完整word版QTRAPIDA指南.docx

1、完整word版QTRAPIDA指南IDA指南Information Dependent Acquisition （IDA)自动关联扫描能够在一个色谱过程中进行MS/MS谱的“on the fly ”采集.Analyst Software IDA通过组合特定的survey scans，高分辨扫描和灵敏的子离子扫描产生大量有用的MS/MS数据.在一个典型的IDA实验中,survey scan产生了一个所有出现离子的峰列表。峰列表根据用户定义的标准除去不想要的母离子。留下的离子则进行MS/MS实验.这个循环在整个采集过程中不断重复，产生了大量的信息丰富的数据。由于Q TRAPTM System仪器灵

2、活性强，有多种不同的扫描选择，所以IDA功能强大而灵活。多个水平的MS/MS和MS/MS/MS可以以完全自动的方式执行.IDA实验可以手动方式建立或者借助IDA Wizard帮助。本指南介绍采用这两种方式建立IDA实验。另外还描述了一些用于蛋白质组学的典型方法；蛋白质鉴定的标准方法，在多肽混合物中筛选磷酸化位点的方法。注意:关于不同扫描方式的更多信息参见Q TRAPTM系统的LIT扫描模式.6。1 击活硬件Profile打开导航栏（屏幕的左边）中的Hardware Configuration Editor，选择与MS系统相联的LC系统的合适的硬件配置并击活Profile.这些外围设备将自动加入

3、到IDA方法中，所以必需提前选好。关于硬件Profile更多的信息参见LC Packing System指南或者Agilent capLC 系统指南。6。2 IDA Wizard 双击导航栏的Acquire部分的IDA Method Wizard，可以登录IDA Wizard。建立IDA Experiment的窗口如下.IDA Wizard简化了建立IDA Experiment的过程。Wizard包括了三个IDA Method,可以采用4个survey scans.前两个采用线性离子阱MS扫描作为survey scans,即EMS和EMC扫描，然后击发EPI从属扫描。第三个选择是用三重四极杆建

4、立实验，即用母离子扫描或中性丢失扫描作为survey scans击发EPI从属扫描。(关于不同扫描方式的更多信息参见Q TRAPTM系统的LIT扫描模式，或Q TRAPTM系统的四极杆扫描模式。)6.3 使用IDA Wizard建立一个蛋白鉴定的IDA方法 第一个介绍的IDA实验是一个典型的蛋白鉴别实验，得到尽可能多的多肽的高质量的MS/MS数据。任何一种LIT MS 扫描都适合这个实验，本实验采用Enhanced MSEnhanced Product Ion scan选择。强烈推荐这类实验中使用Enhanced Resolution Scan.母离子的精确性较好，而且可以精确断定离子的电荷状

5、态。其信息优势远远超过执行该扫描所花费的少量的时间。如下所示两个框均打勾后，点击Next.在下面的窗口中，Enhanced MS Survey Scan的参数被设定。测定多肽质量数的典型的扫描范围为400-1200amu，在Start mass/Stop Mass窗口输入该质量范围。由于母离子的分辨率将在ER扫描中获得，所以使用最快的扫描速度（4000amu/sec）。最后,LIT fill time默认为20ms,在大多数情况下都是好的设置.但是，如果对于样品有一定的信息，也可以进行调整.如果希望得到数量多的多肽则将fill time减少到10ms。如果需要增加灵敏度则将fill time增

6、加到20-50ms.点击Next继续.下面的窗口定义Dependent Scan的参数。一般地，每次对最强的1-3个多肽进行MS/MS.如下所示，在窗口上方设定。EPI实验的碰撞能量（CE）可以通过两种不同的方式设定.选择的每一个母离子可以至多有三个不连续的碰撞能量。例如，如果两个最强的离子被选择,两个不连续的碰撞能量被设定，那么在每次循环中将进行4个独立的EPI扫描.对于蛋白鉴别实验，最好采用Use Rolling Energy 设置每一个多肽的CE值。（Use Rolling Energy将在6。5部分的设置IDA选择标准中描述).其特点是根据每一个多肽的m/z值和电荷状态计算最优的碰撞能

7、量。在Start mass/Stop Mass窗口输入扫描范围100-1700。在EPI扫描中采用最快的扫描速度（4000amu/sec），碎片离子仍然可以达到单位分辨.这种扫描方式中， fill time设置为50ms，也可以根据灵敏度的要求进行调整。点击Next继续。以下描述IDA实验的选择标准.设定潜在的母离子的质量范围，在For ions greater than 和For ions smaller than框中输入要考虑的质量范围。强度阈值允许设定EMS survey scan的离子的最小强度的阈值。在Which exceeds_counts （cps)框中输入希望的强度阈值。强度低

8、于指定强度阈值的离子将从峰队列中除去不进行ER扫描。50000-100000cps是一个好的强度阈值的起点。在With charge state框中打勾，指定进行MS/MS扫描的母离子的预期的电荷状态。当这个选择标准激活以后，只有在ER谱中具有预期电荷状态的离子才会保留在从峰队列中考虑进行子离子扫描。如果电荷状态在ER扫描中没有确定，可以在Include unknowns框中打勾将其包括在峰队列中.对于蛋白消化产物，如果电荷状态不确定，它极有可能是多电荷，因而很有意义。Exclude Former Target Ions标准可以排除已经做过MS/MS的离子。Always 打勾可以将这些离子从剩

9、余的运行中排除。做LC IDA实验时，选择For_(sec)；可以排除有限的时间窗口，在那段时间洗脱的母离子不进行多于一次的MS/MS扫描。如果Never打勾，动态排除关闭。最后，设定After_repeat occurrences，允许一个离子在排除之前进行多次MS/MS扫描。此处输入1，则离子在排除之前进行多于一次MS/MS扫描，意味着对于指定的肽离子共发生两次MS/MS。点击Finish建立IDA方法。6。4 MS方法的精细调节在Acquisition Method 窗口的左边，Mass Spec实验自动组合。而且硬件profile设置的LC系统的外围设备自动添加进方法中.关于外围设备的

10、控制在建立LC系统的指南中有描述。按照其它指南将泵及自动进样器加入IDA方法中。一旦泵及自动进样器参数定义好后，Mass Spec方法完成。点击窗口左边的+EMS条目查看survey scan参数。在窗口右边输入Duration，这个时间不能够比泵走的时间长，应该反映在肽的MS/MS方法的时间窗口中.选择Number of scans to sum可以控制进行survey scan的时间。一般地,survey scan花费的时间为Total Scan Time为 0。5-1sec，或者Number of scans to sum为2.注意当Number of scans to sum改变时,T

11、otal Scan Time相应改变。接下来，点击Edit Parameters钮选择源的设置。如果用Flow NanosprayTM源,IonSpray Voltage（IS）设为2300V(负离子模式为1700V），GS1设为0。如果用TurboIonspray源，IS设为5500V（负离子模式为4500V）,Ion Source Gas 1(GS1）则与流速有关（流速越高，雾化气流速GS1也应该越高）。点击窗口底端的一个或两个钮，Source/Gas 或Compound的参数可以用于所有的实验。点击OK，保存参数。接下来,点击窗口左边的ER scan查看实验设置。Center项下有两个条

12、目,可以进行两个ER scans。当样品有限时,可以打开在Advanced MS表中的Q0 Trapping，ER的扫描速度用250amu/sec，Resolution表中，Q1 Resolution设为Open。注意进行两个ER scans总的时间仅为400ms。额外的这点时间是宝贵的，因为从较高分辨率的扫描中可以获得大量信息。检查dependent scans的设置，点击左边的EPI实验.注意当采用IDA时，Product Of窗口设为30.这表明该数值将由IDA软件自动设置。改变Number of scans to sum,可以调节每个子离子扫描的时间。典型的设置为12sec或共24次扫

13、描。6.5 设定IDA选择标准点击方法的IDA Criteria观察由IDA Wizard得到的设置。设定潜在的母离子的质量范围，在For ions greater than 和For ions smaller than框中输入质量范围。在With charge state框中，可以定义进行MS/MS扫描的母离子预计的电荷状态。当该选择标准被激活以后，只有那些在ER谱中具有预期电荷状态的离子才会保留在峰队列中考虑进行子离子扫描。如果ER扫描的电荷状态被破坏，可以在Include unknowns框中打勾将其包括到峰队列中。对于蛋白消化产物，如果电荷状态被破坏，很可能是多电荷,因而很有意义。注意

14、：一定在Use Enhanced Resolution Scan to confirm state框中打勾，否则EMS survey scan将被用于确定电荷状态。在Intensity Threshold中设定进行EMS survey scan的离子的最小强度的阈值.在Which exceeds_(cps)框中输入希望的强度阈值。强度低于指定强度阈值的离子将从峰队列中排除不进行ER扫描。50000100000cps是一个比较好的起点。Exclude former target ions标准可以排除已经进行了MS/MS扫描的离子。在Always打勾可以从剩余的运行中排除这些离子.进行LC IDA

15、实验时，选择For_(sec)；可以在有限的时间窗口排除，所以具有相同m/z值的母离子在那段洗脱时间内不再进行多于一次的MS/MS扫描。如果Never被选择,动态排除被关闭。最后,设定After_repeat occurrences，在排除之前允许一个离子被多次进行MS/MS扫描。当输入1时，在一个离子被排除之前，可以进行多余一次的MS/MS扫描,意味着对于一个指定的肽离子共有两次MS/MS扫描。Mass Tolerance中设置的为各种include/exclude features的误差允许量，默认值为250mmu。合理的质量允许范围为250500mmu,与期望的MS数据的质量精确度有关。

16、激活Exclude isotopes within将特异性排除指定母离子的一定窗口之上的C13同位素的质量数。对于这一部分3-4amu是有用的。适用于出现在变量排除队列中的特定离子.在确定相关同位素峰时,采用特定的质量允许范围。仅相关同位素峰被特异性排除,而不是整个质量窗口。 在IDA过程中激活Rolling Collision Energy,对于每一个进行MS/MS扫描的肽根据它的m/z值和电荷状态优化碰撞能量。点击Setting钮可以看到定义m/z vs. CE关系的方程。软件带有预先定义的关系（由斜率和截距定义直线）用于优化正常的胰蛋白酶肽的裂解.用户可以调整这些值。一般地，如果希望得到

17、更多的碎片，可以增加截距的值.如果知道样品的其它信息，可以建立Inclusion或Exclusion lists，确保在Include/Exclude list中得到希望的信息。（注意:如果多电荷状态被Included/Excluded，每一个m/z值均需输入).点击Always框，某一个离子可以被排除在整个的采集过程之外。输入保留时间和宽度可以在运行过程中将某个离子特异性地排除在一段时间之外。在Intensity text框中指定Inclusion list的强度阈值（in counts）,这是在survey scan中进行MS/MS扫描时，必需超过的离子强度。这一设定值优先于First L

18、evel Criteria中指定的强度阈值。Inclusion/Exclusion list的Import钮输出简单的文本文件（space delimited text， txt file extension）。在Isotope Pattern 表下，Match isotopes框打勾可以允许survey scan中选择特异的同位素形式作为切换的标准。只有符合这种形式的离子才会进行MS/MS扫描，在Tolerance文本框的左右两边分别输入质量差异和百分丰度的允许值.这些值指的是对第一个峰进行子离子扫描的同位素形式的允许值。如果对于一类化合物的精确同位素比率未知，可以采用Isotope Cal

19、culator进行计算。点击Isotope Calculator，下面的窗口打开。输入感兴趣的分子式（本例中为C34H68C12),从下拉菜单中选择Elemental.在Num of charges框中输入化合物的电荷状态。通过点击Graph或Text表可以将同位素的分布看作图谱或文本文件。点击OK,质量差异和丰度将自动输入到Match isotopes窗口中。（关于如何使用Calculator详见Calculator Tutorial）。点击磁盘图标保存方法。6。6 手动建立IDA方法鉴别磷酸化多肽下一个介绍的IDA实验是一个典型的磷酸化多肽鉴别实例，负离子模式下的母离子扫描作survey

20、scan。本例中对79进行母离子扫描.任何强度高于阈值的离子均进行MS/MS扫描。仪器切换到正离子模式进行快速Enhanced Resolution扫描确证电荷状态.如果为多电荷离子，将进行Enhanced Product Ion扫描。一次循环完成后，QTRAP System切换回负离子模式进行下一次母离子扫描.本例中，IDA方法是手动建立的。这种方法也可以用IDA Wizard建立。在导航图标中的Acquire 部分点击Build Acquisition Method。注意Mass Spec 实验在Acquisition Method窗口左边自动组织。而且，硬件profile 中定义的LC系

21、统的外围设备自动加到方法中.外围设备的控制在关于LC系统的建立的指南中有描述.按照其它指南将泵和自动进样器加入IDA方法中。定义好泵和自动进样器的参数后，Mass Spec部分完成.点击左边Period中第一个MS扫描行。从Scan type菜单中选择Precursor Ion扫描。现在设定母离子survey scan的参数。磷酸化多肽母离子扫描的典型设置如下所示。在Polariy 下点击Negative设定仪器的极性。在Precursor Of窗口输入碎片离子(79）的质量数。合适的多肽范围是3 seonds之内 5001200amu。注意：另一种方法是在相同的窗口中将相同的质量范围输入三次

22、，每次的时间设定均为1 sec 。在IDA标准被应用之前,这三次扫描一起被平均.这可以提高数据质量的信噪比。建议碰撞能量采用ramped 而不要对于所有的磷酸化多肽均采用一个固定的碰撞能量.方法为在质量范围框中右击点灰打开菜单，然后点击Collision Energy CE。在Time (sec）栏的右边将出现额外两栏。输入相对于指定质量范围的CE Start和CE Stop；建议质量范围500-1200amu采用的碰撞能量范围为-45到-95V。 按照LC泵的方法设置Duration 时间,在泵方法完成之前结束MS方法。如6。4部分所描述，点击Edit Parameters设定Source/

23、Gas参数。点击Advanced MS表设定更多的参数。Step size 设定为0。10。45 。质量范围、扫描时间和步长将决定扫描过程中每一步的驻留时间.一般地，步长越大，母离子Survey scan越快。Q1和Q3的Resolution设定与所测样品有关.分辨率越严格扫描的特异性也越强，单信号强度会降低. 右击左边的-Prec行，从菜单中选择Add experiment,可以在IDA方法中增加一个实验。方法中加入了新的一行。点击新的这一行，将Scan type变为Enhanced Resolution,并且将极性改为正离子模式。在右边的质量框中，第一行输入1.告诉软件这是一个IDA方法并

24、采用IDA峰队列中最强峰的质量数。 其它参数均不需改变，打开Advanced MS表注意settling time。当进行极性切换时，扫描之间的settling time为700ms 以使电源稳定.只有极性切换，才用settling time，本例是ER扫描。点击Q0 trapping增加灵敏度。右击左边的ER扫描，在方法中选择Add IDA Criteria Level。有关参考标准的详细解释参见设定IDA选择标准。由于survey scan是三重四极杆扫描模式,所以这类实验的强度阈值定的很低。典型的设置为200500cps，观察实验得到的强度设定相应的阈值。最后，右击IDA Criteri

25、a增加另一个实验。将实验改为Enhanced Product Ion scan type.不要改变这种扫描类型的Product Of窗口，采用上述ER扫描所决定的质量数。输入希望的质量范围,典型的质量范围为1001700.当输入质量范围后，该范围分成两个独立的范围。自动优化选定质量范围的四极杆的传输步长。改变 Number of scans to sum调节每个离子进行MS/MS所需时间。在Advanced MS表中选择4000amu/sec扫描速度.注意:EPI实验的settling time为0，因为ER和EPI扫描之间没有极性切换。在母离子扫描中settling time自动调整,EPI扫描和下一次母离子扫描之间由正离子模式切换到负离子模式。点击磁盘图标保存方法。