细菌内毒素检测方法验证方案说明.docx

1、细菌内毒素检测方法验证方案说明细菌内毒素检测方法验证方案起草人 起草日期 审核人 审核日期 批准人 批准日期 西安力邦制药有限公司细菌内毒素检测方法验证方案目 的范 围责 任 人内 容1.实验材料及用具2实验准备3.具体验证步骤3.1.鲎试剂灵敏度复核3.2.干扰实验33供试品细菌内毒素检查附: 表1.鲎试剂灵敏度复核记录表2.干扰试验记录表3.细菌内毒素检查记录细菌内毒素检测方法验证方案目的：为确保盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。范围：盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法责任人：细菌内毒素检验员、QC主管内容：1.实验材

2、料及用具1.1.电子天平12电热干燥箱13恒温水浴箱14水银温度计1.5.旋涡混合器16 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号）1.7.细菌内毒素工作标准品（由中国药品生物制品检定所统一发放的 标准品）1.8.细菌内毒素检查用水1.9.实验用具：移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、 时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。2实验准备2.1.玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或 清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底 洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容 器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。2.2.除去玻璃器皿表面可能

3、存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250C，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干 烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用 锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用， 否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。3.具体验证步骤3.1.鲎试剂灵敏度复核3.1.1.实验操作3.1.1.1.细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用 砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应 防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查

4、用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀 释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2入、入、0.5入、0.25 入（入为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混 合器上混合30秒钟。3.1.1.2.待复核鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落 入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充 分溶解，避免产生气泡。3.1.1.3.力叶羊 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列， 其中4列4支（管），1列2支

5、（管）。4支（管）4列每列每支分别加 入0.1ml的2入、入、0.5入、和0.25入的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。3.1.14 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免 产生气泡，连同试管架放入37C水浴或适宜恒温器中，试管架保 持水平状态，保温60翌分钟。3.1.1.5.观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动, 将每管拿出缓缓倒转180观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱 者为阳性，记录为（+）;未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁 滑脱者为阴性，记录为（）3.1.2.实验结果计算如最大浓度2.0入4管均为阳性，最低浓度0.25入4

6、管均为阴性，阴性 对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即 为鲎试剂灵敏度的复核结果（入c）。1入 c = lg -（刀 X/4）式中x为反应终点浓度的对数值（lg ）。反应终点浓度是系列递减的 内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。3.1.3结果判断3.131.判断标准当入c在0.5入2入（包括0.5入和2入）时判定该批鲎试剂灵敏度复 核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以入（标示灵 敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。3.1.3.2.判断结果：（记录附后）3.2.干扰实验3.2.1.操作方法3.2.1.1.目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的 反应

7、有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过 所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。3.2.1.2.制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2入、入、0.5入、0.25入（方法同3.1.1.1.）。3.2.2.3.制备含内毒素的供试品溶液将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数， 再用此稀释 液将3.2.3.1.中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2入、入、 0.5入、0.25入的含内毒素的供试品溶液。3.2.2.4.鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在 瓶颈轻轻划痕，75%酒精

8、棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。322.5.力叶羊将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4 支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的 2.0入、1.0入、0.5入、0.25入的内毒素标准溶液，另一列2支（管） 加入0.1ml检查用水作为阴性对照。将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列, 4列4支（管），1 列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0入、1.0 入、0.5入、0.25入的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.

9、1ml 供试品溶液作为样品阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振 动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37C水浴或适宜恒温器中， 保温60翌分钟后，观察并记录结果。3.2.3.实验结果计算如两组最大浓度2.0入均为阳性，最低浓度0.25入均为阴性，阴性对 照，管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的 反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内 毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）.-1Es= lg （刀 Xs/4）1E二 lg -（刀X/4）Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的 反应终点浓度的对数值（lg ）。3.24结

10、果判断3.241.判断标准当Es在0.5入2.0入（包括0.5入和2.0入）时，且E在0.5 E s 2.0Es （包括0.5 Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实 验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。当E不在0.5 Es2.0Es （包括0.5 Es和 2.0Es）时，贝卩认为供试品 在该浓度下干扰实验。3.242.判断结果：（记录附后）3.3.供试品细菌内毒素检查在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。3.3.1.操作方法3.3.1.1.供试品溶液的制备：（稀释倍数不得超过 MVD3.3.

11、1.2.阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成2入浓度的内毒素标准溶液（方 法同 3.1.1.1.）。3313 供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成 2入浓度的内毒素溶液。（方法同321.32 供试品阳性对照溶液的制备）。3.3.1.4.阴性对照液用细菌内毒素检查用水3.3.1.5.鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮 在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶 内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶 解，避免产生气泡。3.3.1.6.加样取8支（管）溶解好的

12、鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试 品溶液或其稀释液（其稀释倍数不得超过MVD作为供试品管，2支加 入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC，2支加入0.1ml检查用 水作为阴性对照管（NC , 2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供 试品阳性对照管（PPC。3.3.1.7.将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37 C C水浴或适宜恒温器中，保温60翌分钟。保温和取放试管过程 应避免受到振动造成假阴性结果。3.3.2.结果判断3.3.2.1.判断标准当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如 供

13、试品2管均为阳性，应认为不符合规定；如2管中1管为阳性，1管 为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性， 即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于 MV而结 果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时 要求将其稀释至MVD3322判断结果：（记录附后）4.验证结论附：表1鲎试剂灵敏度复核记录检验目的检验日期检验依据室温试剂名称生产单位批号灵敏度/效价规格鲎试剂EU/ml细菌内毒素标准品EU/支细菌内毒素检查用水实验操作标准品稀释：反应结果保温时间（ ）内毒素浓度EU/ml2入 入0.5 入0.25 入()()()()阴性对照终点浓度结果计算结

14、果判断检验人员校对人员表2干扰试验记录检品名称检验日期生产单位室温供样单位规格批号包装检验依据内毒素限度试剂名称生产单位批号灵敏度/效价规格鲎试剂EU/ml细菌内毒素标准品EU/支细菌内毒素检查用水实验操作1.标准品稀释：2.供试品制备：3.含供试品内毒素溶液的制备：反应结果保温时间（ )内毒素浓度EU/ml2入 入0.5x()()(入 0.25)()阴性对照终点浓度重1标准复2对照管3数4重1含供试品复2的内毒素管3溶液数4结果计算结果判定检验人员校对人员表3细菌内毒素检查记录检品名称检验日期生产单位室温供样单位规格批号包装检验依据内毒素限度试剂名称生产单位批号灵敏度/效价规格鲎试剂EU/ml细菌内毒素标准品EU/支细菌内毒素检查用水实验操作1.标准品稀释：2.供试品制备：MVD=3.供试品阳性对照液的制备：仪器：保温时间( )保温温度：结果供试品管供试品阳性对照阳性对照阴性对照结果判断检验人员校对人员