化妆品用叔丁基羟基苯甲醚中苯甲醇检测方法.docx

1、化妆品用叔丁基羟基苯甲醚中苯甲醇检测方法附件5：化妆品用叔丁基羟基苯甲醚中苯、甲醇的检测方法（征求意见稿）1 适用范围本方法规定了测定化妆品用叔丁基羟基苯甲醚中苯(CAS：71-43-2)、甲醇(CAS：67-56-1)的气相色谱法。本方法适用于化妆品用叔丁基羟基苯甲醚中苯和甲醇的测定。2 方法提要样品在顶空瓶中经过加热提取后，用具有氢火焰离子化检测器的气相色谱仪测定其中的苯和甲醇，以保留时间定性，标准加入单点法计算含量。本方法对苯的检出限为2.5g，定量下限为7.5g；对甲醇的检出限为10g，定量下限为30g。若取5.0g样品测定，本方法对苯的检出浓度为0.00005，最低定量浓度为0.00

2、015；本方法甲醇检出浓度为0.0002，最低定量浓度为0.0006。3 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为一级实验用水。3.1 N,N-二甲基甲酰胺。3.2 苯，色谱纯。3.3 甲醇，色谱纯。3.4 混合标准储备溶液（苯）=500g /mL，（甲醇）=2000g /mL：分别准确称取苯（3.2）0.05g、甲醇（3.3）0.2g（精确至0.1mg），置于100mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺（3.1）定容至刻度，摇匀，配成苯和甲醇的质量浓度分别为500g /mL、2000g /mL的标准储备溶液。3.5 系列浓度标准工作溶液：用N,N-二甲基甲酰胺（3.1）将上述（3.4）

3、混合标准储备溶液分别配成苯浓度为0g /mL、1.5g /mL、5g /mL、10g /mL、25g /mL、50g /mL、100g /mL，甲醇浓度为0g /mL、6g /mL、20g /mL、40g /mL、100g /mL、200g /mL和400g /mL的系列浓度标准工作溶液。4 仪器4.1 气相色谱仪，配氢火焰离子化检测器。4.2 顶空进样器。4.3 顶空瓶：20mL。4.4 分析天平：感量0.0001g。5 分析步骤5.1 样品处理准确称取样品5.0g（精确至1mg），置于顶空瓶中，分别准确加入系列浓度标准工作溶液（3.5）5mL，密封后摇匀，作为加系列标准工作溶液的样品。置于

4、顶空进样器中，待测。5.2 顶空进样器条件汽化室温度：70；定量管温度：90；传输线温度：100；汽液平衡时间：15min。5.3 色谱参考条件色谱柱：DB-624石英毛细管柱（30m0.32mm1.8m），或相当者；柱温程序：初始温度60，保持4min，再以40/min的速率升温至100，保持2min，再以40/min的速率升温至200，保持2min；进样口温度：220； 检测器温度：230；氮气流速：1.5mL/min； 氢气流量：40mL/min； 空气流量：400mL/min；尾吹气氮气流量：30mL/min；进样方式：分流进样，分流比5:1；进样量：1.0mL。注：载气、空气、氢气流

5、速随仪器而异，操作者可根据仪器及色谱柱等差异，通过试验选择最佳操作条件，使苯、甲醇与叔丁基羟基苯甲醚中其他组分峰获得完全分离。5.4 定量测定用加系列浓度标准工作溶液的样品（5.1）分别进样，以峰面积为纵坐标，标准加入量为横坐标进行线性回归，建立标准曲线，其线性相关系数应0.99。按“6 计算”，计算样品中的苯、甲醇含量。5.5 平行试验按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。6结果计算6.1 确定标准加入单点法中用于计算的标准参考量选择加标为0 g/mL的样品作为样品取样量（m），根据样品（m）的峰面积（Ai），选择加入目标物标准品后

6、目标物的峰面积（As）与2 Ai相当的加标样品（mi）作为计算用标准（ms），应用标准加入单点法对样品进行计算。6.2 计算公式 式中：w（目标物） 样品中目标物的含量，%；ms 加入目标物标准品的量，g；Ai 样品中目标物的峰面积；As 加入目标物标准品后样品中目标物的峰面积；m 样品取样量，g；mi 加入目标物标准品的样品取样量，g。7 回收率和精密度多家实验室验证，苯的方法回收率在95.2%113.6%之间，相对标准偏差在1.0%3.4%之间；甲醇的方法回收率在87.5%107.3%之间，相对标准偏差在1.2%3.4%之间。8 色谱图图1 苯与甲醇的气相色谱图甲醇（2.984min） 苯

7、（6.730）化妆品用叔丁基羟基苯甲醚中苯、甲醇检测方法起草说明为加强化妆品原料的监督管理，国家食品药品监督管理局于2010年7月委托广东省食品药品监督管理局开展化妆品用叔丁基羟基苯甲醚（简称BHA）中苯、甲醇检测方法的起草工作，广东省食品药品监督管理局委托广东省药品检验所开展该项工作，现就起草工作有关情况说明如下： 一、 起草的必要性BHA是应用广泛的化妆品原料，常用作抗氧化剂，其生产工艺主要有对羟基苯甲醚催化法和叔丁基对苯二酚催化法。（一）BHA合成方法简述及甲醇、苯有机溶剂残留原因BHA的合成主要有两种方法，一是以对苯二酚为原料，甲醇（或硫酸二甲酯）为甲基化试剂，苯、甲苯或环己烷等作为萃

8、取溶剂，制备得到中间体对羟基苯甲醚；对羟基苯甲醚在酸性催化剂作用下与异丁烯或叔丁醇反应得BHA；另一种是以叔丁基对苯二酚为原料，在催化剂作用下与硫酸二甲酯（或其他甲基化试剂）反应得BHA。由于对羟基苯甲醚易得，其制备也较简单，因此，目前的生产BHA以第一种方法为主。 图3. 方法一合成BHA路线图由上述合成工艺可知，甲醇、苯等有机溶剂是合成BHA常见的残留溶剂。（二）化妆品中残留溶剂控制的必要性在药品行业，人用药品注册技术要求国际协调会( ICH )及欧盟、美国和我国药典都对药品中的残留溶剂做出限制： ICH于1997年7月17日通过了控制药品中残留溶剂的指导原则（ICH 原则），将药品生产及

9、纯化过程中常用的69种有机溶剂按照对人体和环境的危害程度分为4类。第一类溶剂是指已知可以致癌并被强烈怀疑对人和环境有害的溶剂, 其残留量必须控制在规定的范围内；第二类溶剂是指无基因毒性但有动物致癌性的溶剂；第三类溶剂是指对人体低毒的溶剂，在无需论证的情况下，残留溶剂的量不高于0.5% 是可接受的, 但高于此值则须证明其合理性；第四类是尚无足够毒理学资料的溶剂。目前，各国药典对于残留溶剂的控制总类和残留量都已经与ICH 的要求一致。ICH 原则中，苯作为第一类溶剂，在药品中的限度为0.0002；甲醇作为第二类溶剂，在药品中的限度为0.3。化妆品卫生规范（2007年版）规定，苯、甲醇均属于化妆品中

10、禁用组分，不得作为化妆品原料使用。甲醇在化妆品中的限量值为2000mg/kg，苯暂无限量规定。目前，化妆品行业尚未对化妆品原料中残留溶剂含量做出相关要求，但化妆品卫生质量安全越来越受到广泛的重视。国家食品药品监督管理局于2010年8月23日发布了关于印发化妆品中可能存在的安全性风险物质风险评估指南的通知（国食药监许2010339号），通知中明确要求化妆品申报时，生产企业必须提交相关产品的风险评估资料（包括可能存在安全风险物质的来源、含量及检测方法及国内外有关限量水平等）。对化妆品原料的安全风险控制、可能存在残留溶剂的检测和风险评估等，将逐步成为该行业的发展趋势。二、起草的依据及文献（一）化妆品

11、卫生规范2007版（二）化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范（国食药监许2010455号）（三）中国药典2010版（四）GB/T683-2006 化学试剂 甲醇（五）GBT5009.48-2003 蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法（六）GB 7917.1-87 化妆品卫生化学标准检验方法（七）魏京京,张启明,朱维华.毛细管气相色谱直接进样检测34种残留溶剂J.药物分析杂志,2008,28(10):1767-1770（八）陈志峰,孙利,储晓刚等.顶空气相色谱质谱法测定软饮料中的微量苯J.中国卫生检验杂志,2006,9,16(9):1033-1035（九）胡昌勤,刘颖.中国药典2005年

12、版（二部）残留溶剂检查法介绍J.中国药品标准,2005,6(3):52-55（十）白瑞,孙银华.浅谈GC在药品残留溶剂中的应用J.中国实用医药,2009,11,4(33):230-232三、起草原则本检测方法兼具先进性、准确性以及可操作性强的特点，采用目前一般检测实验室普遍具备的分析技术，选择适宜、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的精确性和重现性。四、起草过程2010年7月以来广东省药品检验所开展化妆品用叔丁基羟基苯甲醚原料中苯、甲醇检测方法建立和验证工作，我们通过查阅国内外相关文献资料等调研工作后，开始了实验研究，2011年3月初初步完成了方法的建立工作并咨询了化妆品行业专家，并根

13、据专家意见对实验方案进行了修改和完善。2011年7月初，我们委托三家单位对方法进行验证。三家验证单位按照协议书要求，于7月底陆续将验证材料报送我单位，我们将三家实验室方法验证材料进行整理、总结和分析，对方法进行完善。2011年11月30日，我所组织召开了方法的专家研讨会，包括来自广东省疾控中心、广州市质检院等化妆品检验机构的共5位专家，对方法进行了全面的梳理及讨论。会后，我们根据专家意见，对方法进行了进一步的完善后，形成此稿报送国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司（以下称保化司）。2012年1月9日，保化司组织召开专家论证会，认为该方法基本满足现阶段化妆品中上述物质的检测要求，并提出了相

14、关修改意见。根据专家论证会意见，项目承担单位对检测方法进行了修改完善，并经2012年2月29日保化司司务会讨论通过后形成此征求意见稿。五、重点说明的问题（一）关于体例。本检测方法的体例主要参照现行2007版化妆品卫生规范的卫生化学检验方法的体例，便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。（二）关于叔丁基羟基苯甲醚（BHA）中苯、甲醇残留。BHA（Butylated hydroxyanisole），白色至微黄色结晶或蜡状固体，略有特殊气味，长期贮存则带黄棕色，热稳定性良好，在弱碱条件下也不容易被破坏。分子式为C11H16O2，分子量180.24，熔点5860，沸点264270。不溶于水，易

15、溶于乙醇、甘油和丙二醇等有机溶剂。常见市售BHA主成分为3-叔丁基-4-羟基苯甲醚（3-BHA，CAS号：25013-16-5），部分含同分异构体2-叔丁基-4-羟基苯甲醚（2-BHA，CAS号：88-32-4）。以对苯二酚为原料，甲醇（或硫酸二甲酯）为甲基化试剂，苯、甲苯或环己烷等作为萃取溶剂，是当前BHA常用的合成工作，甲醇、苯等有机溶剂是BHA合成过程中常见的有毒有害溶剂残留。（三）关于检测方法的建立和验证。经过对化妆品用BHA前处理方法的选择，分析条件的优化，最终建立了化妆品用BHA中苯、甲醇的的气相色谱检测方法。本方法验证表明，苯在7.5500.0 g、甲醇在302000.0 g浓度

16、范围内呈线性（相关系数0.999），苯的检出浓度为0.00005，最低定量浓度为0.00015；本方法甲醇检出浓度为0.0002，最低定量浓度为0.0006，相对标准差小于5%（n=6）。上述结果证实，本方法可以满足化妆品用BHA中苯、甲醇的检测要求。图1 化妆品用BHA中加入苯、甲醇的气相色谱图（四）关于定量方法的说明。对于化妆品的检测，目前国内大多使用标准曲线法进行定量计算。标准曲线法操作简便，适用于日常检验，特别是样品数量较多的批量检验，所以应用范围较广。而在气相色谱中，采用顶空进样时，由于样品基质对溶液的汽液平衡造成一定的影响；同时，有机溶液残留一般是微量检测，标准曲线对低浓度样品的影

17、响较大，样品含量测定结果与真实值容易出现偏离，故仍优先考虑标准加入单点法用于定量计算。化妆品用叔丁基羟基苯甲醚中苯、甲醇检测方法编制说明一、 基本信息1简介叔丁基羟基苯甲醚是应用广泛的化妆品原料，常用作抗氧化剂，其生产工艺主要有对羟基苯甲醚催化法和叔丁基对苯二酚催化法。生产过程中，部分有毒有害残留溶剂未能完全去除，可能会对人体或环境产生危害。根据生产工艺及危害识别，选定甲醇、苯作为化妆品用叔丁基羟基苯甲醚中残留溶剂的典型代表及控制指标。2 属性信息2.1叔丁基羟基苯甲醚2.1.1 中文名：叔丁基羟基苯甲醚2.1.2 英文名称：Butylated hydroxyanisole2.1.3 INCI

18、名称：BHA2.1.4 分子式：C11H16O22.1.5 分子量：180.242.1.6 CAS号：25013-16-5/88-32-42.1.7 结构式：或 3BHA 2BHA2.1.8 理化特性白色至微黄色结晶或蜡状固体，略有特殊气味，长期贮存则带黄棕色，热稳定性良好，在弱碱条件下也不容易被破坏。分子式为C11H16O2，分子量180.24，熔点5860，沸点264270。不溶于水，易溶于乙醇、甘油和丙二醇等有机溶剂。2.2苯2.2.1 中文名：苯2.2.2 英文名称：Benzene2.2.3 分子式：C6H62.2.4 分子量：78.112.2.5 CAS号：71-43-22.2.6

19、结构式： 2.2.7 理化特性在常温下为无色、有甜味的透明液体，并具有强烈的芳香气味。苯可燃，有毒，为IARC第一类致癌物。苯难溶于水，易溶于有机溶剂。摩尔质量 78.11 g mol-1，密度 0.8786 g/mL，相对蒸气密度(空气=1)：2.77，蒸汽压（26.1）：13.33kPa，临界压力：4.92MPa，熔点 278.65 K (5.51 )，沸点 353.25 K (80.1 )，在水中的溶解度 0.18 g/ 100 ml 水，标准摩尔熵So298 173.26 J/molK，标准摩尔热容 Cpo 135.69 J/molK (298.15 K)，闪点 -10.11（闭杯），

20、自燃温度 562.22，结构 平面六边形，最小点火能：0.20mJ，爆炸上限（体积分数）：8%，爆炸下限（体积分数）：1.2%，燃烧热：3264.4kJ/mol。2.3甲醇2.3.1 中文名：甲醇2.3.2 英文名称：Methanol2.3.3 分子式：CH3OH2.3.4 分子量：32.042.3.5 CAS号：67-56-12.3.6 结构式： 2.3.7 理化特性一种无色、透明、易燃、易挥发的有毒液体，常温下对金属无腐蚀性（铅、铝除外），略有酒精气味。分子量32.04，相对密度0.792(20/4)，熔点-97.8，沸点64.5，燃烧热725.76KJ/mol，闪点12.22，自燃点46

21、3.89，蒸气密度1.11，蒸气压13.33KPa(100mmHg 21.2)，蒸气与空气混合物爆炸极限636.5 %（体积比），能与水、乙醇、乙醚、苯、酮、卤代烃和许多其他有机溶剂相混溶，但是不与石油醚混溶，遇热、明火或氧化剂易燃烧。二、 方法选择与优化1样品、分析方法及其条件的选择与优化1.1样品的选择分别选取市售具有代表性的厂家生产的9种BHA作为研究对象，样品涵盖国内、美国、欧洲及东南亚国家品牌，包括小包装食品级试剂到桶装工业用原料，具体品种如下：表1 样品信息表 1.2分析方法的选择1.2.1溶剂的选取参考国内相关检测标准，选用气相色谱法测定化妆品用叔丁基羟基苯甲醚中甲醇、苯等残留溶

22、剂。叔丁基羟基苯甲醚为白色至微黄色结晶或蜡状固体，不溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂。在实际考察中发现，叔丁基羟基苯甲醚在乙醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜溶液中均能很好地溶解。GB 7917.1-87 化妆品卫生化学标准检验方法及化妆品卫生规范2007年版中均采用无甲醇乙醇作为气相色谱法测定甲醇含量的溶剂。中国药典(2010年版)残留溶剂测定法则建议采用NN二甲基甲酰胺、二甲基亚砜作为残留溶剂测定的溶剂。考虑到“无甲醇乙醇”在实验中较难把握，且乙醇与甲醇同易挥发溶剂，一是使顶空瓶压力较大，二是实验中甲醇与乙醇峰较难分离。再分别考察了在乙醇、二甲基甲酰胺体系的灵敏度后，发现用二甲基甲酰胺作为溶剂，灵敏

23、度优于乙醇，考虑到本课题做的是溶剂残留，所以选用二甲基甲酰胺作为溶剂。1.2.2进样方式的考虑实验分别考察了直接进样和顶空进样两种进样方式对实验结果的影响。直接进样：操作简单、直接；但原料会对色谱柱和进样口造成污染，且基质干扰严重，做挥发性有机溶剂稳定性、精密度欠佳。顶空进样：基质干扰少、挥发性组分不会丢失，重现性好，是目前分析残留溶剂最常用的进样方法。最终本实验选用顶空进样方式。 1.3 实验条件的优化1.3.1顶空条件的确定1.3.1.1 平衡温度的选取分别考察了50、60、70平衡温度下的实验结果，70时，灵敏度高于50、60，且灵敏度可达要求、基线良好，选用70作为顶空平衡温度。1.3

24、.1.2 平衡时间的确定分别考察平衡时间为10min、15min、20min实验条件下的结果，15min、20min条件下峰面积相差不大，可知15min时已达气液平衡，顶空平衡时间设为15min。1.4 色谱柱选择DB-624毛细管色谱柱是挥发性有机溶剂残留的通用柱，使用了DB-624（30m0.32mm1.8m）和DB-624（30m0.53mm5m）两种规格的石英毛细管柱，时间和峰型等DB-624（30m0.32mm1.8m）毛细管柱更为合适，选择了该柱为分析柱。三家验证单位采用的色谱柱分别为DB-624石英毛细管柱（30m0.25mm1.4m）、DB-624（30m0.32mm1.8m）

25、和HJAT PEG20M ( 30m0.25mm0.25m )，均能满足检验要求。2气相色谱条件的确定2.1 顶空进样条件汽化室温度：70；定量管温度：90；传输线温度：100；汽液平衡时间：15min。2.2 色谱参考条件色谱柱：DB-624石英毛细管柱（30m0.32mm1.8m），或相当者；柱温程序：初始温度60，保持4min，再以40/min的速率升温至100，保持2min，再以40/min的速率升温至200，保持2min；进样口温度：220； 检测器温度：230；氮气流速：1.5mL/min； 氢气流量：40mL/min； 空气流量：400mL/min；尾吹气氮气流量：30mL/mi

26、n；进样方式：分流进样，分流比:5:1；进样量：1.0mL。图1.典型色谱图（甲醇200g/mL,苯50g/mL）2.3 系统适用性由图1可见，甲醇与苯峰分离度达61.922，拖尾因子甲醇1.27，苯为1.039，均小于1.5，理论塔板数甲醇为60934，苯为122931，可满足气相色谱分离要求。3 定量方法的选择关于定量方法的说明。对于化妆品的检测，目前国内大多使用标准曲线法进行定量计算。标准曲线法操作简便，适用于日常检验，特别是样品数量较多的批量检验，应用范围较广，但并不适用于此。在气相色谱中，采用顶空进样时，采用的是气液平衡原理，不同的基质对溶液的气液平衡常数有一定的影响，这也是提取回收

27、率超出85%115%的原因（甲醇的提取回收率大于200%）；同时，有机溶液残留一般是微量检测，标准曲线对低浓度样品的影响较大，样品含量测定结果与真实值容易出现偏离，故仍优先考虑标准加入单点法用于定量计算。检出甲醇的6个样品，标准曲线法与单点加入法计算结果比较，与提取回收率的相符：单点加入法（%）标准曲线法（%）Y20.00120.0033Y30.00110.0030Y40.00090.0026Y50.00070.0016Y70.00100.0024Y80.00050.0011三、 验证根据关于印发化妆品中禁用物质和限用物质检测方法验证技术规范的通知（国食药监许2010455号）（以下简称规范）

28、，对建立方法进行验证。1 实验室内部检测方法验证1.1 方法特异性将苯、甲醇标准溶液加入到空白样品中，按前处理方法处理空白样品和加标基质后，观测所得色谱图，发现实验中9种BHA的成分均没有对苯、甲醇的峰形造成干扰。 图2 典型空白样品色谱图图3 空白样品加标色谱图1.2 线性及线性范围1.2.1溶液标准曲线的配制将苯配制成0.5 g/L的标准储备液，再稀释成0.75g/mL、2.5 g/mL、5.0 g/mL、12.5 g/mL、25.0g/mL和50.0 g/mL的系列标准溶液；将甲醇配制成2.0 g/L的标准储备液，再稀释成3.0 g/mL、10.0 g/mL、20.0 g/mL、50.0

29、 g/mL、100.0g/mL和200.0 g/mL的系列标准溶液。精密移取10mL系列标准溶液置于顶空瓶中，按上述色谱条件测定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的浓度制作标准曲线。1.2.2 方法标准曲线的配制将苯配制成0.5 g/L的标准储备液，甲醇配制成2.0 g/L的标准储备液，再分别加入空白BHA中，空白样品每份为5.0g，加入相应的标液量，经过前处理后，得苯浓度为1.5 g/mL、5.0 g/mL、10.0 g/mL、25.0 g/mL、50.0g/mL和100.0 g/mL ，甲醇浓度为6.0 g/mL、20.0 g/mL、40.0 g/mL、100.0 g/mL、200.0g/mL

30、和400.0 g/mL的系列标准溶液。称取空白样品5.0g，精密加入5mL系列标准溶液，按上述色谱条件测定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的量制作标准曲线。1.2.3标准曲线和线性范围表2 线性范围表曲线类型线性范围线性方程相关系数（r）苯溶液标准曲线7.5g 500gy = 195.62x - 542.280.9998方法标准曲线7.5g 500g y = 289.09x - 1499.60.9998甲醇溶液标准曲线30g 2000gy = 43.377x - 435.570.9996方法标准曲线30g 2000gy = 114.34x - 2551.90.99961.3 检出限和定量下限稀释并检测苯、甲醇标准溶液及方法标准溶液，测定峰高信噪比为3:1时为检出限，峰高信噪比为10:1时为定量限，测得对苯的检出限为2.5g，定量下限为7.5g；对甲醇的检出限为10g，定量下限为30g。若取5.0g样品测定，本方法对苯的检出浓度为0.00005，最低定量浓度为0.00015；本方法甲醇检出浓度为0.0002，最低定量浓度为0.0006。1.4 精密度1.4.1 日内精密度在本方法条件下，高低两个浓度的标准溶液和基质溶液，分别连续测定各六次的精密度RSD5，满足规范要求。详见表3。1.4.2 日间精密度在本方法条件下，高低两个浓度的标准溶液和基质溶液，