大豆根瘤菌的筛选及分离鉴定.docx

1、大豆根瘤菌的筛选及分离鉴定大豆根瘤菌的筛选及分子鉴定韩孝强（天津农学院 农学系）1 前言根瘤菌是可以与豆科植物共生形成根瘤，将空气中的氮还原成氨，提供植物营养并能促使植物异常增生的一类革兰氏阴性菌。如根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞，称为类菌体1。常制成细菌制剂即一种生物肥料在田间施用，作为作物或牧草增产的一种手段。美国、澳大利亚、新西兰、日本、意大利、奥地利、加拿大、法国、荷兰、芬兰、泰国、韩国、印度及非洲的一些国家，至少有70多个国家研究、生产和应用豆科根瘤菌，不仅面积不断扩大，而且应用的豆科植物种类也日益繁多。在美国、巴西等大豆种植的

2、主要国家，根瘤菌接种率达到95%以上2。世界各国一直在研究与豆科作物及其品种相匹配的优良根瘤菌生产用菌株，根瘤菌剂产品在稳步提高3。我国微生物肥料的研究始于20世纪40年代，其研究与应用已有几十年的历史，在我国的农业生产中起了非常重要的作用。最早研究应用的是根瘤菌制剂，代表和奠基人有张宪武先生、陈华癸院士和樊庆笙先生等4。众所周知，大豆是富含蛋白质的一种作物，构成蛋白质的主要元素就是氮，而空气有80%都是由氮气组成的，根瘤菌正是利用了这种最廉价的原料来满足了大豆生长过程中氮元素的需要 5。而且根瘤菌产生的氨态氮没有环境污染，吸收率相当高，使用过程中没有氮流失，而人工施用化学氮肥流失率往往大于5

3、0%，且氮肥为产酸肥料，施用后会造成土壤酸化问题6。因此使用了根瘤菌后可以不施或大量减少化学氮肥的用量，在显著提高亩产量的同时还能减少因使用化肥对土壤结构造成的破坏和对水源的污染，节省能源、改良土壤、实现可持续发展的目标7。传统的微生物系统分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定8。但近几十年来，随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展，给传统微生物分类鉴定带来了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中己得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定9。细菌含有3种不同的RNA，即mRNA、r

4、RNA和tRNA。它们分别行使着不同的功能，其中rRNA可将遗传信息得以表达，转译成蛋白质，它在所有细菌中都有一定的碱基序列和空间结构。不同种类的细菌，rRNA在不同位点上的序列改变频率也不同。因此，这些分子可作为种系标记物用以鉴别不同的细菌。原核生物的核糖体由50S和30S两个亚基组成，而30S亚基又包含3种类型的rRNA，即23S、16S和5S rRNA，它们分别含有约2900、1500和120个核苷酸。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析也较困难10。16S rRNA为核糖体小亚基中的的RN

5、A，而16S rDNA为编码该亚基RNA的基因。从上世纪70年代以来，科学家们因16S rRNA的保守性，对其进行了大量研究工作，现在已对16S rDNA序列有了清晰的认识11。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因,长度约为1500 bp，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，其序列包含10个可变区(variable region)和与之相间的11个恒定区(constant region)，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，是生物的种属鉴定和系统发育的重要分子基础。目前，rRNA分子己经成为一个分子指标，广泛地应用于各种微生物

6、的遗传特征和分子差异的研究，加上大量已知微生物的DNA都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。从而精确地揭示了微生物种类和遗传特征的多样性12。近几年来，我国的微生物肥料生产发展较快，但在生产应用中反映出一些问题，如有的菌种质量不好，肥效不高，微生物肥料的品种也不多13。发展微生物肥料，重要的一个方向是要应用现代生物技术筛选出高效、抗逆、强竞争存活能力的菌株，以适应微生物肥料发展的需要14。本文先从未喷洒，喷洒国产和喷洒加拿大菌剂后的三种大豆根的根瘤中分离出革兰氏阴性菌株，再利

7、用16S rDNA分子鉴定筛选出慢生型大豆根瘤菌，与原菌剂中的菌株比较同源性，验证该菌株是原菌剂中的根瘤菌，从而证明该菌株可以引起大豆根结瘤。2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 大豆根大豆根1：未喷洒任何根瘤菌剂所生长的大豆根。大豆根2：喷洒国产根瘤菌剂所生长的大豆根。大豆根3：喷洒加拿大根瘤菌剂所生长的大豆根。三种大豆根均来自黑龙江九三试验田。2.1.2 培养基 YEM培养基：甘露醇10 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO47H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，酵母粉0.4 g，蒸馏水1 L，pH 6.8，121 灭菌30 min。2.1.3 主要试剂2.1.3.1 主要试剂

8、盒细菌基因组提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，试剂盒组成为：Buffer GTL，Buffer GL，Buffer GW1，Buffer GW2，Buffer GE。2.1.3.2 主要试剂及其配制结晶紫染液：结晶紫1 g，95%乙醇20 mL，1%草酸铵水溶液80 mL；将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混和。路哥氏碘液：碘片1 g，碘化钾2 g，蒸馏水300 mL；将碘与碘化钾先进行混和，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。沙黄复染色液：沙黄0.25 g，95%的乙醇10 mL，将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释至100 mL。0.5 mol/

9、L EDTA： 称取186.1 g Na2EDTA2H2O，置于1 L烧杯中，加入约800 mL的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节pH值至8.0（约20 g NaOH，pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解），加去离子水将溶液定容至1 L，适量分成小份后，高温高压灭菌，室温保存。冷无水乙醇：将无水乙醇置于-20 保存。 TAE电泳缓冲液：（1）50贮存液：Tris碱24.2 g；冰醋酸5.71 mL；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），10 mL；加60 mL蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸馏水至100 mL，浓盐酸调pH至8.0。（2）1工作液：将以上贮存液用蒸馏水稀释50倍。做电泳缓冲液

10、。 50%甘油：取甘油和蒸馏水等比例混合，121 灭菌20 min备用。goldviewTM核酸染料：用量筒量取350 mL 1TAE，加入100 L goldviewTM，混合均匀后，妥善保存。2.1.3.3 其他试剂Taq酶、10Buffer、dNTPs、Marker DM2000等购自北京康为世纪生物科技有限公司。PCR扩增的引物购自华大基因。电泳所用Loading Dye购自东洋纺生物科技有限公司。2.1.4 主要仪器 FA2004电子天平上海精科天平TGL-16G高速台式离心机上海安亭科学仪器公司BCM-1000A生物洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司XW-80A涡旋混合器江苏海门市

11、其林贝尔仪器制造有限公司MCO-15A CO2 培养箱SANYO Electric Co.Ltd.可调试移液器热电（上海）仪器有限公司Motic Digital Microscope OlipusHNY-2102 INCUBATOR SHAKER天津市欧诺仪器仪表有限公司DYY-2C型电泳仪北京六一仪器厂130XUN型立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂多用全封闭电炉河北省黄骅市振兴电器仪器厂WD-9403F紫外仪北京六一仪器厂BCD-241WE/Y冰箱青岛海尔特种电冰箱有限公司HH-Z4型恒温水浴锅郑州长城科工贸有限公司Tgradient梯度PCR仪德国Biometra公司MG-

12、5005D微波炉天津乐金电子电器有限公司KYC 100C INCUBATOR SHAKER上海福玛实验设备有限公司2.2 实验方法2.2.1 大豆根根瘤预处理2.2.1.1 大豆根预处理先将取回的大豆根于清水中浸泡数分钟，使根部泥土松动。在水中轻轻摇晃。依次重复3次，直到根部泥土清理干净为止。然后室温晾干，拍照，比对。2.2.1.2 根瘤的处理剪取较大的根瘤。剪取根瘤时注意将根瘤所在的根部0.5cm左右一同剪取。（防止根瘤与根的连接部位污染）。将剪取的根瘤在清水中冲洗3-4次去除缝隙中的泥土，在超净工作台内再用70%酒精擦洗，并在其中浸泡3分钟，用无菌水冲洗，除去表面的酒精。用灭过菌的镊子轻轻

13、取下根瘤，灭过菌的小刀将根瘤切开。切面贴于固体YEN培养基上，并划线。2.2.2 根瘤菌的纯化和形态观察2.2.2.1 根瘤菌剂中菌株的纯化和菌落形态观察依据上述方法依次处理三种根瘤。每种根瘤取一个完整根瘤放于YEM培养基上作为阴性对照。将平板倒置与30恒温培养。每12h观察一次。待长出单菌落后，挑取单菌落与新的YEM培养基上分区划线。重复该步骤，知道平板上出现的菌落形态单一为止。观察出现单菌落的形态。从大豆根1中分离出的单菌记为c11，c12，c13，c14，c15，从大豆根2的根瘤中分离出的单菌记为A12，A14，从大豆根3的根瘤中分离出的单菌记为c21，c22，c23。2.2.2.2 革

14、兰氏染色制片：在干净的载玻片上滴一滴无菌水，用灭菌的接种环挑取培养物少许，置载玻片的水滴中与水混合成悬液；固定：在酒精灯火焰外层快速地来回通过34次，完全干燥；染色：结晶紫染色1 min后水洗；媒染：加路哥氏碘液作用1 min后水洗、吸干残液；脱色：用95%乙醇脱色直至滴加的酒精不成紫色为止；水洗：用水滴洗去乙醇，吸干残液；复染：加0.5%的番红染色液染色1030 s后，用自来水冲洗；干燥后置于显微镜下观察染，显现紫色的为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。为了使实验结果更可靠，将大肠杆菌（革兰氏阴性菌）、慢生大豆根瘤菌以及枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）制片于同一载玻片上，进行以上操作。选取最后的革兰

15、氏阴性细菌进行一下步骤。2.2.3 纯化菌株基因组的提取取2.2.2.3中革兰氏阴性菌株的培养物少许分别接种在YEM的液体试管中。置于30 ，150 rpm摇床培养，至培养液混浊。按照基因组提取试剂盒中操作说明提取选取的革兰氏阴性菌株。革兰氏阴性菌提取基因组的步骤：对以上培养液进行镜检，确定无杂菌后取适量的菌液加入1.5 mL离心管中离心，7500 rpm，10 min。尽量除净上清液。向离心管中加入200 L的蛋白酶K，涡旋混匀。56 水浴至菌体完全裂解。期间每隔一段时间颠倒混匀。涡旋震荡15 s，向其加入200 L的Buffer GL，涡旋振荡混匀，再加入200L无水冰乙醇，涡旋混匀。将中

16、所得的全部溶液转移到Spin Column DM中（Spin Column DM已经放入Collection Tube中）。8000 rpm离心1分钟，弃去废液，将Spin Column DM放回Collection Tube中。加入500 L的Buffer GW1，8000 rpm离心1分钟，弃去废液。加入500 L的Buffer GW2，14000 rpm离心1分钟，弃去废液。14000 rpm离心2分钟，弃去废液。将Spin Column DM置于室温数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的Buffer GW2。将Spin Column DM转入一个新的离心管中，向膜的中间部位悬空滴加50200

17、 L的Buffer GE或者无菌水。室温放置15分钟，8000 rpm离心1分钟，将溶液收集到离心管中。-20 中保存备用。2.2.4 提取的基因组电泳将上述所得的DNA进行电泳：取5 L DNA溶液，加1 L Loading Dye，混匀，混合液上样于1.0%琼脂糖凝胶上。DM2000作为Marker，上样5 L。1TAE 电泳缓冲液中进行电泳：50 V电压，100 mA电流，电泳50 min。电泳结束后于含GoldviewTMDNA染料的染液中浸泡20 min，然后放在紫外仪上，用透射光观察结果并照相。2.2.5 PCR扩增基因组的16s rDNA2.2.5.1 PCR扩增所用引物Uppe

18、r(27F)5-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3Lower(1541R)5-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-32.2.5.2 PCR扩增体系表1PCR反应体系组分实验组（L）阴性对照（L）操作说明10Buffer55按顺序加入薄壁管，冰上操作，下同2.5 mmol/L dNTP44DNA模板1根据电泳后DNA的浓度决定模板量 27F11 1541R11Taq酶0.250.25ddH2O37.7538.75总体系50502.2.5.3 PCR扩增程序预变性：94 5 min变性： 94 45 s 退火： 55 45 s 30个循环延伸： 72 90

19、 s补平： 72 10 min扩增完后，4保存。2.2.5.4 PCR扩增产物电泳将上述所得的扩增产物进行电泳：取5 L DNA溶液，加1 L Loading Dye，混匀，混合液上样于1.0%琼脂糖凝胶上。DM2000作为Marker，上样5 L。1TAE 电泳缓冲液中进行电泳：50 V电压，100 mA电流，电泳50 min。电泳结束后于含GoldviewTMDNA染料的染液中浸泡1520 min，然后放在紫外仪上，用透射光观察结果并照相。2.2.5.5 16S rDNA测序DNA序列的测定由北京华大生物科技有限公司完成。2.2.6 纯化菌株的系统发育分析GeneTool-Lite：Gen

20、eTool是对DNA序列进行综合操作的软件。如可进行DNA同源比较，DNA序列拼接等。Clustalx1.83：Clustalx是CLUSTAL多重序列比对程序的Windows版本。Clustalx为进行多重序列和轮廓比对和分析结果提供一个整体的环境。MEGA 3.1：MEGA3.1是一个关于序列分析以及比较统计的工具包，其中包括有距离建树法和MP建树法；可自动或手动进行序列比对，推断进化树，估算分子进化率，进行进化假设测验，还能联机的Web数据库检索。下载后可以直接使用。利用GeneTool-Lite将从测序公司拿到的序列结果导出，并进行适当调整。将得到的16S rDNA的序列与GenBan

21、k/EMBL/DDBJ数据库中的相关菌的16S rDNA用Clustalx1.83进行比对分析，分析各序列间的相似性；利用MEGA3.0分析不同菌株的16S rDNA之间的进化距离，并利用MEGA3.1构建系统进化树。3 结果与分析3.1 大豆根的预处理 按照实验方法2.2.1.1所述处理三种大豆根，拍照如下图1为大豆根1：未喷洒任何根瘤菌剂所生长的大豆根。图2为大豆根2：喷洒国产根瘤菌剂所生长的大豆根。图3大豆根3：喷洒加拿大根瘤菌剂所生长的大豆根。 由三种大豆根的实物图发现：未施加根瘤菌菌剂的大豆根较细小，根瘤较小但多，喷洒加拿大根瘤菌菌剂的大豆根生长最粗且根瘤较大。喷洒国产菌剂的大豆根比

22、未喷洒的粗，但比喷洒加拿大根瘤菌剂的大豆根细，且根瘤较小。3.2 根瘤菌的分离纯化如上材料和方法中所述，用灭过菌的镊子轻轻取下根瘤，灭过菌的小刀将根瘤切开。切面贴于固体YEN培养基上，并划线，30 倒置恒温培养。待长出单菌落后，重复操作2-3次，直至出现的单菌落形态均一。如图5图6图7分别为三种根瘤切面划线培养四天时的实物图。3.2.1 大豆根1的根瘤中分离纯化菌株的形态观察按照上述方法从大豆根1的根瘤中分离出的菌株c11在YEM培养基平板上的菌落形态见图7：菌落圆形、边缘平整、颜色为米黄色、正反颜色一致、表面光滑湿润、低凸、呈油脂状。 将大肠杆菌、c11和枯草芽孢杆菌分别制片于同一张载玻片上

23、的三个不同位置，同时进行革兰氏染色的操作，然后置于显微镜下观察。c11的染色情况如图8所示。大肠杆菌为红色是革兰氏阴性菌，枯草芽孢杆菌为紫色是革兰氏阳性菌，c11是紫色为革兰氏阳性菌细胞呈短杆状。分离出的菌株c12在YEM培养基上的菌落形态见图9：圆形，边缘平整，颜色乳白、正反颜色一致，表面湿润光滑，菌落突起成垫状。革兰氏染色结果如图10所示，c12也是革兰氏阳性菌细胞呈短杆状。 分离出的菌株c13在YEM培养基上的菌落形态见图11所示：圆形，边缘呈裂叶状，颜色乳白、正反颜色一致，表面湿润光滑，菌落突起成垫状。革兰氏染色如图12所示，c13为革兰氏阴性菌株细胞呈短杆状。 分离出的菌株c14在Y

24、EM培养基上的菌落形态见图13所示：圆形，边缘整齐，半透明，表面湿润光滑，菌落突起成垫状。革兰氏染色如图14所示，c14为革兰氏阴性菌株，细胞呈短杆状。 分离出的菌株c15在YEM培养基上的菌落形态见图15所示：圆形，中间呈乳白色，边缘整齐且呈半透明，表面湿润光滑，菌落突起成垫状。革兰氏染色如图16所示，c15为革兰氏阴性菌株，细胞呈短杆状。3.2.2 从大豆根2中分离纯化菌株的形态观察按照实验方法中所述，从大豆根2中分离出菌落形态不同于c1类的单菌。标记为A1类菌株。第一次从大豆根2的根瘤中分离出的菌A11发现其菌落形态不单一，再次挑取单菌落与新的固体YEM培养基平板上分区划线，获得两种单菌

25、落，分别命名为A12，A14。如图17为A12在YEM平板上的菌落形态：菌落呈小圆球状、边缘平整、颜色为乳白色、正反颜色一致、表面光滑湿润、低凸，呈油脂状，菌落直径较小：0.5 mm。图18为革兰氏染色结果：A12为革兰氏阴性菌株，细胞呈长杆状。下图19为菌株A14在YEM培养基上的菌落形态：与A12相似，菌落呈小球形、边缘平整、呈乳白色、正反颜色一致、表面光滑湿润、低凸，呈油脂状，菌落比A12大，但直径也0.5 mm，YEM平板上生长周期为6d。挑取A14单菌落进行革兰氏染色，结果为红色，为革兰氏阴性菌株。由于革兰氏染色后细胞形态不易观察，进行结晶紫染色观察细胞形态，结果如图20所示：细胞呈

26、杆状，两头尖。3.2.3 从大豆根3中分离纯化菌株的形态观察按照实验方法中所述，从大豆根3中分离出菌落形态不同于c1类的单菌。标记为c2类菌株。下图21为c21在YEM培养基上的菌落形态：菌落呈圆形，光滑，凸起，边缘整齐，半透明，闪光。图22为革兰氏染色结果：细胞呈红色，为革兰氏阴性菌株。 分离出的另一种菌株c22在YEM培养基上的菌落形态如下图23：菌落呈不规则状，褶皱，扩展，边缘锯齿状，无光泽，白色不透明。图24为c22革兰氏染色结果：细胞染成紫色，为革兰氏阳性菌株。从大豆根3分离出不同于c1类的另一种菌命名为c23。c23在YEM培养基上的菌落形态如图25所示：菌落呈小球形，光滑，凸起，

27、边缘整齐，乳白，闪光，菌落直径0.5 mm，YEM平板上生长周期为7d。对其进行革兰氏染色，发现该菌为革兰氏阴性菌，但革兰氏染色后细胞形态不是很清晰。用结晶紫染色观察细胞形态如图26所示：细胞呈短杆状。3.2.4 分离菌株整理分析从未喷洒根瘤菌剂的大豆根中分离出的菌株有c11、c12、c13、c14、c15。其中c11、c12为革兰氏阳性菌株，c13、c14、c15为革兰氏阴性菌株。从喷洒国产根瘤菌剂的大豆根中分离出的菌株有A12、A14，均为革兰氏阴性菌株。该大豆根的根瘤中还含有c11、c12、c13、c14。其中c11和c14菌落数相对较多，c12和c13较少。从喷洒加拿大根瘤菌剂的大豆根

28、中分离出的菌株有c21、c22、c23。其中c21和c23为革兰氏阴性菌株，c22为革兰氏阳性菌株。该大豆根的根瘤中还含有c11、c12、c14。其中c11菌落数较少，c12和c14较多。如表2所示。表2大豆根中分离的菌株大豆根种类未施加根瘤菌剂施加国产根瘤菌剂施加加拿大根瘤菌剂筛选到的菌株G+c11、c12c11、c12c11、c12、c22G-c13、c14、c15c13、c14、A12、A14c14、c21、c233.3 菌株基因组的提取和16S rDNA扩增3.3.1 菌株基因组的提取选取上述筛选到的革兰氏阴性菌株，按照基因组提取试剂盒中革兰氏阴性菌基因组提取的步骤提取基因组，电泳检验

29、实验结果见图27所示：由图看出DNA条带清晰，DNA的量也足够下一步的实验用量。A1.2孔下面小片段的拖尾可能是其中的DNA有所降解，但不影响后续实验。3.3.2 16S rDNA的PCR扩增按照材料和方法中PCR扩增的程序和体系进行16S rDNA的扩增，扩增结束后对产物进行电泳，结果见图28。 图中样品的条带清晰，大小在1600 bp左右，符合16S rDNA的大小范围，说明PCR的产物没有问题，可以进行下一步的测序。3.4 测序和16S rDNA的系统进化分析3.4.1 序列的导出与拼接测序结果以四个文件的形式返回，包括从5和3端分别测序的结果，并以ABL和SEQ格式储存。用软件chro

30、mas.exe打开ABL格式文件可以看到测序结果的峰形图。依据峰图分析测序结果，并对其进行校正。在此只给出菌株c23的峰形图（图29）。点击工具栏中的File，再点击菜单栏中的“Export”，命名后以FASTA格式导出文件。由上下游引物分别测得的序列依次导出后，通过genetool-lite将它们拼接起来。首先打开刚才保存的FASTA格式的文件，将其转化成为genetool-lite能操作的bti格式的文件。然后在“Assembly Editor”选项中分别载入两个bti文件，点击“Assembly”就会拼接出整个16S rDNA的序列，并将其以bta的格式保存。最后在“Sequence E

31、dit”选项中将bta格式的文件打开就可看到全序列。对其进行blast比对发现，c23和A14为慢生型大豆根瘤菌。之后对这两种菌株进行进化分析。如图30为c23的16S rDNA全序列。图31为A14的16S rDNA全序列。3.4.2 BLAST比对打开Gene Bank的BLAST网页，选择nucleotide blast，在Enter Query Sequence中输入菌株的16S rDNA序列，然后在Choose Search Set中选择“Others（nr.etc）”，最后在网页的底部点击“BLAST”键，即可出现比对结果，如图32。从比对结果中选择10株左右的菌制作系统进化树。选菌的原则是同源性尽可能高，并兼顾到不同的种。依据这样的原则得到如表3