论文资料种植体周骨缺损骨靶向人工骨充填材料的设计制备及生物学评价.docx

1、论文资料种植体周骨缺损骨靶向人工骨充填材料的设计制备及生物学评价种植体周骨缺损骨靶向人工骨充填材料的设计、制备及生物学评价一、项目可行性报告（一）立项的背景和意义近年来，随着种植技术广泛应用于临床，以及种植器械、材料的不断革新，种植牙逐渐成为缺失牙修复的首选，种植义齿可以显著提高口腔修复治疗水平和质量，提高缺牙患者的生活质量。但在临床上约有一半病人的牙槽骨因拔牙、牙周病、外伤、肿瘤和畸形等形成骨缺损，这对种植体的早期骨结合有很大的影响，因此大量存在牙槽骨缺损的种植患者需要同期植入骨充填材料以弥补骨量不足的问题。理想的骨充填材料应具有骨诱导性、骨传导性、生物相容性、良好的生物力性能、材料可梯度降

2、解性、可快速血管化并且要有较高的性价比。新鲜的自体骨移植是理想的骨移植材料，但自体骨移植存在一些缺点：如增加切口、创伤、感染等，给病人造成生理和心理方面的影响。目前临床上应用较多的是人工骨粉，临床实践中发现牙槽骨缺损修复时如缺损形态有明显的洞型，植入人工骨粉和覆盖骨膜后能保持一定的三维形态空间，6个月后可见新生骨组织充满维持着的空间，形态很好，如上颌窦底前部植骨效果较好；但如果牙槽骨缺损呈浅凹坑状时（前牙区以及下颌后牙区），植入的粉末状人工骨粉和覆盖人工骨膜后很难保持一定的三维形态空间，6个月后偶见形态良好的骨组织。原因可能是目前应用的人工骨粉呈细沙状，无原位固化作用，不能塑型，粘膜缝合后存在

3、一定张力，愈合过程中还有组织水肿等使张力增加，因此很难维持三维空间，致使新骨形成速率缓慢、形态差，不能满足临床要求。目前临床上还发现一个问题是人工骨粉在植入体内6个月后虽然形成一定的新骨，但新骨只能维持外形，不能承受咬合力，原因是人工骨粉大部分未被新骨替代，而只是新骨或纤维组织长入骨粉颗粒间隙中，使骨粉形成块状形态，用刮匙可以很轻松的去除，不能承受一定的张力。此外，目前临床上主要应用的是价格昂贵的进口人工骨粉，并且大多数是动物来源的，存在一定的免疫源性和交叉感染等风险。因此，研究开发可塑性的、生物活性优良的人工骨充填材料是目前急需解决临床治疗期长、费用昂贵等问题的根本途径。该类材料如若能克服上

4、述人工骨粉临床应用中存在的问题，又能在形成新骨的同时植入材料完全被吸收，新生骨质量与宿主骨相似，并且新生骨强度与宿主骨填塞应力强度无差异，将势必从根本上解决目前临床治疗存在的系列问题。 另外，在口腔医学领域还存在因牙周病、缺牙时间过长、外伤等造成的牙周健康不良、牙槽骨缺损，以及先天性腭裂造成的部分牙槽骨缺失，解决诸如此类的问题都需要植骨。因此，口腔医学对骨充填材料有着广泛的市场需求。据统计，全国骨缺损病例大约为300万/年，若按目前国内市场上骨修复产品每单位2000-3000元人民币左右计算，人工骨充填材料制品潜在的市场非常大，大约是10亿元人民币/年。如能开发出具有自主知识产权的人工骨充填材

5、料，势必会解决一大批病人因严重牙槽骨缺损造成的种植修复困难和修复后美观效果差等一系列问题，并将解决病人心理和肉体上的痛苦，产生较大的社会效益，甚至可望搭建一个持续自主开发以一系列新型人工骨和相关医用生物材料的研发平台，并将对我省医用生物材料高附加值新兴产业发展产生重要推动作用。（二）国内外研究现状和发展趋势 长期以来，人们在不断探索更为理想的骨缺损修复材料，人们相继开发的同种骨、异种骨、生物活性陶瓷材料、可降解高分子材料及其复合材料，如胶原复合羟基磷灰石、骨形成蛋白复合人工骨等都取得很多研究进展，但也存在种种问题。目前国内外专家都正在努力探索和开发生物相容性和亲水性好，同时具有促进骨组织生长的

6、生物材料，但在材料的三维多孔微结构设计与构建方面存在着较多的难题。口腔科所用充填材料的各种性能与骨科的要求又有所差异，譬如因牙槽骨血供好，一般不强调充填材料的机械强度指标，但要求材料具有相互贯通的多孔孔道，并具有良好的骨传导、骨诱导作用，并且希望材料降解速度和新骨生成速度相匹配等。 磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate cements，简称CPC)是20世纪80年代中期由Brown和Chown研制成的人工骨材料，是一类以各种磷酸钙为主要成分的新型骨修复材料，制备简便、易塑形、不产热，在生理条件下具有自固化性能，其无毒性、无致畸、无潜在致癌性，生物安全性良好。动物实验和临床应用都证实

7、CPC具有良好的生物相容性和骨传导作用，能保持一定的刚度和强度。但是其自身所存在的诸如抗水性差、固化速度慢、孔径较小、降解速度缓慢、机械强度不足等缺点极大地限制了其在更广泛领域的应用。近几年CPC的复合改性成为生物材料研究领域的热点，研究都集中在CPC复合改性后的生物学性能改变。预混合磷酸钙骨水泥( Premixed calcium phosphate cements, PCPC) 能克服原位即时混合型的传统CPC混合不均匀、不充分的缺点, 并能根据缺损部位形状不同而随意塑形, 具有方便临床手术操作、节约手术时间、便于保存等优点, 因而也成为该领域研究热点之一。对于CPC的降解机制，国外许多学

8、者进行了广泛的研究，一般认为CPC在体内体液的作用下，先从材料表面开始溶解，膨胀，使结构疏松，粒子被分散，表面积迅速扩大，然后多核细胞、巨噬细胞和破骨细胞聚集于骨水泥表面，吞噬分解后的粒子，随着体液循环进入体内钙库，并降低体液局部的pH值。总的来说，CPC植入体内会发生被动和主动两种方式的吸收降解，被动吸收依赖于CPC的成分，并受材料多孔性、离子置换、晶体特征及水泥组织面pH的影响；主动吸收则与破骨细胞活性有关，还与植入部位、被植入体的年龄有关。因此，只能通过改变材料本身的性质来改变材料在体内的降解性能。CPC中贯穿式多孔结构有利于组织液渗入，使组织液能够进入材料内部，材料与组织液接触面积增加

9、，有利于材料的生物降解；同时多孔结构可作为药物的植入载体，随着材料的降解而释放药物。一定形式的三维微孔结构的存在可使毛细血管在孔腔内生长，有利于材料的血管彼此连通，从而保证长入材料内部的骨组织有营养供给，因而多孔材料的研究制备已逐渐成为热点。另外，随着新生骨组织的长入，多孔材料在完成骨引导、骨诱导作用后逐渐降解吸收。课题组合作者已经研究出一种多孔性球形PCPC微颗粒（图 1），该材料随制备参数的变化可改变微球直径在301000 m调节，并且内部贯通孔洞大小也可以调节，因而具备上述要求。图1. 扫描电镜图：PCPC为球形，直径为250um，可见多孔状结构。 本项目课题组对生物材料三维多级孔洞微结

10、构的生物学效应和降解过程进行深入的研究，在此基础上制备新型多孔材料，这种三维多孔微结构能根据成骨细胞和骨组织生长的需要，控制材料的降解速度。通过降低钙磷原子量比，材料的降解性增大，孔隙增多，形成的多孔材料可吸附生长因子、药物和基因等活性成分，用于修复和重建骨组织缺损，也可作为支架材料用于组织工程，同时随着材料的降解释放活性成分进一步促进成骨。同时，材料碳酸化后具有较好溶解性，充填骨缺损后界面与骨结合紧密，生物相容性良好，并且随着植入时间的延长可逐渐降解并被新生骨爬行替代，与骨整合为一体。 Mundy于1999年发现他汀类药可明显增强成骨细胞BMP-2基因表达并促进骨形成。研究发现辛伐他汀（Si

11、mvastatin）具有骨靶向性，可促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，并促进骨形成。动物实验也表明辛伐他汀在促进大鼠新骨形成，增加皮质骨骨密度，并抑制松质骨骨量的丢失，给去势大鼠胃肠灌药辛伐他汀能够促进种植体骨结合。课题组前期研究表明辛伐他汀能明显促进种植体周围新骨形成，因此将辛伐他汀吸附于CPC内部的多孔装结构中，可对骨缺损内的骨髓基质干细胞有很好的骨靶向性，随着CPC的降解而释放，从而促进新骨形成。 抗溃散性是指CPC在血液、水或水溶液的静水压力下抗渗防溃散的能力，对于大量出血的外科手术(如脊柱原位成型、牙槽修复等)，这一性能显得尤为重要。若抗溃散性不好，则材料在植入后、凝结前遇渗液则稀散

12、不成型，影响其固化，并造成骨水泥流失或随血液流动游离扩散，不但会影响临床应用效果，而且有产生副作用的风险。因此，提高CPC 的抗溃散性是至关重要的。胶原以其优良的生物相容性、适宜的可降解性和成凝胶性的特点在骨组织工程中得到广泛的应用，本研究拟采用胶原来改善CPC的抗溃散性能，将辛伐他汀吸附于球形CPC微球孔道内，并与胶原按一定比例自组装，构建新型的具有骨靶向的人工骨充填材料，该材料在接触生理盐水或血液可快速塑形，以便应用于种植体周骨缺损。参考文献1.Hockin H.K. Xua, Michael D. Weir, Carl G. Simon. Injectable and strong na

13、no-apatite scaffolds for cell/growth factor delivery and bone regeneration. Dental materials 2008;24:121212222.Hemin Nie, Beng Wee Soh, Yin-Chih Fu, Chi-Hwa Wang.Three-Dimensional Fibrous GA/HAp Composite Scaffold for BMP-2 Delivery.Biotechnol. Bioeng 2008;99: 223234.3.Alberto J. Ambard, Leonard Mue

14、ninghof. Calcium Phosphate Cement: Review of Mechanical and Biological Properties. J Prosthodont 2006;15:321-328.4.Masayoshi Nakadate, Norio Amizuk Aminqi LI, Paulo H.L.Histological Evaluation on Bone Regeneration of Dental Implant Placement Sites Grafted With a Self-Setting a-Tricalcium Phosphate C

15、ement. Micro Res Tech 2008; 71:93104.5.Esther W. H. Bodde, Camille T. R. Cammaert, Joop G. C. Wolke, Paul H. M. Spauwen, John A. Jansen . Investigation as to the Osteoinductivity of Macroporous Calcium Phosphate Cement in Goats.J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 2007; 83B: 161168.6.Hockin H.K.

16、 Xu_, Michael D. Weir, Elena F. Burguera, Alexis M. Fraser. Injectable and macroporous calcium phosphate cement scaffold. Biomaterials 2006;27: 42794287.7.Oh SA, Lee GS, Park JH, Kim HW. Osteoclastic cell behaviors affected by the -tricalcium phosphate based bone cements. J Mater Sci Mater Med. 2010

17、 Sep 21 Epub ahead of print8.Weir MD, Xu HH. Osteoblastic induction on calcium phosphate cement-chitosan constructs for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A 2010;94(1):223-33.9.Yang X, Gan Y, Gao X, Zhao L, Gao C, Zhang X, Feng Y, Ting K, Gou Z. Preparation and characterization of trace ele

18、ments-multidoped injectable biomimetic materials for minimally invasive treatment of osteoporotic bone trauma. J Biomed Mater Res A 2010 Sep 28. Epub ahead of print10.Yang F, Zhao SF, Zhang F, FMHe, Yang GL. Simvastatin-loaded porous implant surfaces stimulate pre-osteoblasts differentiation: an in

19、vitro study. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2010 (in press)11.Mundy G, Garrett R, Harris S, Chan J, Chen D, Rossini G, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science 1999;286(5446):1946-1949.12.Horiuchi N, Maeda T. Statins and bone metabolism. Oral

20、 Dis 2006;12(2):85-101.13.Hang F, Barber AH. Nano-mechanical properties of individual mineralized collagen fibrils from bone tissue. J R Soc Interface. 2010 Oct 20. Epub ahead of print（三）项目主要研究开发内容、技术关键及主要创新点主要研究开发内容： 拟研制一种具有骨靶向的三维多孔微结构骨充填材料，该材料的三维多孔微结构有利于新骨形成、血管化及材料的降解，材料的多孔微结构内部装载有骨靶向药物辛伐他汀可促进骨形成细

21、胞形成新骨，混合于材料中的胶原在接触盐水或血液后可将材料任意塑形，同时在新骨逐渐替代该材料的过程中恢复骨缺损的基本形态。技术关键： 控制制备球形CPC的直径、孔径、内连接径等三维多孔微结构，通过细胞学和动物实验进行验证和优选三维多孔微结构； 选择合适的CPC和胶原合成比、最佳的辛伐他汀吸附量，使材料的可塑性、促骨形成效果更好。主要创新点： 利用CPC、辛伐他汀和胶原制备可塑性、具有骨靶向的人工骨充填材料，新骨形成的 同时完全取代人工骨充填材料。 CPC内部多孔结构有利于骨形成细胞的吸附、血管的长入和降解，CPC作为辛伐他汀的缓释载体随着材料的降解可释放出药物促进新骨形成，胶原的凝胶性有利于材料

22、 的塑形。（四）项目预期目标（主要技术经济指标、社会效益、技术应用和产业化前景以及获取自主知识产权的情况）主要技术指标：（1）制备适合成骨的球形CPC多孔微结构、合适的CPC/胶原合成比、最佳的药物吸附量；（2）生物学评价验证新骨形成后取代人工骨充填材料，并基本恢复骨缺损的形态。社会效益等：项目完成后有望获得国家发明专利一项，为今后开发具有自主知识产权的人工骨充填材料提供技术保障，即提供一种具有骨靶向的人工骨充填材料的制备技术。该材料既可以解决牙槽骨缺损需要种植患者的植骨问题，还可以解决先天性腭裂等患者牙槽骨缺损的治疗。预计可以为这些患者减轻30-50的植骨费用。（五）项目实施方案、技术路线、

23、组织方式与课题分解项目实施方案第一部分 骨靶向人工骨充填材料的合成和理化性能检测骨靶向人工骨充填材料的合成在搅拌条件下向含有NaH2PO4-Na2HPO4溶液内添加含侧链羧基的链式聚合物聚电解质分子，并向溶液中加入含SiO32-、Sr2+和Mg2+的无机盐溶液，得到混合溶液，控制混合溶液中聚合物的浓度为810 M；Si:P、Mg:Ca 和Sr:Ca的摩尔比分别为10:100、(610):100和(610):100，调节混合溶液的pH值为5.055.20。然后将上述溶液置入60oC水浴并持续机械搅拌，并向其中滴加Ca(AC)2溶液，待出含多种微量元素的CPC微球颗粒，陈化180 min以上后进行

24、固液分离、去离子水和无水乙醇洗涤沉积物，最后干燥，从而得到微球材料。在制备过程中通过改变搅拌速度可以调节微球颗粒直径。将不同直径的CPC浸入含0.1-1.0 M辛伐他汀的乙醇溶液中48h，取出后干燥；最后与胶原按一定的比例进行自组装，备用。骨靶向人工骨充填材料的理化性能检测抗压强度：将材料制成8 mm 12 mm的圆柱体, 在37、100%湿度环境中进行固化, 24h后取出样本, 在力学实验机上测试样本压缩强度, 测试5个样本, 取平均值。晶体结构：将材料置于37、100%湿度下4周, 然后以丙酮浸泡1 h, 真空干燥, 傅立叶变换红外线( fourier transform infrared

25、, FTIR) 分析PCHC的化学结构。采用X线衍射(X raydifferaction, XRD) 分析仪测试化学成分。孔隙率检测：参照国家标准GB/T19661996(多孔陶瓷显气孔率、容重实验分析)测试材料的显气孔率；结合采用直接称重体积计算法测定多孔磷酸钙陶瓷的孔隙率。扫描电镜观察：取材料固化产物, 真空干燥后浸入液氮中冷冻, 低温下制造断裂面, 再次干燥后表面喷金, 电镜下直接观察孔形态、结构、孔径和孔的贯通性。抗溃散性：将成型好的磷酸钙立即浸泡到37 的去离子水中，置于恒温摇床中在37 下以180r/ min 的速率摇动。用相机拍照0 、5 、10 、30 和60min 时样品的形

26、貌和浸泡液的浑浊程度。辛伐他汀吸附量：通过高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定不同时间释放的辛伐他汀量。第二部分 骨靶向人工骨充填材料的生物相容性检测将材料制成5mm 2 mm的圆柱体，浸于pH=7.5，含10胎牛血清的DMEM培养液中，10d后取上清为100的PCHC浸提液。采用骨髓基质细胞，使用活细胞增殖率测定法(MTT法)检测PCHC的细胞毒性。将上述的骨充填材料与骨髓基质细胞共培养8天，通过扫描电镜观察细胞在材料孔隙中的粘附情况及生长形态，并检测碱性磷酸酶、骨钙素、I型胶原等成骨活性因子，最终确定合适的直径、孔径、

27、内连接径等微结构，以及CPC/胶原合成比，辛伐他汀吸附量。第三部分 骨靶向人工骨充填材料的体内植入试验取比格犬12只，拔除双侧前磨牙和第一磨牙，愈合3月后行种植体周骨缺损动物模型。种植体（3.38mm）常规备洞，在种植体颊侧制备443 mm骨缺损模型。对照组为自体骨充填组、球形CPC充填组、胶原充填组，实验组分为优化的人工骨材料充填组。充填后均用生物膜覆盖。术后4、16、24周分批取材。硬组织切片观察种植体周骨缺损新骨形成情况；免疫组织化学观察与成骨密切相关的碱性磷酸酶、骨钙素、型胶原的表达量；Micro CT观察新骨与周围骨组织的结合情况；背散射扫描电镜观察人工充填材料的吸收速率和新骨形成速

28、率。技术路线研制具有骨靶向三维多级孔微结构人工骨充填材料生物相容性检测完成骨靶向人工骨充填材料的研制种植体周骨缺损植入实验相关理化性能检测抗压强度、晶体结构分析、孔隙率检测、扫描电镜观察、抗溃散性、测定辛伐他汀吸附量MTT法检测细胞毒性、细胞实验硬组织切片、免疫组织化学、Micro CT、背散射扫描电镜观察种植体周骨缺损新骨形成组织方式与课题分解 本项目由口腔临床医学与口腔材料方面学者、生物医用纳米材料方面专家、口腔植入材料企业研发部联合组成的产、学、研联合的跨学科研究小组。该项目结合了高校的基础研发优势、临床医疗优势和企业的产品开发、精密加工等优势，具有能力和优势互补的作用。医院负责人工骨充

29、填材料的设计并通过细胞学和动物试验，来论证和优选三维多孔微结构。医用口腔纳米材料研究者负责人工骨充填材料的制备和表征。企业负责人工骨充填产品的试制、加工等。 （六）计划进度安排2011年6月2012年6月 人工骨充填材料的试制、加工选择适合成骨的材料直径、孔径、内连接径等微结构；通过细胞学实验进行生物相容性检测，论证和优选三维多孔微结构、CPC/胶原合成比、最佳辛伐他汀吸附量；发表论文；2012年7月2013年7月 比格犬拔牙；种植体周骨缺损动物模型；硬组织切片、免疫组织化学、Micro CT、背散射扫描电镜观察种植体周骨缺损新骨形成情况；发表论文；2013年8月2013年12月 整理资料，申

30、请专利，结题。（七）现有工作基础和条件1.工作基础申请小组在种植体开发、种植体表面处理有较突出的研究基础，先后申请到国家自然科学基金3项，发表SCI的论文十余篇，申请人作为主要参与人在浙江科技厅的资助下研制开发了国产种植体，现在上海九院等医院进行临床验证。合作者所在的浙江加州国际纳米技术研究院在磷酸八钙纳米晶材料生长、跨尺度自组装、微创治疗材料研究方面发表了多篇重要研究论文，并申报国家发明专利。参加课题的医疗器械有限公司是经过国家批准的具有第三类植入性医疗器械生产资格的专业医疗器械公司，一直致力于口腔种植体材料的设计、开发及生产，是浙江省一家集口腔材料研制、开发及生产、经营于一体的高新技术企业

31、。2.申请人的工作基础主治医师，博士。研究方向为种植体的表面粗化、表面HA沉积、基因涂层以及种植体的临床开发、人工骨充填材料的研制，已发表十几篇有关种植体方面的SCI论文，国家发明专利1项，先后申请到国家自然基金1项，教育部博士点新教师基金1项，浙江省医药卫生优秀青年科技人才专项科研基金1项，浙江省中医药科学研究基金1项。3.申请人发表的主要论文（1）In vivo evaluation of bone-bonding ability of RGD-coated porous implant using layer-by-layer electrostatic self-assembly. J

32、 Biomed Mater Res A. J Biomed Mater Res A 2009;90(1):175-85. (SCI，2.816)（2）Enhanced initial adhesion of osteoblast-like cells on an anatase-structured titania surface formed by H2O2/HCl solution and heat treatment. Dent Mater 2009;25(4):473-80. (SCI，3.459)（3）Bone responses to titanium implants surface-roughened by sandblasted and double etched treatments in a rabbit model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2008;106(4):516-24. (SCI，1.499)（4）Effect of H2