生化分离工程.docx

1、生化分离工程生化分离工程复习资料第一章 绪论1.生化分离工程的定义：为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程 (Downstream Processing)。（生化物质主要包括氨基酸、蛋白质、多糖、核酸、抗生素、肽类物质、脂质和其他生化产品，其主要来源包括微生物、动物、植物和海洋生物等生物原料或者基因工程产物。）2.生物分离技术在整个生物加工过程中的重要性可以从三个方面加以体现：第一， 生物产物的特殊性； 产物稳定性差(a 化学降解(pH , 温度); b 微生物降解 （酶作用

2、，染菌）生物活性物质的稳定性差，对PH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，易失活、变性 分批操作，生物变异性大第二， 生物产物所处环境的复杂性； 组分复杂(a 大分子;b 小分子;c 可溶物;d 不可溶物;e 化学添加物除了产物外，还含有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等；产物浓度低的水溶液 (原因：a 氧传递限制；b 细胞量;c 产物抑制 )第三， 对生物产品要求的严格性； 质量要求高 （药品或食品）含目的产物的初始物料组成复杂，生化产品种类繁多，包括了大、中、小分子量的结构和性质复杂又各异的生物活性物质；生化产品的应用面广，许多产品用作医药、食品、试剂等，对含量和

3、纯度要求高等。 从而导致下游加工过程度成本往往占整个生物加工过程生产成本的大部分。（教材中列出了若干生物制品生产过程中分离过程的成本）因此，下游加工过程的成本往往决定 整个生物加工过程的成败，设计合理的下游加工过程可大大降低目标产品的生产成本，实现更大规模上的商业生产。评价生化物质分离纯化技术的标准是纯度、收率和成本等三个因素，应从这三个方面进行综合考虑和优化才能决定最佳工艺技术。3.下游加工技术的一般流程参照教材第3页图1.1强调如下几点：第一， 流程图包括了本课程所涉及的大部分教学内容；第二，一个目标产物的获得需要进行多步处理，这样导致总收率的降低。得出结论：选择恰当的分离技术至关重要。4

4、.分离技术的选择依据第一， 产物所处的位置；物料组成（组成中杂质、目标组分的量，是否有必须去除的物质）；第二， 产物性质分子大小、疏水性、稳定性（目标产物稳定性，杂质稳定性）、电荷形式和溶解度、功能团、挥发性等；产品形式 ：固体 适当结晶， 液体，适当浓缩；危害性：过程保护性分离；第三， 生物加工过程自身的规模（越大所选用的设备不同，如凝胶层析不能规模过大）和产品的商业价值产品规格 （注射，非注射）（标准、吸收等）；一种目标产物的分离手段往往不止一种，根据生产的规模和价值，选择合适的分离技术。第四， 步骤少(回收率高，如每次的损失90%，多次损失越多；避免相同原理的分离技术多次重复出现；减少新

5、化合物进入)；第五， 次序合理(先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本)（考虑的是损失率，成本等）；第六， 清洁生产：废水处理，如甲壳素的生产会产生许多强酸碱，酶法分离；废气；废渣。5.生物下游加工过程的特点 生物下游加工过程的特点是由蛋白质的特性所决定的，可以概括为“五项要求”： 第一，满足维持生物物质活性的要求 生物物质的生理活性大多是在生物体内的温和条件下维持并发挥作用，当遇到高温，pH的改变以及某些化学药物存在等周围环境的急剧变化时极不稳定，容易发生生物活性的降低甚至丧失。因此，生产过程对分离纯化过程的操作条件有严格的限制。第二，满足快速分离的要

6、求原料液中常存在降解目标产物的杂质，如可水解目标蛋白的蛋白酶。因此，要求采用快速的分离纯化方法除去影响目标产物稳定性的杂质。第三，满足纯度和杂质去除的要求根据目标产物的使用目的，完全除去妨碍其功能发挥的杂质，但不像电子材料和无机材料那样要求非常高的纯度。 第四，满足高效分离的要求原料液中常存在与目标分子在结构、构成成分等理化性质上极为相似的分子异构体，形成用常法难于分离的混合物。因此，一般要求利用特殊的高效分离技术纯化目标产物。第五，满足成本优化的要求原料液中目标产物的浓度一般都很低，有时甚至是极微量的，这样就有必要对原料液进行高度浓缩，从而使下游加工过程的成本显著增大。6.分离机理与分离操作

7、对于一个待分离的原料，一般利用原料中目标产物与共存杂质之间在物理、化学以及生物性质上的差异，使其在分离操作中具有不同的传质速率或平衡状态，从而达到分离目标产物的目的。 因此，常用的分离技术是基于物理性质力学性质重力、离心力、筛分热力学性质状态变化、相平衡传质性质粘度、扩散、热扩散电磁性质电泳、电渗、磁化化学性质化学热力学化学平衡反应动力学反应速率光化学性质激光激发、离子化生物学性质分子识别生物亲和作用、生物学识别输送性质生物膜输送反应、响应、控制免疫系统7.根据生物分离过程原理机械分离对象：非均相物系，原理：根据物质大小、密度的差异进行分离过滤重力沉降离心沉降传质分离对象：均相物系；输送分离原

8、理：根据溶质在外力作用下产生的移动速度的差异实现分离（速度分离法）推动力：压力差、电位梯度和磁场梯度超滤反渗透反渗析电泳和磁泳扩散分离原理：根据溶质在两相中分配平衡状态的差异实现分离（平衡分离法）推动力：偏离平衡态的浓度差蒸馏、蒸发吸收、吸附和离子交换萃取结晶8.分离效率的评价评价一个分离过程的效率主要有三个指标：目标产品的浓缩程度浓缩率：包括产品浓缩率（）和杂质浓缩率（）两种分离纯化程度分离因子：又称分离系数，反映目标产物的纯化程度，用表示获得产物的量回收率第2章 细胞破碎与分离第一部分 细 胞 分 离1.重力沉降是传统化工过程中常用的从含有固体颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作，其是利用流体

9、与颗粒间的密度差，在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。2.提高重力沉降速度的途径由于菌体或动物细胞的尺寸较小，因此虽然利用重力沉降分离细胞比较简单易行，但沉降速度很慢。因此，在实际过程中往往采取某些方法来提高细胞的沉降速度。1. 加入中性盐细胞表面都带有一定的电荷，其在溶液中将形成双电层。当中性盐加入后，细胞表面双电层的排斥电位降低，有利于细胞之间发生凝聚。2. 加入高分子絮凝剂向含有细胞的料液中加入聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝剂，可使细胞之间产生架桥作用而形成较大的凝聚颗粒。3. 引入外力 离心沉降。3.离心沉降定义 离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋转，

10、在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。4.离心沉降理论离心力场中颗粒的沉降速度与重力沉降速度的最大区别在于用离心加速度代替了重力加速度。 S为沉降系数，它是用超速离心的发明人斯维德贝格（Svedberg）来命名，1S10-13s。沉降系数与溶剂的粘度有关，是溶剂物性的函数。5.离心分离法1. 差速离心分级差速离心是生化工业中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作的一种特殊情况，即为一级分级分离。2. 区带离心区带离心是生化研究中的重要分离手段，主要包括差速区带离心和平衡区带离心。下面我们采用

11、对比的方法分析一下两者的特点。区带离心能够进行的前提条件是，在离心管内的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同浓度（密度）的梯度介质（蔗糖等），按照浓度从大到小的原则，依次层层加入。加入离心管中的梯度介质经高速离心或静置后可形成连续的密度梯度。区带离心方法的比较区带离心种类差速区带离心平衡区带离心共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度梯度介质常用蔗糖常用氯化铯密度梯度最大的密度梯度低于最大密度的沉降样品最大的密度梯度大于最大密度的沉降样品区带形成条件根据各个组分沉降系数的差别，形成各自的区带根据各组分密度差形成区带离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平

12、衡的密度区，长时间，高速度6.在工业上比较常用的离心机包括管式和碟式等。管式离心机优点结构简单，转速和离心力较大，分离因子高800015000g缺点沉降面积小、处理能力低；应用液-液分离(连续式)；低固体含量(0.1dm；固体浓度5。碟式离心机优点转子中存在隔板以增大沉降面积，处理能力大缺点结构复杂、转速较低；螺旋卸料沉降离心机优点A、操作温度高300C大；B、处理量大，可达60t/h。缺点分离因子小于6000g，不适合于小颗粒的分离。应用高浓度的大颗粒的固液分离(达50%, 2um-5mm)，如淀粉精制和污水处理。碟式离心机：化学、制药和生化工业应用最广泛特点：A、10-100个锥顶角为60

13、-100的锥形碟片；B、碟片距很短0.5-2.5mm，沉降距离极短，分离效果高；C、碟片多，沉降面积大，增加分离效果；D、抗对流效果高。分类：、人工排渣式应用：A、液-液分离，并含少量固体，B、固-液分离，固相含量小于%，C、澄清操作。优点：A、分离因子达10000g以上，B、特别适合于含少量细颗粒的液液分离。缺点：A、转鼓与碟片之间空隙大，不易发挥离心机的高效分离性能；B、停车清洗，生产效率低，劳动强度大。、喷嘴排渣式应用：多用于cell浓缩，浓缩比在5-20。优点：A、颗粒富积好，B、处理量大，可达300t/h。缺点：A、分离因子5000g，低，不适合于小颗粒的分离；B、富积的颗粒含水量大

14、。C、活塞排渣式应用：多种颗粒的分离(0.1-500m颗粒)，固体含量10%)。7.过滤是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。过滤本身是一种膜分离技术。在分离细胞、菌体或它们的碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是一种常备的分离方法。8.滤饼阻力与滤饼干重W之间存在如下的关系， 其中，为滤饼的平均比阻，m/kg。平均比阻 对于不可压缩的滤饼，为常数。 对于可压缩性滤饼而言，平均比阻为过滤介质两端压力差的函数，可用下式表示， 其中k为时的值；m为可压缩性指数。9.过滤设备1 转鼓真空过滤器应用：大规模生物分离的主要过滤设备，用于较难分离的低黏度发酵液优点：

15、、大规模，、自动化、操作简单，、滤布装卸容易、易保养维护。缺点：、占地大，单位体积利用率低，、周期性中断进料、滤布利用率低，、压力低，仅应用于低黏度发酵。2 带式真空过滤器：应用：大规模分离的主要过滤设备，可分离较难分离的低黏度的发酵液，对滤饼洗涤要求高。 优点：)、发酵液处理量大，滤饼厚达200mm，)、滤饼洗涤容易，效果好，无须搅拌，)、自动化、操作简单，清洗保养容易。缺点：)、占地大，有效过滤面积低，)、压力低，仅应用于低黏度发酵液，)、设备投资高。3 压力系列：带式、板框、加压、气压罐式压滤机。应用：用于很难处理的、高黏度、高细颗粒含量的发酵液的固液分离。优点：、操作压高.Mpa以上，

16、的颗粒含量，高含量的细颗粒，、滤饼含水量低，滤液澄清，、自动化、操作简单，清洗保养容易。缺点：、占地大，有效过滤面积低，、设备投资高，能耗高。第二部分发酵液的预处理1、预处理的原因与目的：原因： 生物工业生产中的培养基和发酵液，由于高黏度、非牛顿性、菌体细小且时压缩，若不经过适当的预处理就很难实现工业规模的过滤，由于菌体自溶释放出的核酸及其他有机物质的存在会造成液体浑浊，即使采用高速离心机也难以分离。还有一些发酵液中，高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）和杂蛋白质较多。高价无机离子的存在，在采用离子交换法提炼时，会影响树脂的交换容量。杂蛋白质的存在，在采用大网格树脂吸附法提炼时，会降低

17、其吸附能力，采用萃取法时容易产生乳化，使两相分离不清，采用过滤法时，过滤速度下降，过滤膜受到污染。发酵液预处理的目的在于增大悬浮液中固体粒子的尺寸，除去高价无机离子和杂蛋白质，降低液体黏度，实现有效分离。悬浮液的基本特性细胞的相对密度与培养液相似可压缩性，粘稠，非牛顿流体，流变学复杂悬浮状态稳定目的： a 改变发酵液物理性质（黏度、大小、密度等）；b 产物转入液相中；c 除去发酵液中部分杂质；针对对象： 高价无机离子和杂蛋白、菌体 2.凝聚和絮凝技术 凝聚：指在中性盐的作用下，由于双电层排斥电位的降低而使胶体体系不稳定的现象。 絮凝：指在某些高分子絮凝剂的存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的

18、絮凝团的过程，是一种以物理集合为主的过程。 混凝：指在料液中，先加入无机电解质，使悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，而后再加入絮凝剂的操作过程，实际上包括了凝聚和絮凝机理的过程。 凝聚值：指使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（ mM ），它用来表示电解质的凝聚能力。 凝聚原理： 通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中的正离子被吸附在其周围，在界面上形成了 双电层，但这些正离子还受到使它们均匀分布开去的运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分：吸附层和扩散层，这样就形成了扩散双电层的结构模型常用的凝聚剂 : Al2(SO

19、4)3.18H2O(明矾)，AlCl3.6H2O,FeCl3,ZnSO4,MgCO3絮聚作用原理： 应用水溶性的有机高分子聚合物絮凝剂，通过静电引力，范德华分子引力和氢键的作用，强烈地吸附在胶粒表面。一个高分子聚合物的许多链接分别吸附在不同颗粒的表面上，产生了架桥连接，生成粗大的絮团。常用絮凝剂的种类： 聚丙烯酰胺（Polyacrylamide ）衍生物： 非离子型： 阴离子型：（含 -COOH ） 阳离子型：（含 -NH2 ） 苯乙烯类衍生物及其无机高分子聚合物絮凝剂 聚合铝盐、聚合铁盐 天然有机高分子絮凝剂 明胶 、海藻酸钠、骨胶、甲壳素、甲酰胺、多聚糖类胶粘物助滤剂：一种颗粒均匀、质地坚

20、硬的粒状物质，用于扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。第三部分 细胞破碎和胞内产物的释放1.细胞破碎的定义：使细胞壁或细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，增大胞膜通透性，使胞内产物获得最大程度的释放 , 便于所需的生化物质的提取和分离的一种操作。本质上这是一种增溶作用，其主要阻力来自于各种微生物细胞壁的结构和组成的差异。细胞破碎机械破碎高压均浆法、珠磨法、撞击破碎、超声波破碎非机械破碎物理法渗透压冲击、冻结-融化、超声波化学法酸碱处理、化学试剂处理生物法酶 溶、自 溶、噬菌体2.常见细胞破碎法1、机械破碎1)、液体剪切法(最常用的方法之一)操作影响因素 操作压力p：

21、p, R;相反, R 。温度 2C /10MPa 。破碎次数N：N，R 。温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。细胞抗破碎系数a：a酵母=2.9，a大肠杆菌 = 2.1。细胞种类：影响k值。细胞浓度：阀门底座：刃缘阀座，平边阀座2)、固体剪切法(珠磨法, c最有效的物理破碎法)影响因素 a) 转盘外缘速度b) 珠粒添量和大小c) 温度 d) 细胞浓度x e) 破碎效率 f) 流量Q：3) 撞击破碎法4) 超声破碎法(1525kHz)影响因素：声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型2. 非机械破碎（1）酸碱处理 通过改变悬浮液的pH值环境，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作

22、用力降低而易于溶解。（2）化学试剂处理a. 增加细胞壁的通透性b. 破坏氢键作用，降低胞内产物之间的相互作用，使之容易释放（3）酶溶 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完整的破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。（4）自溶 通过调节温度、pH值或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶。（5）渗透压冲击法（6）冻结-融化法3.破碎方法的选择选择的一般原则A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎B、提取产物在细胞膜附近，用化学法C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 4.破碎技术杂交研究应注意的问题A、杂交技术可产生很大优势。如

23、：酶法与高压匀浆法相结合处理面包酵母，使总破碎率接近100%，而单独的高压匀浆破碎只有32%B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物的分离纯化。双水相萃取+珠磨；在提取酵母醇脱氢酶时，1.节省萃取设备与时间；2.PEG对酶活有保护作用C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响：在放线菌培养过程中，加入细胞壁形成抑制剂（甘氨酸、蔗糖）。D、菌种的培育，胞内产物 to 胞外产物：基因工程手段引入噬菌体，自裂解；让在酵母中的胞外外表达代替胞内表达。5.基因工程菌培养液的前处理不同表达形式的前处理:胞外分泌型表达: 离心,收集液相浓缩纯化胞内表达：可溶性表达: 离心,收集菌体

24、破碎离心,收集上清-纯化;周质表达(壁膜间的环隙): 离心,收集菌体破碎(低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标产物-离心,收集上清-纯化;不溶性包含体: 离心,收集菌体破碎离心,收集沉淀-纯化包含体洗涤目标蛋白变性溶解复性转化;包含体包含体：高密度（约1.3g/ml)的蛋白质聚集体，0.1-1.0m,至m，随表达产物和表达系统而异。包括目标蛋白、菌体蛋白和质粒编码蛋白等，不溶，无生物活性。通常位于细胞质中，而一些分泌性蛋白质可能在外胞周质中形成。包含体形成原因：目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多的表达产物聚集在细胞内，形成不溶性包含体。第3章 沉淀技术 1.盐析的机理 当向蛋白质溶液

25、中逐渐加入电解质时，开始蛋白质的溶解增大，这是由于蛋白质的活度系数降低的缘故，这种现象称为 盐溶 ；当继续加入电解质时，由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出憎水区域，憎水区域间的相互作用，使蛋白质的溶解度减小，而蛋白质发生聚集而沉淀的现象，称为 盐析 。因而蛋白质的溶解度与离子强度的关系曲线上存在最大值，该最大值在较低的离子强度下出现，在高于此离子强度的范围内，溶解度随盐离子强度的增大迅速降低 可以把盐析机理归纳为如下三点：盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白质表面的水化膜，导致蛋白质溶解

26、度下降；盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。2.用盐析法分离蛋白质时可以有两种方式：在一定的pH及温度条件下，改变盐浓度 ( 即离子强度 ) 达到沉淀的目的，称为Ks盐析 ，常用于蛋白质的粗提。在一定的离子强度下，改变溶液的pH及温度达到沉淀的目的，称为盐析，常用于蛋白质的精制、纯化。 对于特定的蛋白质，在一定的操作条件下，产生沉淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即每一特定的蛋白质均具有一定的蛋白质溶解度曲线 （S-P 曲线）。 蛋白质沉淀的速率开始时十分迅速，以后逐渐变慢，因此从起始沉淀到沉淀结束，形成了具有尖峰的曲线，

27、这就是 蛋白质的盐析分布曲线 。该曲线的峰宽由 Cohn 经验式中的 Ks 决定。而峰在横轴上的位置则由值和蛋白质起始浓度决定。利用不同蛋白质盐析分布曲线在横轴上的位置不同，可采取先后加入不同量无机盐的办法来分级沉淀蛋白质，以达到分离目的。 3.盐析的主要影响因素对于特定的蛋白质，影响蛋白质盐析的主要因素有无机盐的种类、浓度、温度和 pH 值。 A、无机盐种类的影响：在相同的离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同。无机盐的挑选原则：a、较高的盐析效能；b、高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；c、溶解度受温度的影响小；d、盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；e、不易引起蛋白质的变

28、性； f 、价格低廉；B、C、温度和pH 的影响：盐析操作的温度和 pH 是除盐的种类外影响盐析效果的重要参数。D、蛋白质起始浓度的影响：蛋白质起始浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。提高蛋白质起始浓度可减少盐用量。4.等电点沉淀 较低离子强度的溶液中蛋白质的溶解度较小，蛋白质在 pH 为其等电点的溶液中净电荷为零，蛋白质之间静电排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白质在 pH 等于其等电点的溶液中溶解度最低的原理进行沉淀的方法称为 等电点沉淀法 。 5.有机溶剂沉淀 有机溶剂沉淀是指在蛋白质溶液中，加入与水互溶的有机溶剂，显著地减小蛋白质的溶解度而发生沉淀的现象。有机溶剂沉淀法常适用于蛋白质、酶、

29、核酸、多糖等物质的提取。6.选择性热变性沉淀： 在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的 选择性热变性沉淀 ，来分离纯化热稳定性高的目标产物。第4章 膜分离技术1.以静压力差为推动力的膜分离过程微滤、超滤、纳滤和反渗透分离类似于过滤，用以分离含溶解的溶质或悬浮微粒的液体。1.1微滤 以多孔薄膜为过滤介质，压力差为推动力，利用筛分原理使不溶性粒子（0.1-10 m）得以分离的操作。操作压力0.05-0.5MPa。微滤应用1) 除去水/溶液中的细菌和其它微粒；2) 除去组织液、抗菌素、血清、血浆蛋白质等多种溶液中的菌体；3) 除去饮料、酒类、酱油、醋等食品中的悬浊物、微生物和异味杂质。1.2超滤 是以压力为推动力，利用超滤膜不同孔径对液体中溶质进行分离的物理筛分过程。超滤应用超滤从70年代起步， 90年代获得广泛应用,已成为应用领域最广的技术。 蛋白、酶、DNA的浓缩；脱盐/纯化；梯度分离（相差10倍）；清洗细胞、纯化病毒；除病毒、热源微滤和超滤的分离机理一般认为是简单的筛分过程，大于膜表面毛细孔的分子被截留，相反，较小的分子则能透过膜。1.3反渗透 利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂（通常是水）而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压