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1、临床生化检验应用工程师基础知识培训临床生化检验基础知识培训一、生化基础知识二、生化仪器基础知识三、部分生化项目的临床意义本文档仅供生化应用工程师参考阅览，更多专业知识请查阅后附参考文献。 刘伟杰 2013-6-27一、 生化基础知识1.1生化诊断试剂盒为由一定的化学品或者酶类组成的多成分混合试剂（Reagent），最终以水溶液的方式与待测物发生一系列化学或者生化反应，通过生成物或反应物中某物质的吸光度变化，测量待检测物中某种特定物质的含量。1.2生化诊断试剂用于检测样本，包括：人体血清（主要）、血浆及尿液中的各种酶类和代谢产物，用于预测，诊断以及治疗监测，协助临床医生诊治疾病提供数据参考。1.

2、3按功能分为：肝功、血脂、肾功、心肌、代谢、免疫&风湿、离子&其他。1.4试剂性能评价指标：1 试剂外观2批间差3准确度4精密度5线性（灵敏度）6抗干扰能力（特异性）7稳定性1.5试剂检测原理（朗伯比尔定律）：A=Kbc 式中，A 为吸光度;K 为吸收系数，是与入射辐射的波长及吸收物质的性质有关的常数 ;b为液层厚度，单位为cm;c 为吸收物质的浓度。当浓度的单位为 mol/L时，K 的单位为L/molcm，称为摩尔吸收系数，通常用 表示。摩尔吸收系数 表示物质对某一波长的辐射的吸收特性。愈大，表示物质对某波长辐射的吸收力愈强，因而分光光度法测定的灵敏度就愈高.1.6理论值与实测值偏差的解释：

3、实测值偏离了朗伯比尔定律。偏离 Lambert-Beer定律的因素：1复合光对Beer 定律的偏离：吸收定律要求入射光为单色光，而分光光度计单色光的纯度主要决定于色散元件及光路设计，即使高精度的仪器，也得不到纯单色光，而是波长宽度的复合光，其结果导致偏离Lambert Beer 定律。2 杂散光的影响：杂散光(stray light) 是进入检测器待测波长以外的光。主要来源于仪器色散元件表面的散射、单色器内壁尘埃等。3狭缝宽度的影响：单色器设有进、出口狭缝，狭缝愈窄，单色光愈纯，吸光度增加，但辐射能减小，对弱吸收带的测量有一定影响。定性分析时，为提高分辨能力常采用较小的狭缝，而定量分析时，在灵

4、敏度允许的情况下，宜采用较大狭缝。当出、入射狭缝宽度相等时，狭缝宽度引起的误差最小。4非吸收作用引起的误差：1.散射效应：光吸收定律只适用于均匀的吸收体系，如待测溶液是混浊的，当光通过时，将产生散射效应。其结果使光通过吸收物质的光程不固定，散射光的一部分和透射光一起进入检测器，导致偏离 Beer 定律。因此，免疫比浊法常用多点校准来做标准曲线。2. 荧光效应：分子吸收辐射能后产生的激发态分子以重新发射辐射的方式回到基态而发射荧光。由于多数显色体系荧光效应很小，而且荧光发射是各向同性，只有一部分沿透射光方向进入检测器，使测量吸光度偏低。一般情况下，荧光效应对分光光度法产生的影响较小。目前，多数光

5、度计设有两个样品室，对有荧光试样可置于离检测器较远的样品室，或在光路中插入适当的滤光片以消除荧光效应。5测定过程中产生的误差：化学反应引起的误差， 人为的误差等，在此不作详细解释。1.7生化测定方法：临床化学自动分析仪所涉及的测定方法包括终点测定法、连续监测法、固定时间法等。1.8.1生化分析基本术语概述：1双波长：由主波长和副波长构成的两个波长，测定样品采用双波长可以消除对实验的影响。主波长是指测定某物质时，生成的产物颜色对光吸收的特有波长。副波长是指测定某物质时，为消除其他干扰物质在主波长造成测定干扰所设定的波长。2反应杯空白：在特定波长下，光通过以蒸馏水或空气为反应体系所测得的吸光度值。

6、3试剂空白 ：在各特定波长下，光通过以蒸馏水或生理盐水为样品和相应测定项目试剂构成的反应体系所测得的吸光度值。4样品空白：在各特定波长下，光通过以生物样品和相应测定项目不含有引起反应的一种或多种成分的试剂构成的反应体系所测得的吸光度值;或由生物样品和相应测定项目试剂构成的反应体系产生反应最初时间所测得的吸光度值。5终点法 ：这是最常用的分析法。因为该法常有标准液，因此又称比例终点法，是经过一定反应时间后，当反应达到平衡(终点)时做到的一点分析法。一般是在一定温度下，试剂与样品经过一定反应时间，被送人比色系统，然后检测吸光度的变化，由微机系统处理计算和打印显示出结果。其中又分一点终点和两点终点法

7、。6续监测法：也叫速率法，此法通过测定酶所催化的反应速度，间接计算出酶的含量，称酶活性测定法。在酶促反应过程中，不是任何时期的反应速率都和酶浓度成正比。当酶促反应刚一开始，底物处于过量状态，酶与底物开始结合，生成复合物 (ES) ，底物浓度开始下降，此时产物尚未生成。当复合物(ES)分解，生成产物(P) ，酶促反应速度急骤上升，经过很短的作用时间后，产物的生成量或底物的减少量与反应时间成线性关系，反应速度保持恒定不变，这一时期称为零级反应期。随酶促反应继续进行，底物不断消耗，酶促反应条件逐渐变化，酶促反应速度逐渐减慢，产物生成或底物减少量的变化曲线遂趋平坦，这一时期称为一级反应期。此时的反应速

8、率常常不能准确反应酶的含量。因此其测光点一般要求取在反应达到平衡前。 7两点速率法：两点速率法也叫固定时间法，对测定及标准采用两个时间点测定。采用此方法的如肌酐（苦味酸法），目前多数自动分析仪还是用 Jaffe 氏反应测肌酐，即肌酐能同碱性苦味酸盐生成红橙色化合物，这个反应特异性不高，因为维生素 C 、丙酣酸、丙酣、葡萄糖、乙酷醋酸、果糖、氨基马尿酸、蛋白质及其他反应产物亦能与碱性苦位酸盐生成红色化合物，血清中的这些假肌酐约含25%。但真性肌酐与苦味酸的反应为快反应，假肌酐为慢反应，因此测试时测试时间一般在样品与碱性苦味酸试剂混合后 25 秒和 1 分 25 秒在 500nm 处测吸光度变化。

9、两时间点的吸光度变化之差，则为特异反应肌酐浓度。8普通免疫比浊与胶乳增强免疫比浊法：普通免疫比浊法是抗原与相应的抗体直接结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmission turbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。胶乳增强免疫比浊法是将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，制成致敏的胶乳颗粒，当遇到相应抗原时，发生交联反应，形成抗原抗体复合物，胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内并不阻碍光线透过，两个及其两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过的光减少，其

10、减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，即与待测抗原量呈正比，由此可检测样本中的特定抗原含量。 该法比普通免疫比浊敏感度高，试剂稳定，个体免疫复合物对结果影响也小，因此结果稳定、可靠，特异性好，精确度高。9参考物的量值溯源性:通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链,使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准,通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。10检测限： 是指检测系统可检测出的最低分析物浓度。又称分析灵敏度。灵敏度与线性范围：灵敏度与线性范围有着紧密联系，这也是跟生化仪的性能有关。灵敏度与线性范围的取舍就要根据其医学决定水平而定。一般仪器能测的光 密度值最大在35000。假设谋项目的

11、医学决定水平在0100，如果1个单位浓度变化能引起仪器吸光度响应量为1000，那么它能测的浓度范围为035，可以看出，虽然其灵敏度很高，但在其检测范围没有达到其医学决定水平，即线性范围太窄。相反，如果 1个单位浓度变化能引起仪器吸光度响应量为100，那么它能测的浓度范围为0350，这个线性范围是可以的。因此，灵敏度与线性的评价，要根据其医学决定水平而定。 1.9常用校准方法：终点法或两点速率法，必须通过使用标准液，建立一条标准曲线；速率法，采用标准液校正可消除系统误差，也可直接输入Factor值。校准类型：空白定标：以水做标准液，消除试剂本身对测试的干扰；（酶类） 两点定标：以水作为零点，标准

12、液作为另一点，建立标准曲线；（Y=AX+B）多点定标：两个以上的标准液建立一条标准曲线；（ LOGIT-LOG ）1.10参考区间与医学决定水平： 临床实验室检验结果对被检验者低正常还是异常，有何临床意义，如何用检验结果协助临床医生诊断和治疗，这就涉及到参考区间和医学决定水平了。 参考区间大多是采用正态分布的原理制定，以95%的分布区间（x2s）即为参考区间的上、下限，少数用百分位数来制定参考区间。不论采用什么方法，总有少数正常人的测定值落在异常范围内。因此，假性结果是避免不了的。当结果接近上限或下限时，不要轻易下正常或有病的结论，要根据被测者的其他表征综合判断或过一段时间复查后，再做分析。

13、医学决定水平是由Barnett于1968年首先提出的。是指临床上必须采取措施时的检测水平。决定性水平是一个阀值，高于该值或低于该值，应决定对患者采取适当的治疗措施。医学决定水平可在疾病诊断中起着排除或确认的作用，对某些疾病进行分级或分类，或愈后做出估计，来提醒医生在临床上做出相应的处理方式。 医学决定水平与参考区间的区别在于，它不仅对健康人的数值进行研究，以决定健康人的范围，同时还对有关疾病的不同病情的数据进行研究，以定出不同的决定性限值，以引导医生采取不同的临床措施。它的应用可以克服只使用参考范围的缺点，使一个检验结果对病人能起到提供诊断，处理依据的作用。1.11酶法检测基本知识：酶是由活细

14、胞产生并能在体内起催化作用的，一类特殊蛋白质。体内几乎所有的代谢反应都是在不同的酶催化下进行的。酶的催化效率高，对底物有严格的选择性，酶非常不稳定，酶浓度的变化是许多疾病的敏感指针，这是建立和发展诊断酶学的依据。用酶作试剂(工具酶)测定非酶物质具有效率高、特异及易于实现自动分析的特点，是目前临床生化检验的主流方法。1.11.1酶促反应速度的因素：包括:酶的浓度、底物的浓度、激活剂与抑制剂、pH 和温度等。在研究某一因素对酶促反应速度的影响时，反应系统中其他因素不变。酶促反应中所指速度是初速度，因为这时的反应速度与酶浓度成正比，可以避免产物及其他因素对反应速度的影响。在建立定量测定酶活性的方法时

15、，需要研究酶促反应的速度及影响此速度的因素，通常称之为反应动力学。 1.11.2酶活力测定 酶的含量很低，除免疫学方法外，不能直接测定其含量，只能测其催化反应过程中一定时间内物质变化的量，即酶促反应速率，或称酶的活力。要保证只有待测酶的量影响反应速率，其他各种影响反应速率的因素都在严格控制之下，并保持各测定间的一致性。(一) 酶促反应的过程 通过测定底物浓度的下降，或测定产物浓度的上升，可以追踪酶反应过程中底物转变为产物的过程。通常多测定产物的形成，因为测定产物从零或者从低浓度的增加，比测定高浓度底物的下降更可靠。典型的酶反应过程曲线分为几个时期。紧随着加人血清或底物启动反应后，在出现明显的变

16、化前为延迟期;此期从几秒到几分钟。随后是底物和产物变化与时间成直线的时期，形成产物的速率恒定，此时期的速率为反应初速度。此期底物也下降，但实际上反应速度与底物浓无关，对底物浓度而言，酶促反应实际上是零级反应。反应曲线的直线期时间长短相差悬殊。紧跟着是反应速率持续下降，进入速度依赖于底物浓度的一级反应期。在这一期中，底物浓度下降，逆反应增加，抑制性产物蓄积，乃至酶本身进行性的灭活等因素也起作用。最后，当底物起尽或达到平衡时，反应停止。在零级反应期中，测定一定时间内形成产物的量，是以此期中速率维持恒定为条件。否则表观的反应速率将不正比于酶浓度。也就是选择的监测点必须在反应速率恒定区（零级反应期）。

17、在正常测定中，为了能缩短延迟期和延长线性期，不仅要适量的底物浓度，还要在试剂中加入某些激活剂和其他的辅助因子。以改善反应进程曲线。(二)固定时间法和连续监测法 在我国临床实验室中，目前测定酶活性的方法，已从手工操作的固定时间法及两点测定法过渡到连续监测法。固定时间法在反应过程中测定一点的吸光度;两点测定法是在反应开始及反应经一定时间后，分别测两点的吸光度，根据两点间吸光度的差值，推算酶的活力。固定时间法和两点测定法都是在酶和底物孵育一段时间后测定总的变化。两点测定法也应属于酶动力学测定方法，但动力学测定法这一术语，习惯上仅指多点测定的动力学方法，即所谓速率法或连续监测法，不论用手工法或自动法。

18、固定时间法和两点测定法可能会有几种误差:酶活力非常高的样品，由于底物消耗速度快，反应很快呈现迟缓或停止；有一些反应类型延迟期长；某些标本的反应曲线可能是非线性的；活力高的标本，超出了限定的活力测定范围，若稀释标本可能会引起催化活力不成比例的变化。由于光度计及方法学的改进，可以缩短孵育时间，增加酶活力测定范围，缩短延迟期，增加线性期，使固定时间法仍发挥重要作用；尤其在中小医院实险室中更有实用价值，甚至一部分生化分析仪也采用了固定时间法。 1.11.3酶法分析酶法分析即酶作为分析试剂，有利于提高测定结果的特异性;不需要先将测定的物质分离和提纯;可以直接分析血清这样复杂的濡合物。具有绝对特异性的酶，

19、即只作用于某一种物质的酶，特别适合分析用。尿酸氧化酶、尿素酶、葡萄糖氧化酶特异性高。但实际上不能都如此。因此，必须了解酶对底物的特异性，从而预料可能发生的干扰反应并设法纠正。在以酶作分析试剂测定某-物质时，也可用偶联反应;而且偶联反应的特异性可以增加反应全过程的特异性。如用己糖激酶 (HK) 法测葡萄糖，HK 也作用于果糖产生相应的 6-磷酸醋;但偶联的指示反应是G6PD ，它特异地催化葡萄糖-6-磷酸的反应，用此酶测定己糖激酶催化反应的产物，明显地提高了偶联系统的特异性。(一) 传统的酶法分析非酶物质方法以酶作试剂进行分析的方法有两种。广泛应用的第一种方法，是使反应进行到完全，使全部底物转变

20、成产物，称终点法。这是最理想的分析类型。但是，在非理想的平衡时，底物远未完全转变。此时需增加酶或非酶的反应，以转变或捕获第一个反应的产物，使反应在所要求的方向上进行到完全。如用乳酸脱氢酶测定乳酸中，形成的丙酣酸，通过加入硫酸阱形成腺而捕获丙酣酸，使反应达到完全。第二种方法是动力学法，即间隔一定的时间测定底物的变化量(=速率)。由酶促反应进程曲线已知，开始为高底物浓度由酶催化的反应，首先服从零级反应，然后随着底物浓度减低，进入一级反应期。对于任何一级反应，反应开始后在一给定时间 t 的底物浓度 (S) 为:(S) =(So)*e-kt (So) 是最初的底物浓度，e 是自然对数的底，K 是速率常

21、数。在t1到 t2 的固定时间间隔中，底物浓度的变化量 (S) 与 (So) 的相互关系为:(So)=- (S)/( e-kt- e-kt2)也即在一固定时间间隔中，底物浓度的变化量正比于底物的初浓度。这是一级反应的通性。对于酶的反应，当(S )Km 时，米氏方程简化为:V=(Kmax/Km)*(S)K 为一级速度常数。在反应过程中的两个固定时间，测量与底物浓度性质相关的(如光吸收)的方法为两点动力学法。从理论上讲，这是用酶法测定底物的最准确的方法；但方法学上比平衡法要求高，所有影响反应速率的因素如 pH 、温度及酶量必须在两点分析中保持恒定，并准确定时。必须用标准液进行校正。为保证一级反应条

22、件，底物浓度必须低至小于 O.2xKm 。酶对底物的 Km 要高，以便测出较宽范围的底物浓度。为增加试剂酶的表现 Km 值，可引进竞争性抑制剂。此外，被测非酶物质作为酶促反应激活剂者，则用连续监测法，如无机离子钾和钙的酶法测定。(二) 酶循环法分析非酶物质酶循环法 ( enzymatic eyeing method ) ，是利用酶的底物特异性放大靶物质(被测物)以提高灵敏度的测定方法。只循环靶物质，减少了样品存在的其他物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或对靶物质进行提取，而且不需要特殊设备，是一种很有前途的测定技术。利用酶循环法测定的项目主要是总胆汁酸（TBA）。二、生化仪器基础知识

23、2.1检验科常见全自动生化分析仪： 日立：7100、7170、7080、7180、7600， 奥林巴斯：AU400、AU640、AU2700、AU5400 贝克曼：CX3、4、5、7、9、LX20、DXC800,AU480，AU680，AU5800 东芝：TBA-40、TBA-120 雅培：2000、C8000、AEROSET 拜尔：ADVIA1200、ADVIA1650、ADVIA2400 2.2下面简单介绍几个常用品牌的相关仪器性能 日立：现在各医院所用日立仪器的型号主要为7180、7600，除7080为31个测光点外，其余都为34点。以下为7180仪器主要性能介绍：分析速度： 800个测

24、定/小时（最大），约4.5秒加样一次可分析项目： 86项（带ISE的话，最大可达89项），计算项目8项样本量： 1.535.0l，0.1l可调试剂量： 20270l，1l可调总反应体积： 120300l, 测光时必须满足该条件光源灯： 保质期750小时比色杯： 20只8组共160只，依据杯空白值进行更换测光系统：采用凹面蚀刻光栅的后分光、双波长测定方式12个波长：340、405、450、480、505、546、570、600、660、700、750、800nm稳定性高且可有效补偿样本混浊、溶血、黄疸及电源电压变动引发的干扰测定过程： 全反应监测，10分钟测定34次吸光度值。15分钟测定53次吸

25、光度值依据实验要求选择相应测光点的吸光度值计算结果样本容器：样本针有液面探测装置，可使用原始采血管离出血清后直接上机测定试剂： 同一项目最多可加入四步试剂，两试剂舱位置各45个，温度515。 奥林巴斯：AU400、AU640、AU2700、AU5400奥林巴斯生化仪已经被贝克曼收购，除AU400、AU640、AU2700、AU5400外，还有一款AU680，其操作界面为贝克曼公司设计，但主要性能跟以往的AU640基本保持一致。测光点为27个，R2试剂在1011点加入。以下为AU400/600/640等型号设参数需了解的仪器性能：Sample vol（样品量）：250,可以按0.5ul为单位增减

26、。Reagent 1 vol（第一试剂量）：25-300,可以按1ul为单位增减。Dil vol(稀释液-吐水量)：一般用浓缩试剂时才用。Reagent 2 vol（第二试剂量）：25-300，可以按1为单位增减。Dil vol(稀释液-吐水量)：一般用浓缩试剂时才用。第二试剂是固定的10-11点之间加入的。测定波长共有13种：340,380,410,450,520,540,570,600,660,700,750, 800nm。Method（方法学）共六种：End,Rate,Fixed;End1,Rate1,Fixed1。前三种与后三种的差别为：前三种是以试剂为空白的，后三种是以比色杯为空白的

27、。Reaction（反应方向）：-，+。End与Fixed法不起作用，但是Rate法一定要输正确。Linearity（线性）：Fst ，Lst，Rate法才输入，一般国产试剂30%；进口试剂：15%。No-Lag-Time： Rate法才输入，在读点期内，如果反应太快，超过线性（Linearity限）仪器会自动用线性比较好的那一段来计算。试剂空白OD限：Fst指的是0点，Lst指的是27点。只对Rate法有用，一般向下的反应，输0.92.5，向上的反应-2.00.8。下图显示屏幕上的基本显示模型 贝克曼：CX3、4、5、7、9、LX20、DXC800，贝克曼仪器是作为急诊用的优先选择仪器，其有

28、较高的准确度，精密度和稳定性，抗交叉污染也是一流的，但不适合常规大量样本的检测，其试剂消耗量也是现有仪器中比较大的。贝克曼仪器波长数为10个，340,380,410,470,520,560,600,650,670,700nm。监测时间不是以周期（点）计，而是以秒来计，每8S测一次吸光度。加样时间为第0s, 第二次灌注时间为-180s，或9738s。贝克曼仪器必须用两个波长测定，否则仪器不运行，在设参数时必须符合这一规律。 拜尔（西门子）： ADVIA2400 ，测试速度2400 Test /小时，比色法1800Test/小 时，电解质600测试/小时。其中有波长：340/410/451/478

29、/505/545/571/596/658/694/751/805/845/884nm 14个。测试方法：终点法（EPA）、速率法（RRA）、两点速率法（2PA）及多点均相免疫分析。微量取样技术：所有的样本按1:5比例进行预稀释处理（30ul样品+120ul生理盐水）一般可作15个项目分析。微量技术加试剂保证每测试平均试剂体积为80ul-120ul，理论上1mL的试剂能做12.5个测试，最低也能做到8个测试。体现了其最大优点就是省试剂。2.3不同型号的生化仪每毫升试剂测试数是不一样的，以下是各品牌的理论测试数： 7170：180-380ul 5.5 T/ml 7060：250-500ul 4 T

30、/ml AU400:150-350ul 6.6 T/ml BECKMAN: 200-330ul 5 T/ml TBA-40:120-360ul 8.3 T/ml TBA-120:80-360ul 12.5 T/ml ADVIA2400：80-120ul 12.5 T/ml 进口仪器4-5人份/毫升；国产仪器3-4人份/毫升三、各生化项目的临床意义及其检测原理：3.1肝功能测定项目（15项）3.1.1 血清总胆汁酸TBA：胆汁酸是由胆固醇在肝脏中分解代谢所生成的，肝胆、肠、门静脉都参与胆汁酸的自主循环过程。胆汁酸主要存在于肠肝循环系统并通过再循环起一定的保护作用。只有一少部分胆汁酸进入外周循环。

31、促进胆汁酸肝肠循环的动力是肝细胞的转运系统棗吸收胆汁酸并将其分泌入胆汁，经胆囊诱导的胆囊收缩，小肠的推进蠕动，回肠粘膜的主动运输从血液经门静脉流入。 血清中胆汁酸的水平是反映肝脏损伤的重要指征，一旦肝细胞发生病变，血中胆汁酸浓度极易升高。急性肝炎、慢活肝、肝硬化、肝癌，TBA结果明显升高。与ALT比较，急性肝炎、慢性活肝ALT、TBA都较敏感，但肝硬化、肝癌两种结果差异明显：TBA阳性率高达95%，而ALT阳性率仅为20%。因此，TBA测定用于监测慢性肝病价值很大。其测定方法简单，是一项很具实用价值的肝功能诊断指标。检验原理:血清中的胆汁酸（3-羟类固醇）会被3-羟类固醇脱氢酶（3-HSD）及-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD+)特异性地氧化，生成3 - 酮类固醇，同时Thio-NAD+ 被还原成-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)。新生成的3 -酮类固醇在3-羟类固醇脱氢酶（3-HSD）及-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(NADH)存在下，还原成胆汁酸，同时NADH氧化成-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型（NAD+）。通过酶的循环反应，微量胆汁酸的量被放大。在405 nm处测定Thio - NADH吸光度的变化值，可求得血清中胆汁酸的含量。3.1.2 谷丙转氨酶ALT/GPT：丙氨酸氨基转移酶(ALT)， 又称谷丙转氨酶，主要存在于组织细胞中，正常状况下只