《伏马毒素B1残留量测定荧光偏振免疫分析法》河南地.docx

1、伏马毒素B1残留量测定荧光偏振免疫分析法河南地伏马毒素B1残留量的测定 荧光偏振免疫分析法河南省地方标准编制说明1 工作简况1.1 任务来源根据河南省技术监督局豫质监标发2017263号”河南省质量技术监督局关于印发2017年度河南省地方标准制修订计划的通知”及附件2017年第三批河南省地方标准计划项目汇总表立项编号：20173210449，由河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所（以下简称质标所）负责制定伏马毒素B1残留量快速测定 荧光偏振免疫分析法。质标所负责组织调研、试验并起草制定了标准，并由河南省农产品质量安全检测中心、农业部果品及苗木质量监督检验测试中心（郑州）、河南省疾病预防

2、控制中心、河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所（农业部农产品质量监督检验测试中心（郑州）等四家单位参加标准的实验室比对试验工作，验证了方法的重复性和再现性。1.2标准编制背景及目的意义（1）伏马毒素是一类天然真菌毒素，广泛存在于玉米及于玉米为主要原料的制品和饲料中，对人的健康构成潜在危害。伏马毒素是一类主要由串珠镰刀菌产生的真菌毒素。目前至少已鉴定出15种伏马毒素类似物,其中伏马毒素B1的毒性最强。研究证实, 伏马毒素可引起马脑白质软化症和猪肺水肿综合症。世界卫生组织国际肿瘤研究中心（IARC）于1993年评价了伏马毒素的毒性，并将其归类为可能的人类致癌物；国际食品法典委员会（CAC）

3、的JECFA的评价结果指出其具有肾脏毒性。由于分布广泛且毒性较大, 伏马毒素已成为继黄曲霉毒素之后国际上普遍关注的又一个真菌毒素。伏马毒素除主要存在于玉米及其制品中外，在大米、小麦、大麦、高粱、豌豆、芦笋、啤酒、牛奶和饲料等农产品及其加工品中也有一定浓度的存在。调查表明：世界各国的玉米及其制品，无论是人食用的食品还是动物用的饲料，普遍都受到伏马毒素B1的污染，其中玉米的污染率达60%以上。目前我国还未普遍地对玉米及其制品中伏马毒素的污染进行调查，从几例初步的调查结果看：我国玉米中伏马毒素的检出率平均也在60%以上，其中肝癌高发区的玉米伏马毒素的最高值及平均值均显著高于肝癌低发区。玉米产品中存在

4、的伏马毒素已成为相关农产品安全消费、国际贸易和现代农业产业发展的限制因素，对人的健康和畜牧业发展构成潜在危害。我省是玉米种植大省，同时也是畜牧大省，因此建立科学先进、准确可靠的伏马毒素B1检测方法标准，是控制我省农产品伏马毒素污染、保障农产品安全消费和人民身体健康的迫切需求。（2）荧光偏振免疫分析技术是集快速、便携、精确、灵敏于一体伏马毒素检测技术国内外伏马毒素的检测方法主要涉及薄层色谱法（TLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱法-质谱法等（HPLC-MS）等。TLC法是测定毒素的经典方法，是一种半定量检测方法，设备简单，检测成本低，但检测灵敏度低，并且对人员毒害非常大，安全性差

5、，无法满足现代快速检测的需求；ELLSA法是一种基于抗原、抗体特异性结合而建立的检测方法，由于其快速、灵敏、操作简便，且对样品的纯度要求不高，适合样品的初步筛查检测，但该方法由于酶本身的不稳定性，造成检测结果稳定性差，易出现假阴性、假阳性结果。高效液相色谱法-质谱法方法检测结果准确、可靠，但仪器设备价格昂贵，检测人员也需要经过专门培训。伏马毒素的荧光偏振免疫分析技术是一种新兴的用于定量分析小分子物质的免疫检测技术，结合了免疫分析的特异性和荧光的高灵敏性。相对于国内常用的薄层色谱、酶联免疫等检测方法，它不仅荧光偏振免疫分析技术是一种新兴的用于定量分析小分子物质的免疫检测技术，结合了免疫分析的特异

6、性和荧光的高灵敏性。相对于国内常用的薄层色谱、酶联免疫等检测方法，它不仅具有最高的检测灵敏度，而且检测过程只需将待测样品与标记的抗体混合，不需要反复的洗涤步骤，反应快速，操作简便。因此，“伏马毒素B1残留量的测定 荧光偏振免疫分析法”标准的制定，可为玉米产品提供可靠的、国际技术领域认可的实验数据；该标准的制定将有助于将先进、成熟的检测技术及时制定成方法标准，充分体现标准的先进性，避免因标准滞后而束缚质检机构的工作积极性；同时，也为质检机构及行政主管部门监督抽查时选择伏马毒素测定选择检测方法时，提供有更广泛的选择空间。该标准在我省为首次制定，不存在与现行国家标准、行业标准等之间包含、重复、交叉和

7、不一致的问题。1.3 前期所做主要工作(1)伏马毒素的荧光偏振分析法是质标所从美国农业部国家农业应用研究中心引进的方法。2011年4月，质标所邀请美国农业部国家农业应用研究中心的首席科学家Chris Maragos博士到我所访问，双方签订了合作协议及伏马毒素荧光偏振分析法中核心试剂的转让协议。在2012年5月-8月，刘继红受单位委派，赴位于美国伊利诺伊州皮奥利亚的美国农业部国家农业应用研究中心，在Chris Maragos博士的指导内，系统学习了伏马毒素的荧光偏振分析法，并引进了伏马毒素抗体和荧光标记物等核心试剂。(2)标准制定项目任务下达后，质标所组织成立了标准编制工作组，成员为：刘继红、王

8、红旗、刘冬梅、尹海燕、张玲、张军锋、李淑芳和张迪。负责标准的编制起草工作。（3）工作组对方法中的分析条件和步骤进行优化，和相关协作实验室进行了大量的方法研究、验证实验和数据统计。（4）在广泛的调查研究和试验验证的工作基础上，编写完成伏马毒素B1残留量的测定 荧光偏振免疫分析法标准文本和编制说明，现已形成征求意见稿。2 标准的编写原则在标准的制定过程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，标准的编写规则及表述按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则的要求、GB/T 5009.1-2003 食品卫生检验方法 理化部分 总则和GB/T 20001.4-2001标

9、准编写规则第4部分：化学分析方法的要求编写。在标准制定过程中力求做到：技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。3 标准的主要内容见标准文本。4 标准确定的理由和依据4.1荧光偏振免疫分析技术原理荧光偏振免疫分析技术是建立在偏振荧光的基础上，是1920年由Perrin建立的。其原理为：从光源发出的一束光线经垂直起偏器后成为垂直偏振光，样品被垂直偏振光激发而产生偏振荧光，此荧光经检偏器后可测出与样品浓度有关的水平或垂直方向的荧光偏振光强度。荧光偏振光强度（P）定义为：P=(I-I)/ (I+I)其中，I和I分别为荧光子被激发后，发射

10、光在垂直和水平方向上的强度。当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。由于荧光偏振光强度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比，所以小分子物质在溶液中旋转速度快，P值较小；大分子物质在溶液中旋转速度较慢，P 值较大。荧光偏振免疫分析技术就是依据这一性质，在小分子抗原标记上荧光基团，与其相应抗体结合后，所形成的大分子在溶液中旋转速度变慢，可增大荧光偏振光强度。依据荧光标记抗原和其抗原抗体结合物之间荧光偏振程度的差异，用竞争性方法可直接测量溶液中小分子的含量。美国农业部农业应用研究中心下属的国家农业应用研究中心科学家Maragos建立了玉米中伏马毒素均相荧光偏振免疫分析技术，检出限

11、为)0.5ng，线性范围在0.5-20mg/L，回收率93.7%。该法的测定结果与液相色谱方法的比较吻合（R=0.97），而测定过程相对简单、快速。我所于2012年5月派出人员到美国国家农业应用研究中心，引进伏马毒素荧光偏振免疫分析技术，包括抗体等核心试剂的引进、伏马毒素荧光标记物制备技术的引进以及玉米中伏马毒素荧光偏振免疫分析分析技术。4.2伏马毒素荧光标记物的制备技术采用6，-（4,6-二氯三嗪基）氨基荧光素（6-DTAF，结构式如图1所示）为荧光基团制备伏马毒素荧光标记物。图1 6-DTAF结构式称取10mg伏马毒素B1，加入0.1ml二甲基甲酰胺，再加入0.1ml 0.1M Na2CO

12、3溶液，混匀，称取1mg 6-DTAF，加入0.1ml二甲基甲酰胺，混匀。将6-DTAF溶液加入到伏马毒素溶液中，搅拌反应8小时。将反应液移入加有0.3g硅胶60（粒径20-43m，用二氯甲烷洗涤并干燥后使用）的小瓶中，用0.4ml甲醇洗涤反应瓶2-3次，洗涤液并入小瓶中，用冷冻干燥机干燥过夜。荧光标记物的纯化采用填充柱净化，柱填料为硅胶60（粒径40-63 m）。将约10g填料溶解于二氯甲烷中，搅拌赶除气泡后，将溶液倾倒入填充柱中，静置待填料沉淀。样品用10ml甲醇溶解，倾入柱中，分别用50ml二氯甲烷和50ml淋洗液（二氯甲烷、甲醇和乙酸按30:10:0.5的比例混合）洗涤，最后用60ml

13、洗脱液（二氯甲烷、甲醇和乙酸按30:30:1的比例混合）洗脱，收集洗脱液。40C水浴减压旋转蒸发近干，冷冻干燥机干燥过夜至荧光标记物为黄色粉状物。收集荧光标记物于瓶中，在-20C条件下保存。4.3伏马毒素荧光偏振免疫分析技术4.3.1样品前处理优化称取20g已粉碎的玉米样品，加入100ml 磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7. 2），振荡提取1h，过滤。引进的技术中采取的是滤纸过滤两次，第一次采用的是纸滤纸，第二次采用的是玻璃滤纸，以过滤出对光吸收等有影响的微小颗粒。经过试验验证，我们将第二次过滤更改为采用0.22 m的滤膜过滤，对微小颗粒的过滤效果更好，得到的滤液进行测定时，荧光偏振值更稳定。4

14、.3.2抗体溶液浓度优化为选择最佳抗体溶液浓度，将抗体储备溶液用0.1%的磷酸盐缓冲液稀释为1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:1000的溶液，分别用于测定伏马毒素标准曲线。试验结果表明，随着抗体溶液浓度降低，荧光偏振强度变化范围（伏马毒素浓度为0g/Kg和20000g/Kg时的荧光偏振强度的差值，mP）逐渐缩小。抗体溶液浓度为1:100时，荧光偏度强度变化范围为216.95，而抗体溶液浓度为1:1000时，荧光偏度强度变化范围降低到132.9。随着抗体溶液浓度降低，荧光偏振强度变化范围逐渐缩小。荧光偏振强度变化范围关系到测定结果的准确性，荧光偏振强度变化范围越大，

15、测定误差越小。而随着抗体溶液浓度降低，代表方法灵敏度的IC50值逐渐降低。抗体溶液浓度为1:100时，方法的灵敏度IC50为1647.0g/Kg，而抗体溶液浓度为1:1000时，方法的灵敏度IC50为258.1g/Kg。这表明，随着抗体溶液浓度降低，检测灵敏度则逐渐增加，综合考虑检测准确度和灵敏度，选择抗体溶液浓度为1:500，方法灵敏度为474.3g/Kg。表1 不同浓度抗体溶液荧光偏振强度范围与灵敏度抗体溶液浓度荧光偏振强度变化范围（mP）IC50（g/Kg）1:100216.951647.01:200208.31126.01:300205.1888.91:400182.7600.41:5

16、00167.35474.31:1000132.9258.14.3.3标准曲线称取一定量的伏马毒素标准品，用甲醇溶解制成1000mg/Kg的母液，再逐级稀释为10g/Kg、120g/Kg、100g/Kg、200g/Kg、500g/Kg、1000g/Kg、2000g/Kg、5000g/Kg、20000g /Kg的标准溶液。在试管中依次分别加入900l磷酸盐缓冲溶液、加入100l不同浓度伏马毒素标准溶液、100l抗体溶液，在涡旋混合器上混匀，用荧光偏振读数仪测定，作为溶液空白，取出试管，加入100l荧光标记的伏马毒素溶液，在涡旋混合器上混匀，反应1min，用荧光偏振读数仪测定，读取荧光偏振强度。以伏

17、马毒素浓度（g/Kg）荧光偏振强度（mP）作标准曲线，如图2所示，回归方程为y =LgstcDoseRsp（a，b，c，d），其中a=63.304879，b=197.19669，c=735.97987，d=1.4829537，相关系数R20.9978。图2 伏马毒素荧光偏振分析标准曲线4.3.4回收率、精密度在玉米空白对照样品中添加不同浓度的伏马毒素标准溶液，摇匀，放置过夜，测定伏马毒素含量，测得添加回收率见表2。当添加水平均为1.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg时，测得平均回收率为93.4%105.1%，相对标准偏差为4.4%9.6%。实验结果表明，回收率和精密度可达到真菌毒素残

18、留分析要求。表2 伏马毒素回收率和精密度添加浓度mg/kg回收率（%）RSD（%）12345平均值1.097.0100.084.9103.087.094.48.02.599.0102.0108.0107.0109.5105.14.45.0102.092.0107.4104.695.2100.246.54.3.5 重复性和再现性按照 GB/T 6379.2-2004 测量方法与结果的准确度 第2部分 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法，进行实验室间方法的重复性和再现性评价。参与复核的实验室为河南省农产品质量安全检测中心、农业部果品及苗木质量监督检验测试中心（郑州）、河南省疾病预防控制中心3

19、家。结果表明，添加浓度为1.0mg/kg，四家检测结果的平均值为0.828 mg/kg，平均回收率为82.8%，精密度（RSD）为12.1%；添加浓度为2.5mg/kg，平均值为2.433mg/kg，平均回收率为97.3%，RSD为13.9%；添加浓度为5.0mg/kg，平均值为4.482 mg/kg，平均回收率为89.6%，RSD为12.4%，满足真菌毒素分析要求。对四家检测结果的重复性和再现性进行统计检验，以伏马毒素添加浓度为 1.0 mg / kg时回收率为例的计算过程见表3和表4，统计结果见表5和表6，其中r 是置信概率为 95%时该方法的重复性；R 是置信概率为 95%时该方法的再现

20、性。表3 实验室间方法的重复性和再现性评价统计结果（以伏马毒素添加浓度为1.0 mg / kg时为例）实验室编号实验室名称平均值Yi重复ni方差Si21河南省农产品质量安全检测中心0.83050.00442农业部果品及苗木质量监督检验测试中心（郑州）0.72750.00043河南省疾病预防控制中心0.809 50.00664河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所0.94450.0064检验单元方差柯克伦检验值(C)0.371柯克伦检验临界值0.721 (1 %)0.629 (5 %)判定正常值检验单元平均值格拉布斯检验值(G)1.126格拉布斯临界值1.496 (1 %)1.481(5

21、%)判定正常值狄克逊检验值(D)0.525狄克逊临界值0.821 (1 %)0.710 (5 %)判定正常值比对试验的统计结果参加的实验室数目，p4可接受的数目4平均值, m=T1/T30.828Sr2= 重复性标准偏差0.0022SL2=0.0076SR2= Sr2+ SL20.0098重复性，r=2.80.132再现性，R=2.80.277表 4 重复性和再现性统计基本数据（以伏马毒素添加浓度为1.0 mg / kg时为例）T1=niYi16.551T2=niYi213.817T3=ni20T4=ni2100T5=(ni-1)Si20.0356 表 5 离群值检验汇总统计表样品种类添加浓度

22、1.0mg / kg2.5 mg / kg5.0 mg / kgCGDCGDCGD玉米0.3711.1260.5250.6891.2160.2020.4131.1870.397注：C：代表柯克伦检验统计量；G：代表格拉布斯检验统计量；D：代表狄克逊检验统计量。柯克伦检验临界值： 0.721 (1 %)和 0.629 (5 %)格拉布斯临界值：1.496 (1 %)和1.481 (5 %)狄克逊临界值：0.821 (1 %)和0.710 (5 %)表6 实验室间方法的重复性和再现性评价汇总统计结果样品种类添加浓度1.0mg / kg2.5 mg / kg5.0mg / kgrRrRrR玉米0.1

23、320.2770.3071.0030.8561.450注：r 为重复性限，R为再现性限。5 对方法标准伏马毒素B1残留量的测定 荧光偏振免疫分析法的基本评价引进的伏马毒素荧光偏振免疫分析技术经过消化吸收，建立了玉米中伏马毒素荧光偏振免疫分析方法。采用荧光偏振免疫分析法测定玉米中伏马毒素，样品前处理只需提取、过滤，测定时只需2-3min即可测定每一个样品，方法步骤简单、测定迅速。可将抗体稀释500倍使用，所需试剂少。方法灵敏度为0.4mg/Kg，添加浓度为0.5、1.0、2.5 mg/kg，平均回收率为93.4%105.1%，相对标准偏差为4.4%9.6%，回收率和精密度可达到真菌毒素残留分析要

24、求。因此，本方法简便，快速，易于操作，使本标准具有较强的适用性。6 与有关的现行法律、法规和强制性标准的关系在标准的制订过程中严格贯彻国家有关方针、政策、法律和规章等，严格执行强制性国家标准和行业标准。与相关的各种基础标准相衔接，遵循了政策性和协调同一性的原则。本标准的顺利实施，有助于检测玉米中伏马毒素残留。7 作为强制性标准或推荐性标准的建议 本标准为化学分析方法标准，不涉及有关国家安全、保护人体健康和人身财产安全、环境质量要求等有关强制性地方标准或强制性条文等的八项要求之一，因此建议将其作为推荐性标准颁布实施。8 贯彻标准的要求和措施建议建议举办质量监督、检验、科研和生产等相关人员参加的标

25、准宣贯培训班，推广本标准的实施。通过实施本标准，监测玉米中伏马毒素残留，可以保护人体健康和人身安全。9 其他应予说明的事项无。10 主要参考文献1 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写2 GB/T 20001.4-2001标准编写规则 第4部份 化学分析方法3 GB/T 5009.1-2003食品卫生检验方法 理化部份总则4 GB/T 6379.2-2004测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法5 GB/T 6379.4-2006测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） 第4部分 确定标准测量方法正确度的基本

26、方法6 GB/T 27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测7 GB/T 6379.2-2004测量方法与结果的准确度 第2部分 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法8 Chris Maragos, Mark Busman. Rapid and advanced tools for mycotoxin analysis: a review. Food Additives and Contaminants, 2010, 27(5): 6887009 Chris M. Maragos, Michael E. Jolley, Ronald D. Plattner, and Mohamm

27、ad S. Nasir. Fluorescence Polarization as a Means for Determination of Fumonisins in Maize. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 596-602河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所2017年12月 附件：验证单位回收率和精密度数据附表1 河南省农产品质量安全检测中心伏马毒素回收率和精密度添加浓度mg/kg测定值（mg/kg）回收率（%）精密度（%）123451.00.7550.8600.7740.9170.84583.06.62.52.151.981.962.001.98

28、80.53.15.03.593.633.674.774.1479.210.1附表2农业部果品及苗木质量监督检验测试中心（郑州）伏马毒素回收率和精密度添加浓度mg/kg测定值（mg/kg）回收率（%）精密度（%）123451.00.7590.7200.7330.7150.70772.72.02.52.782.962.702.802.69111.54.45.04.734.004.184.524.3887.25.7附表3河南省疾病预防控制中心伏马毒素回收率和精密度添加浓度mg/kg测定值（mg/kg）回收率（%）精密度（%）123451.00.8980.7350.8050.8850.72480.98.12.52.482.362.591.972.1192.110.35.05.274.454.135.084.0491.911.1