翻译 CEBPβ controls exerciseinduced cardiac growth and protects against pathological cardiac remod.docx

1、翻译 CEBP controls exerciseinduced cardiac growth and protects against pathological cardiac remodC/EBP 控制运动诱发的心脏生长 以及 抵抗病理性的心脏重构概要运动可以促进心脏的生长，但是人们对于这种生理性增大背后的转录机制所知甚少。最近，成熟的心肌细胞也被证明拥有潜在的增殖能力，有可能为再生治疗提供一个非常重要的方法。通过基于实时定量PCR的方法筛选所有的转录组分，我们发现运动能抑制C/EBP的表达，而CITED4的表达则增加。C/EBP在体外和体内的下降导致了伴随着心肌细胞增大和增殖的耐力运动拟

2、表型（一种环境引起的表观型非遗传性变更），而这种增殖效果至少在一定范围内是通过增加CITED4来传达。重要的是，心脏 C/EBP水平降低的老鼠在超负载时显示出对心肌衰竭有很好的抵抗力。以上这些数据表明C/EBP能抑制成年哺乳动物心脏心肌细胞的生长和增殖，同时也表明了C/EBP水平的降低是生理性肥大和增殖的一个主要信号。引言心肌能通过增大使自己适应增强和（或）加量的压力，这对于生理性刺激的或由疾病引起的刺激都是成立的，例如运动，高血压。虽然两者的早期在形态学上表现非常相似，但病理性心肌肥大会导致心血管疾病例如心力衰竭和心律失常，而生理性增大则不会。因此，获悉这两种不同类型的心脏生长的机械区别有着

3、非常重要的临床意义。先前已有许多关于与病理性肥大相关的转录因子的报导，但对于控制生理性增大的分子机制则了解得很少。成年哺乳动物的心肌细胞保持有一定的增殖能力，在特殊的刺激下能表现出来。这一特性有潜在的价值，因为如果心肌细胞的这种增殖能力可以被加强和驾驭，它将成为损伤的心脏修复的一个基础。然而，关于这种程序能否通过生理性干涉来调控，目前还不清楚。此外，尽管最近的研究把相关的一些信号转导通路牵涉进成熟心肌细胞的增殖中（09年），但对于其中详尽的分子机制，特别是对于这个程序中决定性的转录组份，了解还是很少。而且，几乎没有什么数据仅在有效地指出控制成体心肌细胞增殖的因子是什么。关于心肌细胞增殖的调控因

4、子，Gata4是仅被了解的几个之一，最近有报导指出Gata4在斑马鱼心脏修复过程中是增殖细胞的标记（2010年），它还是大家熟知的成体心脏肥大中细胞分化的一个调控因子，同时还有生长激素释放因子（SRF），Nkx2.5，Tbx5和Gata6（2003年）。在这里，我们用鼠科动物做模型研究了运动引发的生理性肥大。我们用的是一种近期在基因组领域中用于对所有转录组分进行定量的，叫Quanttrx的方法，在这种方法下的数据库包含了所有已知的转录因子，转录的核调控蛋白和所有与转录组件相关的功能已知或未知的蛋白。我们要报道的是，耐力运动降低转录因子C/EBP的表达水平，连同引起CITED4表达的上升，造成了

5、心肌细胞的增大和增殖。此外，我们发现有遗传性C/EBP水平低下的老鼠在心脏表型上与常运动的老鼠有很多相同之处。重点是，C/EBP水平低下的老鼠在心脏负载过重时能有效地抵抗心脏功能紊乱。成果一、 耐力运动诱发心脏增大及心肌细胞增殖为了研究生理性心脏增大相关的转录调控因子，一个坡道游泳运动模型被建立了（2008年）。如Figure S1所示，轻微的心脏肥大发生时并没有伴随着病理性标志基因的表达，如ANP，BNP。并且，心肌细胞增大了45%，也没有检测到纤维变性和血管生成。因此，我们可以推断出这些动物发生了健康的生理性心脏增大。Figure1进一步的鉴定显示，在运动的小鼠心脏中细胞增殖的标志物PCN

6、A的表达有所提高（如Figure 1A所示）。为了确定这些增长的增殖标志来自于哪些细胞，研究者用共聚焦显微镜观察了对心肌细胞有选择性的蛋白质-辅肌动蛋白（-actinin）和增殖标志物Ki67进行染色标记的心脏组织。在心肌细胞中可以粗略地观察到Ki67着色占1%5%（Figure 1B）。重要的是，用数码软件对组织切片进行盲法分析可以得出，运动老鼠心肌细胞的Ki67着色与不运动的老鼠相比，有很大的增加。另外，有丝分裂的特异标志物磷酸组蛋白3（pH3）也增加了（Figure 1C），虽然阳性细胞的数量相对较少。Figure S1显示的是处于有丝分裂不同阶段的磷酸组蛋白3（pH3）阳性的心肌细胞。

7、可以看出，在这种生理性增大模式下的老鼠心肌细胞中，标志着细胞增大和增殖的物质含量都升高。先前的研究利用心肌细胞核的密度作为心肌细胞增殖的指示（2009年）。我们可以检测到细胞核密度的微小变化，但这并没有达到统计显著性。不管怎样，值得注意的是心肌细胞大小上可观测到的增大会部分抵消细胞核密度上计算出来的变化，这是可预料到的。于是，我们用溴脱氧尿苷（BrdU）注射给运动小鼠来检测DNA的合成。我们在运动老鼠体内检测到1%6%的-辅肌动蛋白和溴脱氧尿苷都呈阳性的心肌细胞。Figure 1D显示了与行动被控制的小鼠相比，运动小鼠的溴脱氧尿苷阳性的心肌细胞数量有很大增加。阳性细胞的Z堆栈可视化明显地展示了

8、心肌细胞中溴脱氧尿苷的位置（Figure S1）。最后，通过对胞质分裂标志物Aurora.B激酶的染色标记证明了这个运动模式确实促进了心肌细胞完全分裂（Figure 1E）。相反的，我们在病理性肥大的鼠科模型中检测不到以上这些与增殖相关的标志物的任何变动。总的来说，这些数据有力地说明了这种耐力运动形式能提高成熟心肌细胞的增大和增殖速度。二、 在生理性增大期间C/EBP的表达下调为了研究生理性心脏增大的转录基础，我们利用Quanttrx方法，一种基于实时定量PCR的筛选，这是一种最近我们用来发展所有已知的和预测的转录组分的方法。我们使用了拥有以上生理性增大特点的老鼠心脏样品和连续两周经受经主动脉

9、收缩（TAC）的老鼠心脏样品。如Figure S1所示，TAC处理引起与运动老鼠相似的心脏肥大，但另外还伴随着ANP/BNP水平的升高，这表明引起的是病理性肥大。这时，在经受TAC的小鼠中还没有出现心脏衰竭或其他病理性变化的预示。Quanttrx筛选在运动模型鼠中鉴定出175种主要被调控的基因，而在病理性模型鼠中的为96种。重点是，这两种模型很少有表达方面的交集。实际上，两种模型引发的变化上存在着值得注意的负相关关系。因此，病理性和生理性两种模型表现出相异的转录组分项目。Figure2在由生理性肥大所调控的175种转录因子中，47种（27%）的功能未知。然而，10种功能已知的与心脏分化或成熟心

10、脏肥大相关的转录因子在运动型老鼠中的表达有区别地被调控了，包括一些被熟知基因例如Nkx2.5, Gata4, Tbx5, Mef2c, and Gata6。13%的这些转录因子在细胞增殖中有已知的或预测的角色。而在病理模型调控的基因中，仅有少于1%的与细胞增殖有些许的关系。根据表达水平变化的多少及心脏表达的特异性，我们从初始列表的272种中挑出30个基因并在生理或病理模型的样品中进行新一轮的qPCR。其中8种表现很高的心肌细胞特异性表达（Figure S2 和 Figure 2A），这些基因在后面进一步被分析。Figure S2显示的是这些基因在心肌细胞与非心肌细胞中的表达情况（细胞经过梯度分

11、离）。8个基因中的5个在心肌细胞部分首先表达，随后我们在鼠新生心肌细胞中用腺病毒作为媒介分别强制表达这5个基因，或用siRNA使其沉默，最后观察这些细胞的大小变化。实验结果显示，Gbx2, Cited4, Mlx, and Meox1四个基因对心肌细胞的大小没有发挥效力（Figure S2）， 而C/EBP的下调则引起了细胞明显的增大（Figure 3A）。C/EBP是表达DNA结合转录因子的bHLH基因家族成员之一，在脂肪细胞和肝脏组织细胞增殖和分化中有已知的功能（2006年），但其在心肌细胞环境中的作用还没有被研究过。在运动模型中C/EBPmRNA的合成下调了61%，而在病理模型中则没有这

12、种现象（Figure 2A）。并且C/EBP蛋白的合成也减少了（Figure 2B），而在这些心脏样品中没有检测到抑扬制C/EBP的同种型short LIP C/EBP（Figure 2B）。共聚焦显微阐明了这实际上是运动减少了C/EBP在心肌细胞中特异性表达（Figure 2C），与这相符合的是，通过梯渡提纯，我们发现C/EBP在心肌细胞中的表达比在非心肌细胞的强。（Figure 2D 和Figure S2）我们用另外两个运动老鼠模型来探测C/EBP表达的作用：剧烈的踏车跑步和低强度的踏车跑步。两者都没有导致心脏肥大，但剧烈运动模型的C/EBP表达出现减少现象（Figure 2E）。因此，C

13、/EBP的表达早在耐力运动的时候就相对地有所减少了。三、 在人工培养的心肌细胞中，C/EBP表达的下调诱导了细胞的增大和增殖我们实验性地使鼠初生心肌细胞的C/EBP表达下调，以对其产生的功能效果进一步进行评估。我们siRNA沉默使C/EBP表达水平下调到近似于我们在耐力运动中观察到的mRNA的的水平（43%）（Figure S3）。如Figure 3A 和Figure 3B所示，这一强制性的C/EBP mRNA下调足以引发细胞的增大和蛋白质生物合成速率的升高。而强制性表达C/EBP则没有观察到细胞大小和蛋白质生物合成上有统计意义的显著变化。C/EBP表达水平下调也足以抵消病理性刺激中ANP水平

14、的上调（Figure S3）。有趣的是，经siRNA引起的C/EBP下调也导致了细胞数量的增加（Figure 3C），伴随着PCNA表达的增加和更多BrdU加入DNA中，后两者变化很高程度上暗示了心肌细胞的增殖。（Figure 3D 和Figure 3E）。以上数据说明了C/EBP表达的下调足以诱发人工培养的心肌细胞的生长和增殖。Figure3四、C/EBP通过使血清反应因子隔离来调节生理性肥大特有的基因集合最初的Quanttrx筛选显示出心肌细胞增大和分化中特有的一套功能已经的调节基因。（Figure 4A 和Table S1），例如Gata4, Tbx5, and Nkx2.5，它们都能诱

15、发细胞生长（2003年）。除了这11种基因，我们还研究了在众所周知的心脏生长和分化中会改变的基因的表达水平，包括a-MHC, TnI, and TnT，它们在运动鼠中的表达水平都上调。（Figure 4A）。转录的核调控因子PGC-1先前已被证明在心脏发生肥大后预防心脏功能紊乱中扮演着重要的角色，而实际上运动鼠心脏呈现出PGC-1表达水平升高的现象，连同升高的还有其下游靶基因产物VEGF, Ndufs1, Ndufv2和 ATP5o (Figure 4A)。结合Quanttrx筛选和之前提到的肥大标志、PGC-1及其下游靶标，我们确定了一套19个受运动诱发变化的基因(Figure 4A)。Fi

16、gure S4显示的是经主动脉缩窄处理（TAC）后老鼠的Nkx2.5, Tbx5,Mef2c, Gata4, and PGC-1 的mRNA表达的改变。如Figure 4B所示新生心肌细胞中C/EBP的表达下调导致了与上述非常相似的表达模式。实际上，在运动模型中的那19个基因中，有11个以相同的方式被调控了。此外，以腺病毒为载体表达C/EBP却诱发了本质上相反的表达模式（Figure S4）。以上这些数据强有力地暗示了C/EBP是其他参与调控生理性增大的转录组分的上游调控部件。特别有趣的是C/EBP依赖的Gata4的调控，Gata4最近被证明了在斑马鱼心肌修复过程的心肌细胞增殖中起主要做用（2

17、010年）。Figure4许多由耐力运动和siRNA沉默降低C/EBP表达所调控的基因都是转录因子SRF的转录靶标，它们的启动子中都有SRE元件(2003年)。C/EBP已经被证明能与SRF进行相互作用（1999年），但这种相互作用的结果还不清楚，特别是在C/EBP角色还不清楚的心肌细胞中。先前关于C/EBP-SRF相互作用的报导能推断出它对于SRF依赖的无件有积极的效果，而我们这里实验结果显示，在心肌细胞中经siRNA沉默C/EBP后引起的Gata4和-MHC表达水平的上调对SRF依赖性的基因有负调控作用（Figure 4A）。在新生心肌细胞样品中，通过共免疫沉淀法可以观察到SRF和C/EB

18、P蛋白的物理性作用（Figure 4C）。接下来，我们做了核染色质共免疫沉淀分析（ChiP），来检测随着C/EBP蛋白的增多或减少，SRF与Gata4及-MHC的启动子结合的情况。如Figure 4D所示，用siRNA沉默后，C/EBP水平的下调很大程度地加强了SRF与Gata4及-MHC的启动子的结合，而SRF已知对基因表达有积极作用。相反地，用腺病毒为载体表达C/EBP则会减少SRF与这些启动子的结合。因此得出，C/EBP干扰SRF与决定性的心脏基因启动子的结合（Figure 4E）。最近发现的在心肌细胞增殖中的ErbB4通路引导我们去研究C/EBP的表达是否会受这种通路的影响，特别令我们

19、关注的是，ErbB4通过AKT1（一种在生理性肥大中功能已知的激酶）来发信号（2006年）。于是，我们用强制表达野生型的AKT1和一种主要显阴性的AKT1来研究这种ErbB4通路与C/EBP之间的关系。如Figure S4所示，AKT1活性的增加确实减少了C/EBP的表达水平，伴随着Tbx5, Gata4, TnI,TnT和a-MHC表达的增加，类似于在运动鼠中观察到的那样。相反地，低活性的AKT1突变体增加C/EBP并平行降低了Tbx5, Gata4, TnI,和a-MHC的mRNA的水平。因此，我们推断，AKT1的活性能诱发与运动相同的基因表达模式。接下来，我们以腺病毒为载体过量表达C/E

20、BP和AKT1，来确定C/EBP对这些靶标基因的调控是否在AKT1的下游。如Figure S4所示，C/EBP的过量表达能抵消AKT1促进Tbx5, Gata4, TnI,TnT和a-MHC表达这一效应。结合起来，这些数据可以推断出AKT1调控C/EBP的表达，把C/EBP与之前描述过的心脏生理性生长通路联系起来。五、 C/EBP对促进心肌细胞增殖的转录因子CITED4是负调控Figure5上面提到过的那些SRF依赖性的基因，包括被熟知的心肌细胞增大的一些调控因子，但除了Gata4之外，它们并没有像C/EBP减少一样，出现增殖时的表型。于是我们分析心脏的那些由运动诱发变化，并由可能有影响心肌细

21、胞增殖功能的C/EBP所调控的一系列基因（Figure S2）。初步研究中，我们使六个很显然是C/EBP下游靶标的因子功能加强或缺失，结果让我们聚焦于CITED4。CITED4在运动鼠心脏中有很大程度的增加（Figure 5A），并且在体外，它的表达水平随着C/EBP的增加或缺失发生很明显的变化（Figure 5B）。很显然地，强制增加CITED4的表达能使心肌细胞和Ki67-阳性的细胞数量增多（Figure 5C 和Figure 5D）。相反地，用siRNA干扰CITED4的表达（Figure S5C）则会减少以上两种细胞的数量（Figure 5C和气D）。基因表达分析结果也显示出一套在耐力

22、运动鼠中表达增加的与增殖相关的基因，而在这些运动鼠中，重要的细胞增殖因子CyclinD1和 n-myc随着CITED4和SRF的强制性增加，也出现表达增加现象（Figure S5）。为了研究C/EBP和CITED4的功能关系，我们用siRNA同时沉默C/EBP和CITED4。如Figure S5所示，CITED4的敲除会完全消除C/EBP降低所诱发的细胞增殖效果。因此，至少在一定程度上，C/EBP的反增殖作用很有可能是通过CITED4来传达的。六、 C/EBP控制斑马鱼心肌细胞的增殖Figure6接下来，我们在用斑马鱼来探索C/EBP减少的作用，斑马鱼是一个简单并且在实验上易于操作的活体系统。

23、我们把抗C/EBP的吗啉代寡核苷酸注射到处于单细胞时期的cmic2-GFP转基因斑马鱼胚胎中（Figure 6A）。Figure 6B显示的是36小时后斑马鱼心脏解剖和对细胞核（蓝）和细胞膜（红）的染色结果。这些图像的量化显示心肌细胞的增多，但心肌细胞大小上并没有改变，至到受精72小时后(Figure 6D)。此外，用BrdU处理20min标记48小时的胚胎，证明了其DNA合成的增加（Figure 6C，定量在Figure 6E）。Gata4的mRNA表达明显增加，与上面所示结果相符合（Figure 6F）。因此，C/EBP的减少诱发了斑马鱼活体内心脏心肌细胞的增殖。七、C/EBP杂合子鼠细胞

24、的变化与耐力运动鼠相似并且在超负载时有心脏保护功能完全缺失C/EBP的老鼠在产前或产期致死，而杂合子相当正常。C/EBP杂合子的老鼠心脏的C/EBPmRNA减少到与运动鼠相似的水平（比普通的降低50%， Figure S6）。因此，我们用这些杂合子鼠来研究C/EBP在哺乳动物心脏功能中扮演的角色。我们分析了上述那套由运动诱发的基因设置在杂合子C/EBP鼠中的情况，并与同窝出生的野生型的鼠做比较。我们发现很多基因（19个中的8个）的表达改变模式与之前在运动鼠中的相似（Figure S6）。此外，细胞大小测量结果显示心肌细胞增大（Figure 7A）并且心脏重量有所增加（Figure S6）。超音

25、波心动描记的研究结果显示缩短分数有所增加，这一变化微小但重要，因为这是心脏功能提升的一个重要参数(Table S3)。此外，没有发现心脏壁厚出现不同。我们也对C/EBP杂合子鼠进行基线试验。很明显地，心肌细胞细胞核密度有明显的增加（Figure 7B），这与心肌细胞中观察到的增殖标志物的表达上调相符合（Figure S6）。BrdU注射的结果是，C/EBP杂合子鼠的阳性心肌细胞相对增多（Figure 7C和Figure S6）。 在C/EBP杂合子鼠心脏组织中也能检测Aurora.B激酶呈阳性的心肌细胞（Figure 7D）。为了直接研究成熟心肌细胞的增殖，我们还分别分离了C/EBP杂合子鼠及

26、其同窝出生但运动受限鼠的成熟心肌细胞，在含BrdU的培养基上培养48小时，并对其增殖标志物进行染色。结果发现来自运动受限鼠的心肌细胞只有少于0.05%（-0.1%）的呈BrdU阳性，而C/EBP杂合子鼠的阳性细胞将近是它的10倍（0.6%0.2%）（Figure 7E）。Figure7紧接着，我们同时在杂合子及其同窝出生运动受限鼠身上实行运动计划。如Figure S7所示，经过运动，杂合子鼠中的C/EBP水平相对于野生型鼠并没有进一步下调，另外，我们在运动的杂合子鼠中发现微小的心脏增大（Figure S7）。更值得关注的是，杂合子鼠的运动量底线表现出很大的提升（Figure S7），这暗示了C

27、/EBP减少在活体中产生的功能结果。为了严谨地评定在杂合子鼠中看到的这种对心脏变化有保护性的角色，我们对鼠进行了可导致病理性心脏肥大和功能紊乱的主动脉缩短（TAC）处理来引起心脏超负载。结果正如预想的那样，根据缩短分数（FS）可以判断，TCA处理导致野生型鼠心脏功能逐步衰退，然而，杂合子鼠只在心脏收缩功能方面有微小的衰退（Figure 7F）。对于鼠和人类，肺水肿是心脏衰竭的一个非常重要的特征，两种实验鼠的肺重量的显著差异也反应了他们心脏功能的差距（Figure 7G）。心室膨胀度在野生型鼠中的增加速度也远比杂合子鼠的快（Figure S7）。根据实验动物照护及使用委员会的规定，经TCA处理后

28、的小鼠如果心脏的缩短分数比平均数降低超过四个标准时，该鼠就要牺牲了，因为这代表一个很有可能与心脏衰竭相关的非常重大的恶化。基于这个标准，乘积极限分析证明了野生型鼠比杂合子鼠更容易达到这个程度的心脏功能失调（Figure 7H）。因此，杂合子鼠C/EBP水平的下调（下调程度在数量上与运动模型鼠的相当）导致心脏功能的增强，并且对心脏病理性应激有抵抗作用。讨论撇开已被充分证明的运动对心血管的益处，我们对这些益处底下的机制，特别是对于心脏，了解还是非常有限。尤其是，相对于病理性所牵涉到的各种各样的转录因子，对生理性增大底下的转录通路所知甚少。在这里，我们提供证据证明了由运动诱发及被C/EBP下降所传达

29、的导致生理性肥大的心脏信号通路。有趣的是，运动或实验性C/EBP表达水平能诱发心肌细胞大小的增长和细胞分裂，这些变化很有可能促成观察到的那些益处。此外，这些作用与有利变化的基因集合紧密相联，包括PGC1通路的感应。最后，我们观察到单纯C/EBP表达下调足以引起心脏功能的增强及抵抗心脏超负载所引发的病变或致死。近来，心肌细胞的增殖引来了相当多的关注，好几篇论文都有阐明（2009，2010）。实际上，我们在这所观察到的由运动诱导的心肌细胞的增殖行为与用神经调节蛋白1（NHG-1）（2009年）预处理有很大的相似度。我们这里提供的数据也证明了在心肌细胞中，C/EBP是ErbB4关联的信号通路的功能靶

30、标，尤其是AKT1。运动和遗传引起的C/EBP减少都在体外或体内导致影响心脏功能的特异性基因集合。Tbx5, Nkx2.5, Gata4和-MHC都已被证明可能诱发成熟心脏细胞的增大。因此，很有可能就是C/EBP通过增加这些重要的基因集合的表达来发挥它使心肌细胞增大的效力。值得注意的是，C/EBP表达下降所产生的这些效果并不要求mRNA和蛋白质水平发生巨幅变动，由运动或遗传变异引起的5060%的变化就足以带来心肌细胞生物学以及机体对生物力学压力上的相当重大的变化。这强有力地说明C/EBP就像一个变阻器，在心脏里凭借它产生的微小却高度调控的变化反应在广大的下游响应。PGC1也是受影响的基因之一，

31、PGC1是线粒体生物合成和抵抗病理性心脏应激中很重要的一个转录辅激活物（2007年）。根据体外获得功能研究，PGC1并没有引起心肌细胞肥大，而更像是通过增加线粒体基因的表达并且行使功能来起作用的。C/EBP调控Gata4表达的一个重要机制就是通过与SRF结合，从而使SRF不能直接与Gata4，-MHC的启动子结合。考虑到SRF在心肌细胞分化和调节Tbx5,Gata,Nkx2.5表达中起重要作用的现有数据，这种机制对心脏生物学有着相当广阔的含义。事实上，沉默SRF是唯一已知的能完全消除心肌细胞分化的基因敲除模型。C/EBP下调有心脏保护功能的可能性，也与近来报导的病理性模型一致：增加的C/EBP

32、易引起心脏负面重构有关。CITED4在8年前就已经被克隆出来，但人们对它的了解甚少。在这里，我们证明了CITED4在心脏中表达，并且其表达量随运动而增加。CITED4受C/EBP负调控，而在新生心肌细CITED4表达的实验性变化能调节细胞增殖。强制表达CITED4还能提高cyclinD1的表达水平，cyclinD1能驱动心肌细胞的分裂。因此，C/EBP通过抑制CITED4的表达来发挥抗增殖作用，这一推断是高度合理的。然而，我们也不能排除其他通路的存在。斑马鱼胚胎的C/EBP下调能有效地引发细胞增殖，同时老鼠也有同样结果，这说明了心肌细胞中存在着一条进化过程中保守的通路。在斑马鱼胚胎中，心肌细胞的大小并没有受到影响，这可以反应出物种差异或者可以用处于寡核苷酸被利用的特殊发展阶段。通过比较了心脏肥大，心肌细胞增殖和决定心脏功能的一些关键基因的表达，可以看出C/EBP杂合子鼠的表型与耐力运动鼠的非常相似。而事实上，在体内进行以上两种通路的干扰，被分析的基因集合中，有42%的调控出现相