海带多糖对心理应激动物血管内皮细胞防护作用研究.docx

1、海带多糖对心理应激动物血管内皮细胞防护作用研究广西医科大学科学型研究生学位论文选题报告及论文工作计划课题名称 海带多糖对心理应激动物 血管内皮细胞防护作用研究 攻读学位及类型 科学型 学 号 20091004 研究生姓名 黎 静 学科专业 病理学与病理生理学 年 级 2009级 所在学院 基础医学院 导师姓名 谢 露 开 题 时 间 2010 年 5 月 7 日 一、摘要课题研究目的、理论意义和实际应用价值心理社会因素是损伤血管内皮细胞( vascular endothelial cell, VEC)，导致心脑血管疾病的重要因素。精神紧张、情绪焦虑等心理应激状态，使自主神经系统功能失衡，交感神

2、经活动增强时，肾上腺髓质释放肾上腺素（Adrenaline，Adr）增多，Adr在酶的作用下，脱氨生成毒性代谢物，损害VEC组织结构和功能，因此保护VEC是心血管疾病防治的关键。一些化学药物虽有一定的内皮细胞保护作用，但它们的使用一般在疾病发生之后，由于治疗用途上的特定性和不良反应的影响，不宜用于单纯性内皮细胞的保护。而大部分中药的研究只处于检测内皮细胞损伤标志物的层面，很少进入机制的研究，也没有涉及心理应激-Adr对VEC损害方面。申请者课题组已经对海带多糖组分保护VEC的作用进行了研究，实验表明海带多糖能够防护大剂量Adr引起的内皮损伤。申请者拟从心理因素对VEC功能的影响方面，进一步探讨

3、海带多糖拮抗Adr损害的作用机制是否是通过抑制脱氨，阻碍毒性代谢物的生存从而防护内皮细胞免受损害有关？从内源性Adr脱氨途径寻求安全有效的血管保护剂。二、文献综述国内外研究现状、发展动态；所阅文献的查阅范围及手段立项的意义和必要性 心理社会因素是损伤血管内皮细胞( vascular endothelial cell, VEC)，导致心脑血管疾病的重要因素。精神紧张、情绪焦虑等心理应激状态，使自主神经系统功能失衡，交感神经活动增强时，肾上腺髓质释放肾上腺素（Adrenaline，Adr）增多，Adr在酶的作用下，脱氨生成毒性代谢物，损害VEC组织结构和功能，因此通过抑制Adr过度脱氨来保护VEC

4、是一条防治心血管疾病的有效途径。申请者所在课题组从广西北部湾海带中提取出高含量的多糖组分，对其保护VEC的作用进行了初步研究。通过注射Adr制备血管内皮损伤大鼠模型，免疫组化显色显微镜检测完整内皮层长度(m)，发现海带多糖用药组完整长度明显大于模型组；透射电镜观察可见Adr与内皮细胞共培养时对细胞核及线粒体损害明显，细胞核形状不规则，核仁固缩；线粒体肿胀，嵴完全消失，空泡化。而加入海带多糖的培养细胞组细胞核及线粒体结构完好。除了在形态上有保护作用外，海带多糖也显示出对VEC功能的维护作用，如能够降低血管内皮损伤大鼠血小板粘附率及聚集率、降低血浆血管性假血友病因子（von Willebrand

5、factor, vWF）、血栓烷素B2（thromboxane B2, TXB2）、血小板a颗粒膜蛋白140（GMP-140）水平和提高6-酮-前列腺素F1（6-Keto-PGF1）水平1,2；能够减少纤溶酶原激活剂抑制物1（PAI-1）的释放和mRNA的表达3,4。心理应激时大量Adr释放，产生损害内皮细胞的毒性产物，引起的内皮损伤和功能紊乱。在本课题，申请者拟从心理因素对EVC功能的影响方面，在前期研究基础上，进一步探讨海带多糖拮抗Adr损害的作用机制，是否是通过抑制脱氨，阻碍毒性代谢物的生成，从而防护内皮细胞免受损害？本课题探索保护VEC新途径，具有可期待的研究价值。国内外研究现状及分析

6、一、血管内皮细胞功能与心血管疾病关系VEC是血液与血管组织间的一道半通透屏障，总面积400m2，是心血管内分泌“器官”, 代谢活跃,功能多样：（1）释放生物活性物质，调节血管张力，血管舒张因子如内皮衍生松弛因子亦即一氧化氮（NO）和前列腺素I2（PGI2）；血管收缩因子如内皮素（ET）、血栓素A2（TXA2）及自由基。（2）构成天然屏障，维持血管内膜光滑完整，防止血小板和白细胞粘附及有害物质侵入血管壁。（3）组成渗透性屏障，承担物质交换和主动转运功能。（4）合成致栓或抗栓物质，保持止血与抗凝平衡，如组织型纤溶酶原激活物（t-PA）、肝素、PAI-1及vWF。（5）构成胶原基底膜及平滑肌细胞保护

7、层。（6）合成血管生长因子及血管紧张素转化酶。（7）影响血管壁对脂蛋白等物质的代谢。血管内皮细胞既是感应细胞又是效应细胞，能感知血液中的炎性信号、激素水平、切应力、压力等信息，同时通过释放活性物质对这些信息作出反应以维持血管系统的稳态5。血管内皮与心血管疾病的密切关系已被人们认识，内皮细胞功能紊乱（endothelial dysfunction, ED）成为研究热点，ED既是心血管病的早期表现形式，又是早于动脉硬化形态学发展的第一步，1995年Schwartz将血管内膜比喻为产生“动脉粥样硬化与再狭窄的温床”。许多心血管疾病及危险因素均可以导致内皮功能损伤，而内皮功能损伤又常伴发和加重心血管疾

8、病。例如，对高血压的研究证实，高血压患者存在内皮依赖性血管舒张功能失调及内皮分泌功能失调6。生理情况下，内皮细胞分泌的缩血管和舒血管物质处于平衡状态。内皮细胞功能失调或损伤时，缩血管物质分泌增多，舒张血管因子分泌减少，导致外周血管阻力增加，血压升高。同时血压升高进一步加重血管内皮细胞的损伤，形成一个恶性循环。有关动脉粥样硬化机制有多种学说，一般认为是血管内皮细胞机能的变化和损害引起内皮细胞剥离，血浆成分(脂质)的浸润，巨噬细胞的浸润，血管内平滑肌细胞增殖。现代观点认为血管内皮受损、血管内皮功能减退是促发动脉粥样硬化发生发展的最重要的始动因素7 。这主要与内皮细胞损伤后，分泌ET、血管紧张素(a

9、ngiotensin, Ang)等促动脉粥样硬化物质增多及促血栓形成有关。二、心理应激、Adr与血管内皮细胞功能紊乱的关系心理社会因素是心脑血管疾病的重要诱因。精神紧张、情绪焦虑等心理应激状态，可引起自主神经系统功能失衡，交感神经活动过强而副交感神经活动减弱12, 13。交感神经维持适度的紧张性，可通过受体介导，使内皮细胞合成和释放NO，与其引起血管平滑肌收缩作用相拮抗，维持血管适度的张力。但交感神经紧张性过高，则更多地促使ET释放，而后者反过来又抑制NO的释放，导致血流剪切应力、压力等生物力学的剧烈变化，对血管壁产生机械损伤。另一方面，交感神经活动增强时，肾上腺髓质释放Adr增多，Adr在A

10、型单胺氧化酶作用下，脱氨生成2-（3，4-二羟苯基）-2羟基乙醛、过氧化氢和甲胺（MA），后者在氨基脲敏感胺氧化酶（SSAO）作用下生成甲醛、过氧化氢和氨10。 MA与VEC大分子形成加合物，使一些重要蛋白质功能受损，引起VEC功能障碍。慢性心理应激引起内源性Adr过度脱氨，启动反复的内皮损伤，最终可能导致粥样斑块的形成，因此Adr过度脱氨被认为是一个引起心血管疾病的高危因子15。三、防护心理应激致内皮功能紊乱的药物研究思路保护VEC是治疗心血管疾病的重要目标之一，对具有内皮功能保护作用的化学药物及中药的研究已有不少，但针对心理应激致VEC损害的防护药物研究未见报道。1.化学药物 血管紧张素转

11、换酶抑制剂(ACEI) ACEI类药物主要通过四方面来保护血管内皮细胞的功能：(1)抑制AngI 转化为Ang，减轻Ang引起血管收缩而造成的内皮细胞损伤；(2)减少内皮细胞形成的ET；(3)增加缓激肽和前列环素的形成。扩张血管，降低血压，从而减轻因血管内压力过高造成的内皮细胞损伤；(4)清除氧自由基，减轻氧自由基对血管的损伤作用。Ang受体拮抗剂(ARb) 动物实验发现，ARb 可逆转动脉的内皮功能障碍、改善冠脉血流并防止粥样硬化斑块形成。临床研究发现，氯沙坦与雷米普利一样可改善非胰岛素依赖性糖尿病及高血压患者的内皮功能。主要是因为ARb 类药物可促进内皮细胞释放NO、减少ET的形成，从而对

12、抗粥样硬化斑块的形成16 ,17 。雌激素 雌激素可以促进血管内皮细胞NO的释放和内皮一氧化氮合酶(eNOS) mRNA表达18。但可引起静脉血栓形成和心脏病发作增加19。尽管这些药物表现出一定的内皮细胞保护或功能调整作用，但它们的使用一般在疾病发生之后，由于治疗用途上的特定性和不良反应的影响，不宜用于单纯性内皮细胞的保护。2.中药许多研究表明中药提取物或复方含药血清能够通过不同途径保护VEC20：（1）直接拮抗ET收缩血管的作用，减少ET合成，促进内皮细胞修复；（2）提高内皮细胞抗脂质过氧化能力；（3）抑制内皮细胞的氧化应激；（4）调节粘附蛋白和（或）炎性细胞因子基因的表达及对抗免疫损伤。中

13、药内皮保护作用研究的实验动物模型多采用高血脂模型，培养细胞实验多采用内毒素、氧化剂刺激。采用肾上腺素模型研究中药成分内皮保护作用的仅见于申请者课题组。目前，中药成分抑制肾上腺素过度脱氨对内皮细胞的损害研究未见报道。3.海带多糖海带多糖具有诸多的保健功能和药理作用，在很大程度上与其活性多糖成分有关。近年来对海带多糖的生理活性研究已有不少报道，实验表明这一类多糖有多方面的作用，例如，降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、抑制体外血小板聚集与血栓形成、调节免疫功能等，但对海带多糖保护VEC作用的报道较少，尤其是对其保护VEC作用的机制研究尚未见报道，因此，本课题通过对其机制探索保护VEC新途径，具有可期待

14、的研究价值。申请者课题组多年来一直进行广西海带多糖组分的抗血栓研究，从中发现其中的一个组分（L01）对内皮细胞有较好的保护作用。采用注射肾上腺素法建立血管内皮细胞损伤大鼠模型，主动脉切片免疫组化检测血管内皮受损情况，测定血浆血栓烷A2代谢物TXB2、前列环素I2代谢物6-Keto-PGF1、血浆颗粒膜糖蛋白GMP-140浓度和vWF含量。结果表明，L01能够拮抗肾上腺素致内皮损伤脱落，维护内皮层的完整性，能够降低内皮细胞损伤大鼠血浆TXB2、GMP-140、vWF水平，并提高6-Keto-PGF1水平。体外培养人脐静脉内皮细胞，用肾上腺素作为刺激物，电子显微镜观察可见培养24h细胞超微结构发生

15、明显变化，细胞间连接缺失、细胞核变形、线粒体肿胀、嵴溶解，L01能够有效地拮抗这些结构的改变，并使培养细胞vWF、PAI-1分泌降低及PAI-1mRNA表达下调21,22,23,24。心理应激时交感神经高度兴奋，肾上腺释放肾上腺素增多，甲醛等毒性代谢物生成增多，对内皮细胞的结构和功能产生伤害。人们在日常工作、生活中时时刻刻都在承受着心理应激对心血管系统的影响，在心理应激时间长、强度大或个体对心理应激反应性大的情况下，内皮细胞容易受损，引发心血管疾病。因此，除进行心理调整外，适当地使用针对性强的内皮细胞保护剂，在预防上下功夫，将能减少或减缓心血管疾病的发生、发展。L01能够防护注射大剂量肾上腺素

16、造成的动物内皮损伤，是否能够防护心理应激造成的损害呢？如果有该作用，机制是什么？是通过影响肾上腺素代谢酶的活性，使毒性代谢物生成减少？还是通过阻碍代谢物与内皮细胞的结合，起屏障保护作用呢？本申请项目旨在通过一些基础研究回答上述问题，为海带多糖在预防心血管疾病方面的利用作出贡献。参考文献：1谢露，陈蒙华，刘爱群，等.海带多糖对血管损伤大鼠血小板活性的影响.中国公共卫生，2005，21（8）：959-9602鲁波, 谢露，黎静，等. 海带多糖对肾上腺素致老年大鼠内皮细胞损伤的保护作用, 中国老年学杂志,2006,26 (9): 1252 -1254.3黎静，谢露，刘爱群，等.海带多糖L01对血管内

17、皮细胞表达血管性假血友病因子影响的体内外实验J.中国临床康复，2006，10（9）：99-1014刘爱群，谢露，黎静，等.海带多糖L01对人脐静脉内皮细胞表达和分泌PAI-1的影响J.中药新药与临床药理，2006，17（1）：9-125席春生. 血管内皮研究进展J. 西北国防医学杂志, 2004, 25(6): 447 4496 Slaninka2Miceska M , Bogdanska J , Korneti P ,et al . Effect of angiotensin II type 1 (AT1) receptor antagonist on t he endothelial dy

18、sfunction in spontaneously hypertensive rat s in correlation wit h t he nitric oxide systemJ. Bratisl Lek Listy, 2003, 104 (11): 342-346.7 Vanhoutte PM. Endot helial dysfunction and at herosclerosisJ. Eur Heart J, 1997, 18Suppl E: E19-29.8 WalterDH, Rittig K,Bahlmann FH, et al. Statin therapy accele

19、rate endothelializationcJ. Circulation, 2002, 105 (25): 3017-3024.9 Hill JM, Zalos G, Halcox JP, et al. Circulating endothelial p rogenitor cells. vascular function. and cardiovascular risk J. N Engl J Med, 2003, 348 (7): 593-600.10 Johannes H, John W, Wikstand H, et al. Atherosclerotic changes in t

20、he carotid artery bulb as measured by B-mode ultrasound are associated with the extent of coroary atherosclerosis. Stroke, 1997, 28: 1189-1194.11 Gibbons GH. Endothelial function as a determinant of vascular function and structure: a new therapeutic target. Am J Cardiol, 1997, 79( Suppl): S3-8.12 Ha

21、rris, Kelly F. Matthews, Karen A. Interactions Between Autonomic Nervous System Activity and Endothelial Function:A Model for the Development of Cardiovascular Disease. American Psychosomatic Society, 2004, 66(2): 153-164.13 Davies PF: Flow-mediated endothelial mechanotransduction J. Physiol Rev, 19

22、95, 75: 519-560.14 Boor, P., Trent, M. B., Lyles, G. A., et al. Methylamine metabolism to formaldehyde by vascular semicarbazide-sensitive amine oxidaseJ. Toxicology, 1992, 73:251-258.15 Peter H.Yu, Chien-Tsai Lai, and Dong-Mei Zuo. Formation of Formaldehyde from Adrenaline In Vivo; a Potential Risk

23、 Factor for Stress-Related AngiopathyJ. Neurochemical Research, 1997, 22(5): 615-620.16 Slaninka, Miceska M, Bogdanska J, Korneti P, et al. Effect of angiotensin II type 1 (AT1) receptor antagonist on t he endot helial dysfunction in spontaneously hypertensive rats in correlation with the nitric oxi

24、de system J . Bratisl Lek Listy, 2003, 104 (11): 342-346. 17 Katoh M, Egashira K, Usui M, et al. Cardiac angiotensin II receptors are upregulated by longterm inhibition of nit ric oxide synt hesis in rat sJ. Circ Res, 1998, 83 (7): 743-751.18 Tan E, Gurjar MV, Sharma RV, et al . Est rogen receptor-

25、gene t ransfer into bovine aortic endot helial cells induces eNOS gene expression and inhibit s cell migratin J . Cardiovasc Res, 1999, 43 (3): 788-797.19 Writing Group for the Womens Health Initiative Investigators. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: prin

26、cipal results from the Womens Health Initiative randomized controlled trial. JAMA, 2002, 288(3): 321-333.20高琳琳, 王浩.中药保护血管内皮细胞结构和功能的研究进展J.中国动脉硬化杂志, 2006,14(10): 907-910.21 谢露,陈蒙华,刘爱群,等.海带多糖对血管损伤大鼠血小板活性的影响. 中国公共卫生, 2005, 21(8):959-960.22 .黎静,谢露,刘爱群,等.海带多糖L01对血管内皮细胞表达血管性假血友病因子影响的体内外实验. 中国临床康复, 2006, 10

27、(9):99-101.23 谢露,刘爱群,黎静,等.海带多糖对肾上腺素致血管内皮细胞损伤的防护作用. 中国应用生理学杂志, 2007, 23(2):143-146.24 刘爱群,谢露,龙敬伦.海带多糖对血管内皮细胞保护作用. 中国公共卫生, 2008, 24(3):334-336.三、研究内容1主要研究内容及拟解决的问题1项目研究内容（1）两种心理应激动物模型制备。（2）心理应激大鼠VEC结构和功能检测及海带多糖的防护作用实验2拟解决的关键问题（1）心理应激动物Adr释放量与VEC功能紊乱及形态损伤的相关关系。（2）Adr脱氨代谢物与VEC功能紊乱及形态损伤的相关关系。2拟采取的研究方法、技术

28、路线、实施方案及可行性分析2.1心理应激动物模型的建立与评价（1）建立两种心理应激动物模型愤怒心理应激大鼠模型造模大鼠均单独饲养，自由饮食饮水。制造昼夜颠倒环境，每晚 24：00开灯，中午 12：00关灯。连续孤独饲养 10d，第 11d 13：3015：30进行实验。在每只造模大鼠笼内放进 1 只入侵鼠（入侵组大鼠予以群居饲养，于实验前 2d禁食 ，不禁水）。同样环境下，正常对照组大鼠予以群居饲养，自由饮食饮水；孤独对照组大鼠均孤独饲养10d，但第11d天不给予愤怒刺激。空瓶刺激大鼠模型大鼠单笼饲养, 每天上午、下午两次定时喂水10min，持续时间7d, 在动物形成一定的条件反射后开始给予情

29、绪应激刺激。第8d开始，在定时喂水期间给予动物空瓶刺激，刺激的给予是无规律的，一天一次（早或晚）或一天两次；同样环境下，对照组大鼠一直定时喂水，生理应激组不喂水亦无空瓶刺激以排除生理缺水的影响。此情绪应激持续14d，每次10min。（2）心理应激状态的评价 分组及行为学评估愤怒心理应激模型实验 将大鼠分为3组：愤怒模型组、孤独组、对照组。愤怒模型组放入入侵鼠后开始计时、摄像，记录第620min内大鼠愤怒行为变化。行为变化指标包括：a.搏斗次数（大鼠嘶咬、拳击、后顶、脚蹬入侵者等动作）。b.威吓次数（大鼠做出佯攻、前扑、威吓、尖叫等姿势，但未接触到入侵者身体）。c. 攀压次数（大鼠将入侵者打倒并

30、压制在其身上，使其不能激烈反抗）。d. 胜利次数（大鼠压在入侵者上面，入侵者长时间仰躺、呆滞）。e.失败次数（大鼠被入侵者打倒、压制）。大鼠行为得分 =a + b + c + d e。第21min将造模大鼠从笼中取出，立即放人旷场实验箱内，进行应激后行为旷场学检测。其余各组也于第11d行旷场行为学检测：把大鼠放入旷场的正中格，用摄像系统记录动物3min的行为变化：a. 水平得分（穿越底面的格子数）。b. 垂直得分（直立、两前爪离开地面的次数）。旷场实验得分 =a + b。同时记录中央格停留时间（指大鼠被放人旷场正中格至其三爪跨离中央格的时间）、修饰（指大鼠前肢向上抬举 、抓痒、洗脸、舔足等动作

31、）次数、修饰时间、粪便粒数。空瓶刺激大鼠模型实验将大鼠分为3组：空瓶刺激模型组、生理应激组、对照组。观察和记录3组动物在每次情绪应激期间的行为表现。观察到行为指标是攻击性行为（咬空瓶和笼子）、探究行为和修饰行为。即在给予情绪应激的10min内对各组每只动物观察4次，记录下每次观察时动物的行为表现（攻击性行为、探究行为或修饰行为），有1次记为1，这样每只动物的三种行为表现均为04之间，共观察14天。第22d各组进行旷场实验，观察方法同上。血浆皮质醇、肾上腺素及其代谢物检测各组动物在旷场行为学检测后麻醉，打开胸腔，心脏取血，放射免疫法检血浆皮质醇含量；高效液相色谱法（HPLC）检测血浆中肾上腺素及

32、其主要代谢物甲胺和甲醛含量；荧光光度分析法检测血浆过氧化氢含量。(3) 血管内皮损伤观察 血管内皮层形态学观察（免疫组化法）：各组大鼠取血后，处死，开胸，先后用Dulbeccos磷酸盐缓冲液和中性甲醛磷酸盐缓冲液进行心脏灌注，固定血管。分离、取出腹主动脉，纵向切开，置于平底皿中，腔面向上展开，加羊抗鼠IgG片段抗体，孵育30分钟，Tris-PBS漂洗，过氧化物酶联驴抗羊IgG抗体，漂洗，3,3-二氨基联苯胺染色，脱水。血管段移至硝化纤维玻片，腔面向下，再脱水后在解剖显微镜下去除内皮层下组织，乙醚-乙醇混合液溶解硝化纤维 ，内皮层腔面朝上置于玻片上，Mayers苏木素染色细胞核，显微镜下观察。 (4)血管内皮功能检测血浆vWF检测：采用放射免疫法检测血浆vWF水平。2.2 海带多糖对心理应激性