/HPLC色谱柱分离后，经DAD/MS检测获得U/HPLC-DAD/MS指纹图谱，之后分离的成分序贯进入一个四通混合器的一个入口，生理微环境模拟溶液和DPPH自

29、由基分别经泵（其中一个为HPLC泵）输送，以一定的速度注入另外两个入口，三者混合后进入一个PEEK 盘管反应一定时间（与PEEK尺寸和流速有关），然后进入UV-Vis检测器，记录样品抗氧化成分对DPPH自由基的清除造成的其在517nm处吸收的降低值（表现为负峰面积的大小），以其标识样品的抗氧化活性。采用多离子反应检测MRM-MS模式进行多酚成分鉴定和定量。以最终的DPPH浓度与半数抑制IC50的比值来表示抗氧化指数（AAI）。CA物质群及代谢物总抗氧化指数AAI总为各种CA类似物单体AAI之和。以AAI 和AAI总反映CA物质群指纹图谱的抗氧化特征。要优化的参数包括：反应环尺寸和DPPH溶液流

30、速对分离度、信噪比和检测限的影响、生理微环境模拟溶液浓度的确认等。1.1.2 DNA分子氧化损伤模型建立与检测采用羟自由基引发DNA损伤（Phen-Cu-AscA-DNA）体系和超微弱发光法（Orion II 高灵敏度板式化学发光检测仪）测定。用0.1mol/L 醋酸盐缓冲液(pH5.5)配制Phen-Cu-AscA-DNA溶液，使Phen、Cu2 +、AscA和DNA的最终浓度分别为3.510-3mol/L、1.510-4mol/L、2.810-3mol/L和150g/mL。分组处理：分为对照组和3个实验组。实验组分别加入不同浓度的CA物质群（具有固定组成、指纹图谱和AAI值），对照组不加C

31、A物质，只用缓冲液补齐。取反应后的溶液1mL，放入发光仪样品池中，最后加入200 L 30% 的H2O2 溶液，混匀，启动发光反应，连续测定发光强度，获得化学发光反应动力学曲线。计算发光强度抑制率(%)。分析CA物质群对DNA损伤的保护特点（是否属延迟损伤等）。1.1.3 数据处理及谱效关系解析计算指纹图谱各特征峰相对峰面积，用指纹图谱相似度评价系统 A 版(2004 A)计算CA物质群间的相似度，判别各峰归属；以指纹图谱特征参数（如相对峰面积值等）作为化学组变量，同时用DNA分子损伤参数作为效应组变量，用WINDOWS SAS 8.0软件进行典型相关分析，计算和评价不同CA物质群组合、比例等

32、对损伤调控的效果，解析指纹图谱-氧化应激变化关系。1.2具有确定指纹图谱的多酚植物化学物在细胞水平上调控氧化应激损伤与时效性研究1.2.1 H2O2诱导氧化应激损伤细胞模型的建立取出生后13d 的清洁级SD大鼠乳鼠心肌，经适当处理后在37 oC进行心肌细胞的原代培养（3d）。 将乳鼠心肌细胞(5105个/mL) 接种于96 孔培养板中，每孔100L，放入5% CO2培养箱中，37oC培养 72h，倒置显微镜下观察细胞融合并同步搏动。弃去培养液，加入含不同浓度 H2O2 ( 01 000 mol /L) 的IMDM培养液，放入5% CO2 培养箱中，37 oC继续培养4 h。每孔加入 MTT 溶液 ( 5 mg /mL) 20L，继续培养4 h，终止培养，弃上清液，每孔加入150L DMSO，振荡3 min，使结晶物质充分溶解。选择490 nm 波长，在酶标仪上测定各孔吸光值。计算不同浓度H2O2处理后的心肌细胞存活率，选取可以导致50%60%心肌细胞死亡的H2O2浓度建立氧化应激损伤模型。1.2.2 实验分组、分时干预与检测对照组-心肌细胞正常培养；H2O2氧化损伤组-仅给予损伤浓度（约为5