细菌内毒素操作规程.docx

1、细菌内毒素操作规程细菌内毒素检查标准操作规程1简述本标准适用于中国药典 2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后 者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。供试品细菌毒素限值确实定。一 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；二 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以 EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量， 以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h ;放射性药品

2、注射剂， ;鞘内用注射剂，。M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以 ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和?临床用药须知?等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特 殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。供试品最大有效稀释倍数确实定供试品的最大有效稀释倍数 MV D 按下式计算：MV D=C?L/ 入L为供试品的细菌内毒素限值； C为供试品溶液的浓度。当 L以EU/ml表示时，C等于;当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，

3、单位 为 mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，那么 MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C:入/L入在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度， 在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种， 可直接进行内毒素检查， 如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。细菌内毒素检查过程中的阴性对照、 阳性对照和供试品对照必须同时进行， 否那么实验结果无效。2实验材料及用具天平 供试品称量用，精

4、度为 以下。电热枯燥箱 除外源性内毒素用，温度应能到达 250 C。恒温水浴箱或适宜的恒温器37 C C。水银温度计或酒精度计，精度在 1C以下。旋涡混合器。鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品， 除另有规定外，应使用由中国药典生物制品检定所统一发放的标准品。凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于 的灭菌注射用水。光度测定用的检查用水，其内毒素的含量应小于 。实验用具 移液管或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头、凝集管lOmnX 75mm 、 三角瓶、试管试管架、洗耳球、时钟、 75%酒精棉、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250 C干烤至少1小时。假

5、设使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等， 应选用标明无内毒素并且对实验无干扰的器械。细菌内毒素光度测定仪器3实验准备玻璃器皿的洗涤 竟玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水竟残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上 ，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。除去玻璃器皿外表可能存在的外源性内毒素 玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至 250 C,待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少 1小时。到达规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。 在不翻开包装的情况下， 可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡

6、箔纸包装，在不翻开包装的情况下可在两周内使用，否那么再次干烤除去可能存在的 外源性内毒素。4凝胶法操作方法鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否正确， 也是考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改 变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。实验操作细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支， 轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，参加规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，

7、 用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合 15分钟。然后进行稀释，制备成 4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即入入入入为所复核的鲎试剂的标示灵敏度，每稀释一步均应在旋涡混 合器上混合30秒钟详细过程参见标准品使用说明书 。假设使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分 装、保存。假设为细菌内毒素工作品，为一次性使用。待复核鲎试剂的准备取支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕， 75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支参加 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，防止产生气泡。假设待复核鲎试剂的规格不是 支时，取假设干支

8、按其标示量参加检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mnX 75mm凝集管中，要求至少分装 18管备用。4.1.1.3力口样将已充分溶解的待复核鲎试剂 18支管放在试管架上，排成 5列，其中4列4支管，1列2支管。4支管4列每列每支分别参加 的2入、入入和入的内 毒素标准溶液；另 2支管参加检查用水。加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，防止产生气泡，连同试管架 放入37 C 1 C水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温 60 2分钟。观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出， 防止振动，将每管拿出缓缓倒转180观察，管内形成凝胶，并且凝胶

9、不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为+ ;未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为- 。实验结果计算如最大浓度入4管均为阳性，最低浓度 入4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反响终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果入C。入 C=lg 1刀 X/4式中X为反响终点浓度的对数值 1g。反响终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。结果判断当入C在几2入包括入和2入时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格， 可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以 入标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。举例设待复核鲎试剂的灵敏度为。实验结果如下：内毒素浓度(EU/m

10、l )0.0625 0.031 Nc 反响终点浓度X重1复2管3数4+ 一 +一一 一 + 一+ 一入 C=lg 1(刀 X/4)=lg-1 lgO.125 + lg0.25 + lg0.0625 + lg0.0625 /4=0.105 EU/ml 入在入2入范围内，符合规定。并且使用该批鲎试剂时，其灵敏度为标示灵敏度 EU/ml 。干扰实验操作方法干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反响不存在 干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有 变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。由于干扰实验检验的

11、是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反响是否正常， 与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰实验预实验中原那么上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但 建议使用较低灵敏度如 或的鲎试剂，可尽量防止供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。干扰实验预实验预实验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度当限值以 EU/mg或EU/U活性单位表示或最小不干扰稀释倍数当限值以 EU/ml表示，为正式干扰实验提供依据。将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MV D=CL/入0.03 为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度 。使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做 2支供试品管

12、和2支供试品阳性对照即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成 2入浓度。另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照， 2支参加2入浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。供试品阳性对照制备举例：制备稀释倍数为 4的供试品阳性对照液方法，取 浓度为4入EU/ml的内毒素标准液+ 的稀释倍数为2的供试品稀释液 制得含2入EU/ml内毒素标准的稀释倍数为 4的供试品稀释液。保温60 2分钟后，观察并记录结果。当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照 2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍

13、数进行正式干扰实验。当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性， 或供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反响存在干扰，那么应对供试品进行更大倍数稀释不得超过 MVD=CL/入,或通过气压适宜的方法如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。当供试品的内毒素限值单位为 EU/mg或EU/U活性单位时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度即该稀释倍数下溶液的浓度 ，以mg/ml或活性单位/ml表示。4.2.2.4举例例：设某注射液限值为 ，按MV D=CL/入计算出灵敏度为 下的MV D为80倍，将供试品溶液稀释一系列检验，用灵敏度为 的鲎试剂进行预实验。结果如下稀释倍数原液51

14、0204080供试品溶液 供试品阳性对照 + + + + + +如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为 20倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。正式干扰实验目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反响有无干扰作用。 使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成 4个浓度的标准溶液即 入入0.5 入 0.25 入方法同 4.1.1.1 。制备含内毒素的供试品溶液将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数， 再用此稀释液将中的同支细菌内毒素标准品稀释成 4个浓度即入入入入的

15、含内毒素的供试品溶液。以注射用头孢哌酮钠1g/瓶为例：取10ml检查用水溶解注射用头孢哌酮钠即为 100mg/ml ,设需将其稀释20倍5mg/ml 后备用。注：冻干品或无菌粉末用检查用水溶解后 体积有无变化，根据具体情况定。取一支细菌内毒素标准品， 参加1m检查用水溶解，然后取内毒素标准溶液 制备内毒素标准对照溶液；再取内毒素标准溶液 加上的5mg/ml头孢哌酮钠溶液，即为含10倍内毒素稀释液的供试品溶液， 取含10倍内毒素稀释液的供试品加上 的5mg/ml头孢哌酮钠溶液，即为含 100倍内毒素稀释液的供试品溶液。其余依次类推。 简化法制备含内毒素的供试品溶液：浓度为的内毒素标准溶液+ 浓度为10mg/ml的供试品溶液 得到1ml的含