核酸的组成和分类.docx

1、核酸的组成和分类核酸的组成和分类 核酸的基本结构单位是核苷酸，核苷酸由核苷和磷酸组成，核苷由碱基和戊糖组成。DNA中戊糖为D-2-脱氧核糖(D-2-deoxyribose)，碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶；RNA中戊糖为D-核糖(D-ribose)，碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。碱基和戊糖的化学结构组成核酸的碱基主要为嘌呤衍生物和嘧啶衍生物，核酸中的嘌呤衍生物都是腺嘌呤和鸟嘌呤。嘌呤碱基由母体化合物嘌呤衍生而来。嘧啶碱基是母体化合物嘧啶的衍生物，DNA：嘧啶衍生物为胞嘧啶和胸腺嘧啶，RNA：嘧啶碱为胞嘧啶和尿嘧啶，但tRNA中含有少量胸腺嘧啶核酸中还发现一些修饰碱基，也称稀有碱

2、基，它们绝大部分也都是嘌呤和嘧啶类化合物。稀有碱基含量很少，种类却很多，以甲基化的碱基居多。核酸中，tRNA含稀有碱基最多，含量可高达10。（自己画结构）DNARNA尿嘧啶（U）5羟甲基尿嘧啶（hm5U）5甲基胞嘧啶（m5C）5羟甲基胞嘧啶（hm5C）N6甲基腺嘌呤（m6A）5,6-二氢尿嘧啶（DHU）5甲基尿嘧啶，即胸腺嘧啶 (T)4硫尿嘧啶（s4U）5甲氧基尿嘧啶（mo5U）N4-乙酰基胞嘧啶（ac4C）2-硫胞嘧啶（s2C）1甲基腺嘌呤（m1A）N6,N6-二甲基腺嘌呤（m26A）N6-异戊烯基腺嘌呤（iA）1甲基鸟嘌呤（m1G）N1,N2,N7-三甲基鸟嘌呤(m32，2，7G)次黄嘌呤

3、（I）1甲基次黄嘌呤（m1I）核酸根据戊糖的种类分类，构成DNA的戊糖是D-2-脱氧核糖，RNA链的戊糖是D-核糖。此外, 还发现有D-2-O-甲基核糖。糖环上的C原子编号为1，2，3，4，5。核苷戊糖与碱基缩合而成的化合物称为核苷。 1、核苷的分类 按照戊糖种类的不同：核糖核苷，脱氧核糖核苷，2-O-甲基核苷；按照碱基的不同：嘌呤核苷和嘧啶核苷2、核苷的结构特点 核苷结构中糖基与碱基以-糖苷键相连，称为N-糖苷键，核苷中戊糖均为呋喃型环状结构。在空间结构上碱基与糖环平面互相垂直，在DNA双螺旋中碱基配对是以反式定位的，碱基上的氨基或酮基可以互变异构为亚氨基或烯醇基。不同pH条件下核苷有不同的

4、解离态。核苷酸 1、种类 核苷的磷酸酯叫核苷酸，分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类。核糖核苷的戊糖分别可形成 2 、3、5三种核苷酸；脱氧核糖核苷只能形成3和5-核苷酸；2-O-甲基核苷也只有两种核苷酸。生物体内存在的游离核苷酸多以5形式存在，碱水解RNA时，可得到2,3核糖核苷酸的混合物。 2、核苷酸的结构 3、多磷酸核苷酸 核苷中戊糖的羟基被一个磷酸单酯化，称单磷酸核苷酸或单磷酸酯，核苷还有二磷酸酯和三磷酸酯。细胞中含有少量游离存在的多磷酸核苷酸，它们既可以作为核酸合成的前体，也可以是生物体内的辅酶或能量载体。（ATP）4、环核苷酸 在细胞中的含量很低，却有极重要的生理功能，在细胞内往往

5、作为重要的调节分子和信号分子，常被称之为“第二信使”。常见的环核苷酸有3,5-环化腺苷酸（cAMP）和3,5-环化鸟苷酸（cGMP）核酸分子的结构及表示方法 1、结构 核酸是由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接而成的线性分子 2、表示方法 1）碱基表示法 ademine：Ade; thymine：Thy一般不使用碱基符号 2）核苷的表示法核苷一般以单字母表示，A、G、C、U，脱氧核苷以dA, dG, dC, dT表示；修饰成分的表示方法是在缩写符号左面以小写英文字母和数字注明取代基种类、数目和位置。例如：m26A：即N6,N6二甲基腺苷；m32,2,7G：即N2,N2,N7三甲基鸟苷3) 核苷酸

6、的表示法 核苷符号左方的小写字母p，表示5-磷酸酯，核苷符号右方的小写字母p，表示3-磷酸酯。如pA：5-腺苷酸，Cp：3-胞苷酸。多磷酸酯以小写字母p的数目表示，ppU；pppA；ppGpp：鸟苷四磷酸，3,5-环化核苷酸书写为cAMP，cGMP等。4）核酸链的表示法 从左向右从5端写至3端 (5)pApGpC pUpC(3)， AGC UC，AGC UC竖线表示核酸的戊糖碳链，A、G、C、T表示碱基，p代表磷酸基，p引出的斜线一端与C3相连,另一端与C5相连DNA分子的碱基组成 1、A = T、G = C ，A + G = T + C 2、DNA的碱基组成具有特异性 不同物种的DNA有自己

7、独特的碱基组成，同一物种的DNA没有组织和器官的特异性，也不随年龄、环境和营养状态变化DNA的一级结构DNA的一级结构就是核苷酸在DNA分子中的排列顺序。DNA是由A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接起来的直线型或环型多聚体，DNA也是一种生物高分子。生命信息绝大部分贮存在DNA分子中，以核苷酸不同的排列顺序编码在DNA分子上，核苷酸排列顺序变了，其生物学含义也就不同了。DNA分子结构无支链。DNA的二级结构1、双螺旋结构的基本特征 1）主链 两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴以右手螺旋相互盘绕而成。多核苷酸链的方向习惯上以C3C5为正向，磷酸核糖处于螺旋外侧，是亲水

8、性的，糖环平面与中心轴平行。 2）碱基对 由于几何形状的限制，只有嘧啶和嘌呤配对形成的碱基对才能合适地安置在双螺旋内，碱基位于双螺旋内侧，碱基平面与中心轴垂直，两条核苷酸链依靠碱基之间的氢键维系。碱基之间的疏水作用可导致碱基堆积，碱基堆积力和碱基对之间的氢键共同稳定了双螺旋结构。碱基互补原则：A与T配对，形成两个氢键，G与C配对，形成三个氢键。该原则是DNA复制、转录等的分子基础。3）大沟和小沟 双螺旋表面有两条螺形凹沟，一条深，一条浅，深的称大沟，宽1.2nm，深0.8nm，浅的称小沟，宽0.6nm，深0.75nm 4）结构 双螺旋平均直径为2nm，相邻碱基对之间的距离，也称碱基堆积。距离是

9、0.34nm，相邻碱基之间的夹角为36O，每10个核苷酸形成一个螺旋，螺距3.4nm。实际的DNA分子平均每一螺周含10.4个碱基对，二个配对碱基不在同一平面，而是扭曲成螺旋浆状，以提高碱基堆积力，使DNA结构更稳定。2、双螺旋结构的类型 1）B-DNA 相对湿度为92% 时得到的DNA钠盐纤维，这种DNA称B型DNA，生物体内天然状态的DNA几乎都以B-DNA形式存在。以上讨论的双螺旋特征均为B型双螺旋。 2）A-DNA 当DNA钠盐（或钾盐、铯盐）在相对湿度75%时，DNA就处于A型构象。A-DNA也是由两条反向的多核苷酸链组成的双螺旋，也为右手螺旋，但螺体宽而短，碱基平面与螺旋轴有19

10、O的倾角，上下两个碱基相差2.56，二个相邻碱基的夹角是32.7 O，螺距为28。RNA分子的双螺旋区及RNA-DNA杂交双链的结构类似于A-DNA。A型和B型结构是DNA分子的2个基本双螺旋形式，A型结构的螺旋比B型螺旋更紧，碱基倾角更大，大沟的深度比小沟深得多。 3）Z-DNA 自然界中还有一种Z-DNA，为左手螺旋，所以它也称左旋DNA。B-DNA与Z-DNA之间可以互变3、三螺旋DNA 在三股螺旋中，通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合，第三股核苷酸链与寡嘌呤核苷酸之间为同向平行，第三股链的碱基可与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱基形成Hoogste

11、en氢键。三股螺旋中的第三股既可以来自分子间，也可以来自分子内。比如，当DNA的一段多聚嘧啶核苷酸或多聚嘌呤核苷酸组成镜像重复（即H-回文结构），就可以回折产生三螺旋结构。DNA的三级结构DNA的三级结构指DNA分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括不同二级结构单元间的相互作用，单链与二级结构的相互作用以及DNA的拓扑特征。环状DNA：生物体内有些DNA分子以双链环型DNA形式存在，如细菌染色体DNA，质粒DNA，细胞器DNA等。正常的DNA分子处于能量最低状态，如果将正常的双螺旋拧紧或拧松，分子会产生额外张力。若双螺旋末端是开放的，张力可以通过链的转动而释放，如果末端被固定或形成环状分子，

12、张力只能在内部消化，即DNA内部原子的位置会重排，导致分子扭曲以抵消张力，这种扭曲就称为超螺旋。超螺旋是DNA三级结构的一种形式。天然DNA分子的超螺旋一般为负超螺旋，超螺旋的DNA结构比较紧密，密度较大，在离心场中移动较快，在电泳中泳动的速度也比较快，应用超离心及凝胶电泳可以分离不同构象的DNA。DNA分子的一些重要特性 1、DNA分子的长度 大肠杆菌染色体DNAbp:4106,MW:2.6109,长度:1.4106nm; （L/D7*105）;人类DNA分子bp:3.2109,长度约1米（L/D108）。极易受机械力的影响而降解。 2、DNA分子的稳定性 DNA在生理状态下十分稳定，维持这

13、种稳定性的主要因素是氢键和碱基堆积力。氢键：GC A-T，碱基堆积力：相邻两个螺旋间碱基的电子之间可以产生堆积。DNA的碱基集中在双螺旋内侧，层层堆积起来的碱基在螺旋内形成了强大的疏水区，使之与介质中的水分子隔开。维持DNA分子稳定性的其它因素还有正负电荷之间的静电引力和范德华力。（介质中的阳离子与核苷酸中的PO4-3） 3、DNA分子的可塑性 由于热力学作用，在溶液中，DNA骨架上的共价键转角会改变，引起DNA分子的弯曲，缠绕或伸展。 4、DNA分子结构中的碱基互变异构体 DNA的化学性质与碱基上的氢原子位置有关，碱基上的氢原子具有较固定的位置, A和C上的氮原子基本上是以NH2形式存在，只

14、有少数亚胺基；同样G和T上的氧常常是酮式，很少有烯醇式。这一现象具有极重要的生物学意义,它是碱基互补原则、双螺旋结构、DNA复制乃至遗传学的基础。互变异构偶尔会发生，极端情况下碱基会有不同的解离态，这是DNA突变的原因之一，也会导致生物的进化RNA分子的组成及二级结构 1、RNA的组成 RNA的组成与DNA类似，也由四种核糖核苷酸组成：腺嘌呤核糖核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸，胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸。与DNA相比，核糖核苷酸中，核糖替代了脱氧核糖，尿嘧啶取代了胸腺嘧啶。RNA组成上的另一个特点是存在稀有碱基，尤其是tRNA中稀有碱基为数较多。 2、RNA的二级结构 RNA分子中核苷酸的戊糖是核糖

15、，而不是脱氧核糖。RNA是核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的线性分子，并且分子中磷酸二酯键是通过3,5-连接的，而不是2,5-的连接。与DNA类似，RNA也是无分支结构。天然RNA不象DNA那么规整，它是单链线性分子，只有局部区域通过分子的自身回折使碱基互补，形成氢键，从而形成双螺旋结构。双螺旋区至少由4-6个碱基对形成，结构为A-DNA型。双螺旋区约占RNA分子的一半。RNA的类型任何生物体都存在三种主要的RNA，mRNA，tRNA，rRNA。mRNA负责接受DNA分子的遗传密码信息（即蛋白质中氨基酸排列顺序），并以自身为模板合成蛋白质。tRNA 在蛋白质生物合成过程中负责接受、转运和掺入氨

16、基酸。rRNA是构成核糖体的重要成分，而核糖体是蛋白质生物合成的场所。绝大多数RNA分子是在细胞核内合成的。核内存在着各种前体RNA，都是由细胞核DNA转录产生的，它们的分子量往往很大，必须经过剪切，装配和修饰等一系列加工过程才能产生成熟的RNA，进入细胞质中行使生物学功能。上述三种存在于细胞质中发挥作用的RNA都称为“成熟RNA” 1、tRNA1）tRNA的特征 A.含7393个核苷酸,分子量约为25000,沉降系数为4SB.稀有碱基较多，近50种稀有碱基存在于tRNA，每个tRNA分子至少有219个修饰碱基，可达碱基总数的1015%.稀有碱基的作用是提高tRNA与 rRNA和蛋白质等特定分

17、子的识别能力，并增强疏水作用.C.3末瑞(接受末端)：CPCPA-OH作用：接受活化的氨基酸D.5末端：pG.或 pC.E.二级结构均呈三叶草形,叶柄：双螺旋区,叶子：突环区,F.三级结构象倒L形2）tRNA的二级结构tRNA的二级结构中，双螺旋区比例较大，结构很稳定.氨基酸臂：含7个bp,富含G,末端为CCA,接受活化的氨基酸。二氢尿嘧啶环：由8-12个核苷酸组成，其中含2个二氢尿嘧啶。通过二氢尿嘧啶臂（3-4bp组成的双螺旋区）与tRNA分子的其余部分相连。反密码环：含7个碱基，环中部三个碱基是反密码子，可以识别mRNA的密码子。反密码环通过反密码臂（5 bp组成的双螺旋区）与tRNA其余

18、部分相连。额外环：含3-18个核苷酸。不同的tRNA，额外环大小不同，所以该环可以作为 tRNA 的分类标志。假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环TC loop：7个核苷酸通过由5对碱基对组成的TC臂与tRNA的其余部分相连。绝大多数tRNA在此环中都含有TC，大多数tRNA的第54-56位存在TC序列。它对于tRNA分子与5S rRNA的结合和tRNA高级结构的维系有重要作用。假尿苷，是目前确定的糖苷键连接方式唯一与众不同的核苷，它是由嘧啶环的C5与核糖的C1形成糖苷键。3）tRNA的三级结构tRNA的生物功能与三级结构密切相关。2、mRNA mRNA占细胞RNA总量的3-5%，不同的mRNA长度

19、不同，分子量变化很大，平均分子量约，沉降系数8S。细胞内mRNA种类繁多，因为每一种多肽都有一种特定的mRNA编码。原核生物mRNA为多顺反子结构，即一条mRNA链上有多个编码区，它以操纵子为转录单位，3和 5末端都有一段非翻译区，并且原核生物的mRNA无修饰碱基。真核细胞mRNA的结构特点 1）3-末端Poly A结构 长约20250个核苷酸 2）5- 末端帽子（cap）结构作用：抗5- 核酸外切酶的酶解，保证翻译活性协助核糖体识别并结合mRNA，使翻译从AUG起始密码子处开始，保证蛋白质合成的正确性 3）编码区和非编码区 mRNA的编码区是所有mRNA分子的主要结构部分，编码区包含蛋白质的

20、信息，编码特定的蛋白质分子。三联体密码在所有生物中通用。无论原核还是真核生物的mRNA都存在5端和3端两个非编码区，非编码区常常含有起调控作用的区域。游离的mRNA可以有高级结构，但翻译时必须首先解开高级结构，所以mRNA形成高级结构后不利于翻译进行。3、rRNArRNA在细胞RNA中含量最大，约占80%， rRNA构成核糖体的骨架，并可与mRNA和tRNA相互作用，促进蛋白质的合成，近年来的研究证明，rRNA能够催化肽键的形成。原核细胞中有三类rRNA：5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA；真核细胞中有四类rRNA：5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA和28S

21、rRNA。核酸的紫外吸收1、核酸具有紫外吸收 吸收范围：240-290 nm，max =260nm，利用核苷酸的吸收特性可以定量测定核苷酸。2、根据紫外吸收判断样品纯度对于纯的核酸分子或寡核苷酸，测定光吸收值A260，可以估算样品的含量。A =1：50g/ml双螺旋DNA或40g/ml单链DNA(或RNA)或20g/ml寡核苷酸。纯的核酸样品的A260/A280的比值基本为一固定值纯的DNA：1.8，纯的RNA：2.0。核酸常常与蛋白质混合在一起，当样品混含杂蛋白时，该比值会明显降低（因为蛋白质的最大吸收在280nm）。3、用摩尔磷消光系数(p)表示溶液中核酸核酸分子中碱基和磷原子含量相等，可

22、以用P的含量来表示核酸的含量。(p) = A/CL = 30.98A/WL，其中A：光吸收值，C：磷的摩尔浓度，L：比色杯内径，W：每升溶液中磷的重量（g）。天然DNA的(P)为6600，RNA为7700-7800。核酸的(P)比核苷酸单体低，单链多核苷酸的(P)比双螺旋多核苷酸的(P)要高。增色效应：核酸变性时，(P)增加；减色效应：当核酸复性时，(P)降低。核酸的变性、复性及杂交（一）、变性 1、变性和降解 DNA的变性过程是双螺旋结构被破坏，物化性质发生改变的过程。核酸的变性指核酸分子双螺旋区的氢键断裂，双链解体成单链，其间不涉及共价键的断裂。 核酸的降解指多核苷酸骨架上共价键的断裂，因

23、而引起核酸分子量的降低。氢键的破坏导致变性，共价键的破坏导致降解 2、变性DNA物化性质的改变 1）粘度大大降低2）沉降速度提高3）浮力密度增大4）260nm处的紫外吸收增加5）比旋下降6）酸碱滴定曲线改变。DNA会部分甚至全部失去生物活性 3、影响核酸变性的因素 热变性：提高温度破坏双螺旋区的氢键 酸碱变性：改变溶液pH值，导致氢键和疏水相互作用被破坏 化学试剂变性：有机溶剂、尿素、甲醛可以破坏疏水相互作用 4、DNA的熔解温度Tm DNA变性的特点是爆发式的，即变性作用发生在很窄的温度区间。当温度提高到某一个温度范围，DNA突然变性。在温度提高的过程中，以温度对紫外吸收作图，会得到一条S形

24、曲线DNA的变性曲线。DNA的熔点Tm (熔解温度)：通过加热使DNA的双螺旋结构解旋50时的温度，DNA的Tm一般在82 - 95之间。影响Tm值的因素：）DNA的均一性：均一性愈高，熔点范围越窄）G-C bp含量：含量越高，Tm越高。G-C %=（Tm 69.3） 2.44 )介质的离子强度：在低离子强度介质中，DNA的Tm下降，熔解温度范围较宽，而在离子强度较高的介质中，DNA的Tm较高，熔解温度范围较窄。 5、RNA的变性 RNA也会发生变性，但RNA的Tm较低，变性曲线较宽，然而tRNA因为双螺旋区较大，因此Tm较高；而双链RNA的变性与DNA相同。（二）、复性复性：在适当条件下，变

25、性DNA的两条链重新缔合成双螺旋结构的过程。复性后，DNA的物化性质得以恢复，生物活性也可部分或全部恢复。DNA复性的影响因素1、降温速度 退火：变性DNA缓慢冷却而复性的过程 2、DNA片段的大小 3、DNA的浓度 4、核苷酸顺序的复杂程度（三）、核酸的杂交若将异源DNA一起变性，如果它们之间有部分序列相同，复性时会形成杂交分子。 DNA分子间可以杂交，DNA与互补RNA也可以杂交。核酸的杂交是分子生物学和分子遗传学等研究中的重要手段。核酸的杂交既可以在液相进行，也可以在固相进行，实验室应用比较广泛的杂交方法是在硝酸纤维素膜上进行的。DNA酶解电泳变性转移烘烤杂交洗涤放射自显影核酸的酸碱性质

26、1酸碱性质 核苷酸分子结构中的磷酸基团具有较强的酸性，它的H+极易解离，所以核酸具有相对强的酸性，核酸可视为多元酸。碱基的稳定性很大程度上依赖于氢键，氢键与碱基的解离状态有关，所以溶液的pH直接影响着双螺旋结构乃至核酸的稳定。核酸分子中既有酸性基团，又有碱性基团，核酸也是两性电解质，它在不同pH溶液中的解离程度不同。两性解离导致兼性离子的形成，所以核酸也有等电点。2核酸的水解酸水解：核酸分子的糖苷键和磷酸二酯键都可以被酸水解，其中糖苷键对酸更不稳定。嘌呤碱基的糖苷键比嘧啶碱基更易水解，而脱氧核糖与嘌呤碱基形成的糖苷键最不稳定。所以DNA在pH 1.6于37对水透析就可以脱嘌呤，得到无嘌呤酸。碱

27、水解：DNA的磷酸酯比较稳定，RNA的2- OH在碱性条件下，与3-位磷酸酯中的游离羟基形成不稳定的磷酸酯，随即链间的磷酸酯键断裂，产生2,3- 环磷酸酯，继而产生2- 核苷酸和3- 核苷酸酶水解：非特异性水解磷酸二酯键的酶称磷酸二酯酶，特异性水解核酸的磷酸二酯酶叫核酸酶。核酸内切酶：水解分子内磷酸二酯键，核酸外切酶：从核酸链的一端逐个水解核苷酸。非特异性的磷酸单酯酶对一切核苷酸都能作用，特异性的酶如 3- 核苷酸酶或5-核苷酸酶，只能分别水解3-核苷酸或5-核苷酸。核酸的分离与纯化1RNA的分离 RNA的分离比DNA复杂，因为RNA分子不稳定，更困难的是环境中到处存在 RNase，很容易降解

28、RNA，所以提取RNA时必须注意破坏RNase的活性。2凝胶电泳凝胶电泳 简单，快速，分离效果比其它方法好得多，无论大小分子都能很好地被分离。凝胶电泳对核酸的分离作用主要依赖于它们的分子量及分子构型，而凝胶的类型及其浓度对被分离核酸的分子大小关系重大。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电荷作用的双重分离效果，分离效率很高。琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)琼脂糖浓度：2.5 0.1%，分离片段大小：51045108 D，用于分析DNA较好，分析RNA时易降解，必须加入蛋白质变性剂。聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel ele

29、ctrophoresis，PAGE）胶的浓度：24 2.4 %分离片段大小：3.31021106 D，PAGE可分析小于1000个碱基对的DNA片段和RNA。影响电泳迁移率的因素1）核酸分子大小：迁移率与分子量对数成反比2）DNA的构象：超螺旋DNA迁移最快，线型DNA次之，开环DNA最慢3）胶浓度：迁移率与胶浓度成反比4）电压或电流：在一定的电压范围内，电泳迁移率与电压或电流大小成正比5）碱基组成：有一定影响，但不大6）温度：430，常为室温DNA的固相合成之化学合成步骤第一步：酸化 detritylation一般5-OH常用的保护基是DMT、MMT 等(di or monomethoxy

30、trityl)，它们在酸性条件下极易脱去，此步的目的就是脱保护，使 5-OH 游离出来，进行下一步反应第二步：偶合 coupling这一步是链的延长步骤，也是合成中最关键的一步第三步：保护 capping目的是封闭任何未参与反应的5-OH。此步非常重要，不能省略。Capping试剂常用乙酸酐。第四步是氧化oxidation偶合后的产物是亚磷酸酯，必须氧化成稳定的磷酸三酯。以上四步完成了一个循环，合成了一个核苷酸，然后进入下一个循环，每循环一次增加一个核苷酸，如此往复多个周期，直至链延伸完成得到的粗产品用EtOHNH3H2O处理，可将核酸链从载体上脱落，许多保护基也同时脱去。产物用电泳或/和HP

31、LC纯化，得到的DNA纯品可以进行各种生物学研究 聚合酶链反应（PCR）聚合酶链反应(polymerase chain reaction)是体外快速扩增DNA的一种生物技术，是一种无细胞复杂克隆法。基本原理：与DNA在生物体内的复制相仿，但它无法模拟体内的复制叉，因而需要将DNA变性，使双链分开，利用单链DNA与引物在退火过程中的杂交产生3游离羟基，然后在DNA聚合酶作用下，以dNTP 为底物，合成模版链的互补链。PCR技术操作简便，扩增效率极高，并且没有序列要求，可用于扩增任意的DNA片段。基本步骤：1、设计合适的引物 使目标DNA 的扩增行之有效，并最大限度地减少非特异产物。引物设计的原则：1）引物长度应大于16个核苷酸2）引物与靶序列间的Tm值553）引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列4）3引物和5引物之间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列5）引物中碱基的分布要尽可能均匀，G + C含量接近502、优化反应条件 包