光学显微镜工作原理.docx

1、光学显微镜工作原理光学显微镜工作原理1.1.引言2.2.显微镜基本原理3.3.显微镜图像质量4.4.显微技术的类型5.5.荧光显微技术6.6.光学显微镜的组成部件7.7. 了解更多信息8.8.阅读所有物理学类文章自十六世纪末发明以来，光学显微镜加深了我们对基础生物学、生物医学研究、医疗诊断和材料科学的认识。光学显微镜最多可将物体放大1000倍，以展现其微观细节。如今，这项技术已远远超岀罗伯特?虎克和列文虎克(Antoni vanLeeuwenhoek)所发明的第一台显微镜的水平。人类研发的特殊技术和光学设备可以揭示出活细胞的结构和生化机能。显微镜甚至已进入数字时代，利用电荷耦合器件(CCD)和

2、数码相机来捕捉图像。然而，这些高级显微镜的基本原理却与您生平第一节生物课上用过的学生显微镜非常相似。洋葱皮细胞(200倍)竞猜你了解多少? w光学显微镜丄作原理光学显微镜的工作原理与折射望远镜极为相似，仅有一些细微的差别。下面让 我们简单地了解一下望远镜的工作原理。望远镜要从昏暗、遥远的物体上采集大量光线，因此需要巨大的物镜，以尽可 能多采集一些光线并使物体看起来更加明亮。物镜很大，因而物体的图像会出现在一段距离之外的焦点位置，这就是为何望远镜比显微镜长得多的原因。望远镜的L1镜随后放大图像，使物 体就像在您眼前样。普通学生光学显微镜的示意图，显示各个部件和光路与望远镜相反，显微镜必须从距离很

3、近、范围极小、厚度极薄且明亮清晰的样 本上采集光线。因此显微镜不需要巨大的物镜。相反，显微镜的物镜很小，而且呈 球形，这就意味着显微镜两侧的焦距都要短得多。物镜将物体的图像对焦在显微镜 镜筒内的不远处。随后图像III第二个透镜放大，这个透镜称为接LI镜或LI镜，使物 体如同在您眼前一般。望远镜和显微镜之间另一个主要区别在于，显微镜带有光源和聚光器。聚光器 是一种透镜系统，用于将光源的光线聚焦到样本上的一个微小而明亮的点，即物镜 检查的同一区域。显微镜与望远镜之间还有一个不同之处:后者配有固定物镜和可 换LI镜，而前者配有可换物镜和固定LI镜。通过更换物镜（从相对扁平、低放大倍 数的物镜到较圆、

4、高放大倍数的物镜），显微镜可以观察越来越微小的区域一一采 光不是显微镜物镜的主要任务，但却是望远镜的。本文后半部分将详细讨论显微 镜的组成部件。制作简易显微镜您可以用放大镜和纸片制作简易显微镜：1.准备两片放大镜和一张印有图像的纸。2.将一片放大镜固定在纸张上方不远处。印刷图像看起来变大了一点。3.将另一个放大镜放在您的眼睛和第一个放大镜之间。4.上下移动第二个放大镜，直到印刷图像清晰为止。您会发现印刷图像要比在第一个放大镜中看到的图像更大。此外，您还可以制作一个类似针孔相机的简易针孔显微镜。显微镜图像质量使用显微镜观察样本时，您所看到的图像质量将在以下儿方面进行评估:亮度一一图像有多明亮，壳

5、度与照明系统相关，因而可以通过改变灯的电压（可 变电阻器）以及调节聚光器和光圈/针孔孔径进行更改。此外，亮度还与物镜的数值 孔径有关（数值孔径越大，图像越明亮）。花粉粒在高壳度（左图）和低壳度（右图）情况下的显微镜图像焦点一一决定图像是模糊还是清晰，焦点与焦距有关，且可以通过聚焦旋钮控 制。样本载波片上的盖片厚度也会影响图像对焦一一盖片对物镜而言可能太厚。正 确的盖片厚度应标注在物镜的侧面。花粉粒对焦（左图）和失焦（右图）时的显微镜图像分辨率一一图像中的两个像素达到多近的间距时，会分辨不清，分辨率与物镜花粉粒的高分辨率（左图）和低分辨率（右图）显微镜图像对比度一一样本周围区域的光照差别怎样，对

6、比度与照明系统相关，可以通过 改变光线强度以及光圈/针孔孔径对其进行调节。除此之外，对样本进行化学着色 也可以增强对比度。花粉粒在高对比度（左）和低对比度（右）情况下的显微镜图像显微技术的类型 用显微镜观察样本的一个主要问题就是，物体的图像没有太大 样本制备的对比度，生物样本（如细胞）尤其如此，尽管天然色素（如 树叶中的叶绿素）可以提供很好的对比度。解决这个问题的一利用透射光观察 样本时，光线必种方法就是用彩色颜料或染料对样本中的特定组织进行处理。须穿 过样本才能形成图像。样本U前，人们已经研发出多种用于改善样本对比度的显微 技术。越疗，穿过的光线越少。穿过的其特殊性主要集中在照明系统和穿过样

7、本的 光的类型。例如，光线越少，图像就越暗。因此，暗视野显微镜使用一种特殊聚光 器，可以阻断大部分明亮光线，样本必须很薄（0.1到0.5毫米）。并用斜照光线照 亮样本。这与月亮挡住太阳的光线，形成日食很多活标本必须在观察前切成薄的情 况极为相似。这种光学装置能够提供完全黑暗的背景，从片。岩石或半导体样本因 太厚而而改善图像的对比度，以呈现精细的细节一一照亮样本边界区无法切割，也 无法用透射光观察，域。因此只能通过其表面反射的光线观察。以下是各种类型的光学显微术技术：明视野一一这是基本型显微镜配置（本文迄今列举的图像均拍自明视野显微 镜），这种技术的对比度不高。本文迄今列举的图像的大部分对比度都

8、是通过样本着色获 得。暗视野一一如上所述，这种配置可以提高对比度。有关该技术的详细信息和示 例，请参M Molecular Expressions：Darkfield Microscopy 一文。莱因伯格照明法一一这种装置与暗视野类似，但它使用一系列滤镜对样本进行“光学着色”。有关该技术的详细信息和示例，请参见MolecularExpressions:Rheinberg Illumination一文。以下技术使用与莱因伯格照明法相同的基本原理，通过使用不同光学组件实现 不同的显微结果。基本思想包括将光束分成两路来照亮样本。与穿过非密集结构的 光波相比，穿过样本密集结构的光波速度有所减慢。由于所

9、有光波都经过采集并传 送至LI镜，进行重组，因此它们之间会相互干涉。干涉图案会提高对比度:它们可 能在明亮背景（较不密集）中显示出暗色区域（较密集），或者创建一种伪三维（3-D） 图像。相衬一一这是观察人丄培养细胞等活标本的最佳技术。相衬光路a_ L聚光器光源相衬显微镜的光路相衬显微镜中，物镜和聚光器的环孔将光线分开。穿过光路中间部分的光线与 经过样本外围的光线重新组合。这两种光路引起的干涉会产生密集结构看起来比背 景暗的图像。有关该技术的详细信息和示例，请参见MolecularExpressions:Phase Contrast Microscopy一文。微分干涉相衬(DIC)微分干涉相衬显

10、微镜使用偏 振滤镜和棱镜将光路分开并重新组合，呈现样本的三 维图像。DIC显微镜，按照发明人的姓名，也称为诺 马斯基显微镜。有关该技术的详细信息和示例，请参UL Molecular Expressions:Differentidl InterferenceContrast Microscopy 一文。霍夫曼调制相衬一一霍夫曼调制相衬技术与DIC技术相似，只是它在光路的光轴上和光轴外使用带小切口的板，产生两组通过样本的光波。同样也形成三维图像。有关该技术的详细信息和示例，请参见Molecular Expressions:Hoffman Modulation Contrast Microscopy

11、Theresa M. Freudenrich 供图一文。 培养的 鼠脑胶质细胞的相衬图像偏振一一偏振光显微镜使用两片偏振镜，样本两边各一片，且位置相互垂直，因而仅有通过样本的光线才能到达LI镜。光线在通过 第一个滤光镜到达样本时，在某一面发生偏振。样本中有规律地隔开的、组成一定 图案的或者结晶的部分会使通过的光线转向，其中部分转向的光线会通过笫二片偏 振滤镜，因此这些间隔规则的区域可以明亮地显示在黑色背景中。有关该技术的详 细信息和示例，请参见 Molecular Expressions: I nt roduc tion to Polarized Light Microscopy文。荧光一一这

12、种显微镜使用能量高、波长短的光线（通常为紫外线）来激发样本中 特定分子的电子，使这些电子转移到高能轨道上。肖它们跳回原来的能级轨道时， 便会释放能量低、波长更长的光线（通常属可见光），从而形成图像。荧光显微技术荧光显微镜使用汞灯或氤气灯发出紫外线。紫外线进入显微镜外荧光并碰到分色镜一一一种能够能反射一定波长范围的光线，同时允许其他波段的光线通过的透镜。分色镜将紫外线向上反射到外荧光是荧光显 微镜的光学装样本上，紫外线激发样本中分子内的荧光。物镜采集样本发出置，其 中物镜用于将紫外线对焦的荧光波长的光线，荧光穿过另一分色镜和阻挡滤镜，以 消除在样本上并采集样本发出的荧不是荧光的波长，使荧光到达物

13、镜形成图像。 光。外荧光比透见荧光更加有效，后者使用单独的透镜或聚光器将紫外线对焦在样本上。外荧光还允许在同一显微镜上组合使用荧光显微技术与其他类型的显微技样本内的荧光分子可以自然产生或人工引入。例如，您可以用称为钙黄绿素/AM的染料给细胞着色。这种燃料本身并不是荧光剂，但其分子中的AM成分隐藏一部分可以与钙元素结合的钙黃绿素分子，这样就能发出荧光。将钙黃绿素/AM与浸泡着细胞的溶液混合时，这种染料会渗入细胞。活细胞中的一种酶，可以除去其中的AM部分，并锁住分子中的钙黄绿素，使其与钙元素结合，从而在紫外线的作用下发出绿色荧光，而死细胞则没有这种酶。因此，活细胞可以发出绿色荧光，而死细胞却不会发

14、出荧光。如果您混入另一种称为碘化丙唳的染料，就能看到同一样本中的死细胞，因为这种染料只渗透死细胞。碘化丙唳会结合细胞核中的DNA,并在紫外线的作用下发出红色荧光。这种双染色技术可用于毒物学研究，以确定施用杀虫剂等环境化学品时，所杀死细胞数量的白分比。Theresa M. Freudenrich 供图这是培养的鼠脑细胞的荧光显微图像。钙黃绿素着色的活细胞()和碘化丙唳着色的死细胞(下)。荧光显微术有助于观察活细胞的结构以及衡量活细胞中的生理和生物化学活 动。不同的荧光指示剂，可以用于研究众多具有重要生理作用的化学物，如:DNA、 钙、镁、钠、pH值和酶。此外，各种生物分子特有的抗体可以与荧光分子

15、化学结 合，用于对细胞内的特定结构着色。有关该技术的详细信息和示例，请参见 Molecular Expressions：Fluorescence Microscopy文。光学显微镜的组成部 件光学显微镜，无论是构造简单的学生显微镜还是复杂精密的研部分显微镜术语 究用显微镜，都包括以下基本系统：样本控制一一承托并操作样本景深一一在焦平面上下载物台一一放置样本的地方两侧，能够形成具有一定样本夹一一用来将样本固定在载物台上。III于您清晰度的图像的垂直距看到的是放大后的图像，因此即使样本稍微移离动，也可能将这部分图像移出您的视野。视野一一使用特定物镜显微操纵器一一允许您严格控制地沿X和Y轴时，通过显

16、微镜能够看到 小幅移动样本（扫描载波片时十分有用）的样本区域照明一一照亮样本。最简单的照明系统是将室内光线向焦距一一透镜将光线上反射到样本上的反射镜焦所需的距离（通过以微灯一一发出光线。通常而言，灯就是钩丝灯泡。米衡量）对于特殊显微镜，可能会使用汞灯或氤气灯发出焦点一一通过透镜的光紫外线。有些显微镜其至还使用激光扫描样本。线汇聚到一起的点可变电阻器一一改变施加到灯的电流强度，从而放大倍率一一物镜和II 控制发出的光线的强度镜的放大倍数聚光器一一调整光线并将其从灯对焦到样本的数值孔径一一透镜采光透镜系统能力的衡量指标光圈或针孔孔径一一位于光路中，旨在改变到达分辨率一一两个像素点聚光器的光量，用于

17、增强图像的对比度可以清晰分辨出来的最小间距（通常以纳米衡量）普通学生光学显微镜的示意图，显示各个部件和光路透镜部一一形成图像物镜一一采集样本上的光LI镜一一将物镜的图像传送并放大到您眼前换镜旋座固定有多个物镜的旋座镜筒一一将U镜固定在与物镜具有适当距离的位置，并挡住杂散光对焦部一一将物镜固定在与样本距离适当的位置粗调焦旋钮一一用于将物体的图像调至物镜的焦面上精调焦旋钮一一用于精细调节图像的对焦支撑和校准部架臂一一显微镜中将所有光学部件按固定距离进行撑托并校准的弧形部分底座一一支撑显微镜所有零部件的重量镜筒与显微镜的架臂通过齿条与小齿轮传动装置相连。这种连接系统可以在您更换透镜或观察器时对焦图像

18、，以及更换样本时将透镜从载物台移开。上述部分的组成部件未在图中显示，同时它们也会因显微镜的不同而有所区 别。显微镜有两种基本的配置方式:正立和倒置。图中所示显微镜为正立显微镜， 其照明系统位于载物台下方，而透镜系统位于载物台上方。倒置显微镜的照明系统 则位于载物台上方，而透镜系统位于载物台下方。倒置显微镜更便于观察较厚的样 本，如细胞培养皿，因为透镜部分更靠近器皿底部，而那里恰好是细胞生长的地 方。光学显微镜可以揭示活细胞和组织的结构，也可以显示岩石和半导体等非活样 本的结构。有些显微镜设计简单，有些则精密复杂，有些显微镜组合了多种显微技 术，其中每种都可以展现略有不同的信息。如今，光学显微镜已经显著提高了我们 对于生物医学的认识，以后也仍将是辅佐科学家研究的有力丄具。