LCMS操作注意事项.docx

1、LCMS操作注意事项LCMS操作補充資料操作注意事項1. 首先確定LC分析條件包括: mobile phase、gradient及column等，並自備solvents、solvent/waste bottles、sample vials (1.8 ml)。2. 每次操作時: 分析前及完成後，需清洗管線至少半小時以上，確保無殘留污染。3. MS分析條件已知或已找到相關參考資料。4. 進入chemstation後，首先需check tune為pass才可進行以後之操作，否則立即通知精密儀器中心助理。條件設定、質譜解析及報告A. LC設定1. Column2. 液相條件 - 移動相的選擇3. Se

2、t up Pump4. Set up Injector 5. Set up DAD Signals B. MS設定條件參考1.電噴霧(ESI)之3個基本步驟2.化學電離(APCI)之3個基本步驟:3.MS 霧化室(MSD spray chamber)4. Set up MSD signals 1- MSD Control (方框左方)5.Set up MSD Signals 2 - MSD Signal Settings (方框右方) 6.選擇離子檢測(SlM)/ 掃描(scan)模式C. MS說明與解析：1.四極桿質量分析器有兩種掃描方式：2.質譜常用術語3.質譜圖相關概念4. LC-API

3、/CID/MS5. MS解析規則與條件說明6. API電離步驟及過程:7. ESI 及APCI 最佳化條件8.將現有的 LC方法改編為 LC/API-MS方法9.萃取離子層析圖(EIC) 10. 建立校正表D. ReportA. LC設定1. Column :(1)通常填充物質的粒徑3-10 m的管柱是可用的。(2)大於10 m的填充物不適合LC/MS分析，因為峰擴散很大。(3)粒徑3-5 m的填充物是較理想的。5 m管柱可能更適合掃描模式，其峰寬度會比較小粒徑的管柱寬。峰出現花費較少時間，可以有足夠掃描速度和掃描整個峰。如果數據採集太快，損失譜圖質量。3.5 m管柱具有增加層析分辨率和靈敏度

4、的優點。提高的分辨能力可更可靠地分離同分異構體。(4)根據實驗需要選擇Column的長度，對高流量簡單分析用短Column。總分析時間會較短，當為複雜樣品時，需要較長Column的分離能力。2. 液相條件 - 移動相的選擇(1) 非揮發性的酸、鹼、鹽 = 揮發性的酸、鹼、鹽(2) Positive Ion ( pH 5.0 ; 9 preferred)Acetic acid Formic acid Tri-fluoroacetic acidAmmonium hydroxide TEA (3) Post-column addition of acid or base may be used to

5、 adjust the pH if the chromatography wont work at the desired pH(4) 溶劑適用性Suitable for ES and APCl Suitable for only APCIMethanoI AcetonitriIe ; *Water Ethanol ; Propanol ; lsopropanoI ; ButanoI DMF(1) ; DMSO(1) Acetic Acid ; Formic AcidAcetoneCH2C12 ; CHCI3 THFTolueneBenzeneHydrocarbons (e.g Hexane)

6、StyreneCCl4CS2Cyclic Hydrocarbons (e.g Cyclohexane)(5)許多常規的HPLC溶劑適合於API-MS。較好的電噴霧溶劑將在溶液中保持離子。因此，如甲苯這樣的溶劑，在溶液中不會保持離子，不能用於電噴霧。雖然水是對離子極好的溶剎，但它的溶劑化能太高，去溶劑困難。(6)常用的LC/MS溶劑一般為高質量的甲醇、乙睛、水和揮發性添加劑，如甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨等。如果這些常規溶劑能滿足分析的需要，可不考慮其他溶劑。(7)層析類型與離子源適用性ESIAPCIReversed phase*Normal phase* p.s. Main compatibil

7、ity problems: ions in solution are favorable for electrospray, but may lead to poor retention in reversed phase. High ionic strength and/or nonvolatile buffers may be hard to electrospray (8)ESI/APCI與HPLC的移動相之正反模式的相容性: (a)電噴霧有利於溶液中的離子。但是反相液相層析條件通常會抑制離子化，增加分子疏水性質。之後添加可用於克服這種類型的不相容性。樣品通常揮發性低。(b)電噴霧對正相

8、分離不是很有用，因為在正相移動相中通常不會形成離子。而APCI可處理非極性移動相，非極性樣品通常較易揮發，因此正相層析可用於APCI。(c)以凝膠過濾形式的體積排阻層析與電噴霧相匹配。水相移動相和蛋白質樣品是很好的匹配。凝膠過濾層析不適合APCI。通常樣品不易揮發，而且緩衝液會引起APCI問題。然而，凝膠滲透層析由於移動相為有機性的，不太適合於電噴霧。3. Set up Pump(1)流速(flowrate) : 流速就是溶劑沿著管柱流動的速度。保持流動速度為常數對確保精確的保留時間和峰面積測量是很重要的。(2)溶劑(solvent) : 設定分析的溶劑組成。可選擇一元分析或梯度流洗分析。設定

9、通道B的百分比為從0到100%的任何值。通道A為剩下的體積100-(%B)。當運行反相層析分析時，建議把水相放在通道A。(3)壓力界限(pressure limit) : 設定壓力限制的上限和下限，最高壓力限是pump的自行停止的界限，保持分析系統壓力避免過大。如果壓力低於最低限以下，例如移動相走空以後，pump也將自動停止。(4)停止時間(stop time) : 設定一個分析的時間。停止時間後，所有的梯度都會停止，並且pump參教返回初始值。pump是一個完整分析系統停止時間的掌握者。(5)駐留時間(post time) : 駐留時間是分析結束和下一個分析開始之間的最小時間間隔，可以利用駐

10、留時間在改變移動相組成後平衡Column，例如梯度流洗以後。(6)時間表(time table) : 時間表用於建立pump的梯度洗脫程序。pump時間表的值從時間表中定義的終值應隨時間線性地變化。4. Set up Injector (1)標準的進樣體積為0.1100L(標準配置)。如果使用洗針功能，指定洗針所用的溶劑瓶號即可。其餘參數一般不需要改變。(2)選擇Use Injection programs可以按照使用者要求，安排程序進樣。(3)如果希望兩次進樣取樣間隔時間，可以選擇Optimization選項：(a)Overlap Injection cycle：在前一針樣品進行時，就提前把

11、下一針的樣品吸入定量瓶中，做好進樣準備。要注意一定要改變後面的時間內定值，以保證前一針樣品能夠順利進入液相系統，同時保證下一針樣品的擴散最小。一般建議該時間選擇在上一針樣品進行停止之前12min。(b)Prefetch Sample Vial：在前一針樣品進行時，就提前把下一針的樣品抓取到針座上等候，做好進樣準備。此時預約的時間要比上種選項要少，但沒有樣品擴散的風險。此時也要注意一定要改變後面的時間內定值，以保證前一針樣品能順利進入液相系統，一般建議該時間選擇在上一針樣品進行停止之前12min。(4)注意要保證Agilent 1200各個模式的Stop Time和Post Time的設定要一致

12、，內定為As pump，即在pump的參數設定畫面規定這兩個時間即可。5. Set up DAD Signals (1) Signals :規定採集層析圖所需的參數，要求樣品的檢測步長Wavelength(Sam.)設在化合物的最大吸收步長處，且大於溶劑的截止步長20nm以上。參考步長Wavelength(Ref)應設在樣品沒有吸收的地方，且越靠近樣品的偵測步長越好。另外，要求BW(Ref)BW(Sam.)Slit，其中樣品的譜帶寬度Band Width(Sam.)應約等於其紫外吸收峰的半峰寬。注意記得保存所需通道的層析圖，否則層析數據將不被保存。(2)Spectrum:規定採集吸收光譜時所需

13、的參數。可保存所需張數的光譜圖None, Apex + Baselines, Apex+Slopes+Baselines, Ail in Peak, Every 2nd Spectrum或All。若需要進行峰純度檢測或最佳化完全未知的樣品檢測條件，建議選擇All模式。 (3)Peakwidth: 設定影響層析圖的數據採集頻率，Peakwidth應略小於層析上最窄的層析峰的半峰寬。數據採集速率太快，則層析圖的毛刺過多，數據採集速率太慢，則所採集的數據點過少，造成層析峰變形，無法進行準確定量。B. MS設定條件參考1.電噴霧(ESI)之3個基本步驟: 噴霧及帶電去除溶劑離子蒸發。ESI之霧化氣壓力

14、、乾燥氣流速及溫度取決於流動相組成及流速，如流速越快、含水量越高即需越多乾燥氣輔助去除液滴中溶劑。ESI需考慮(1)樣品 : (a)在溶液中為離子態：兒茶酚胺、硫酸酯共軛物、丁基胺(b)有可誘導電離的化合物：甲醇(c)含雜原子的化合物：氨基甲酸酯類，苯並二氮雜原子類(含O, S, N)(d)溶液中帶多電荷：蛋白質、多肽、低聚核甘酸(2)溶液化學參數 : (a)流速(b)樣品的pKa，溶液pH(c)溶液導電性(3)應避免的樣品 : 尤其非極性的樣品PAHs，PCBs2.化學電離(APCI)之3個基本步驟: 霧化蒸發液滴氣相電離。即蒸發後再進行離子化，用於可被蒸發之樣品，且此過程只產生單電荷離子。

15、APCI需考慮(1)樣品(a)分子量和極性中等的化合物：PAHs, PCBs，脂肪酸，鄰苯二甲酸酯類(b)不含酸性和鹼性位點的化合物: 酮、酯、醇、醛、碳氫化合物(c)含有雜原子的化合物：脲、氨基甲酸酯等(d)對電噴霧響應不好的樣品(2)溶液化學參數(a)較ES對溶液化學作用不靈敏(b)較ES更耐大的流速(c)適用ES不宜的一些溶劑(3)應避免的樣品 : 在氣化過程中熱不穩定的化合物3.MS 霧化室(MSD spray chamber)(1) Method: API-ES ; APCI(a)乾燥氣流速(drying gas flow, L/min) : 範圍0-13即最高限值13 L/min。

16、ESI通常為8-10 L/min；APCI通常為4。(b)噴霧氣壓力(Nebulizer pressure, psig) : APCI：60 psi；ESI與流速有關，最高限值60 psi。(c)乾燥氣溫度(drying gas temperature) : 與流動相和流速有關，通常為300 以上。水相比較多或高流速時要求較高的乾燥氣溫度。最高限為350 (d)蒸發溫度(Vaporizer temperature)(限於APCI) : 與溶劑和流速有關，通常為350 。水或高流速時要求較高的蒸發溫度。最高限為500 。(e)毛細管電壓(Capillary voltage) : 最高限為6000

17、 V 正模式(V)負模式(V)ESI40003500APCI40004000註: ESI模式負極性時，在高電壓時全發生噴針放電。(f)電暈電流(Corona current, A) (限於APCI) : 對正極性: 通常為4 A；對負極性: 通常為25 A。(2) Method: MM-ES + APCI 複合源(a)注意charging voltage : 影響ESI區域離子化重要參數。4. Set up MSD signals 1- MSD Control (方框左方)(1) Use MSD MSD將被用作檢測器。在standby狀態，不會被作為檢測器。(2)停止時間(Stop Time)

18、: 質譜停止採集的時間。(a)一般設為As pump：按照LC pump中所設的停止時間，(b)若使用者輸入時間：當選到指定時間時，MSD數據採集將停止。(3)FlA狀態: 選擇FlA時，會顯示FIA enabled。非FlA時，顯示FIA disabled。(4)調整檔案(tune file): 指定採集數據時MSD採用那個調整檔案裡的參數(5)峰寬度(Peak width): 輸入預期的層析峰半寬度 (用分鐘表示)。典型的層析峰寬為0.05-0.15 min。不確定時使用較小的值。內定值為0.1 min。(6)循環時間(Cycle time): 完成一次所有活性信號掃描的時間(秒)。也可想

19、像層析圖上一個採樣點的時間。循環時間的計算與所輸入峰寬有關。(7)快速掃描(Fast scan): (a)當設定的質譜信號參數(如峰寬、質量範圍和步長)會導致採集數據點過少時，軟體會提醒改變參數或選擇快速掃描方式。(b)如果參數設定不需要快速掃描，即使選擇快速掃描也不會被執行。在VL系統中沒有這個選項。(c)在最佳化掃描速度時，會損失一些靈陌性_敏度和分辨率。因為四極柱的離子傳輸效率較低。Data reconstruction (selectable)可選，在此設定下採集的數據進行重組以提高電荷和多電荷質譜圖的分辨率。某些需要快速掃描速度的應用，不一定要重組數據。對於這些應用，不選擇數據重組。

20、數據重組時應用一個移動平均過濾器以減少由快速掃描引起的質譜雜訊。(8)時間過濾器(Time Filter): 內定為選擇時間過濾器。建議使用時間過濾器。(9)掃描數據存檔(Scan Data Storage): (a)建議選擇保存壓縮數據(Condenced)，即棒狀質譜圖，節省磁碟空間。(b)對多電荷樣品使用完全數據 (連續質譜圖)，其它使用壓縮數據。(c)Deconvolution只能在完全數據上進行。如果試圖在壓縮數據或SIM數據上使用Deconvolution，將會產生錯誤。5.Set up MSD Signals 2 - MSD Signal Settings (方框右方) (1)極

21、性(Polarity): 指定MSD檢測離子的極性(positive/negative)。必須先進行MSD tune。(2)模式(Mode): 採集質譜數據的方式。(3)掃描(Scan): 從高到低指定的質量範圍，並且以指定的間隔(步長)檢測強度。在過程中這個程序不斷重覆。適於定性分析，例如未知物的鑑定、峰純度或多電荷樣品分子量的確定。(4)碎裂器(ramp): 適用於Scan模式和定義ramp。不同的質量數離子可應用不同的碎裂電壓。(5)時間(Time): 進樣後質譜參數開始進行生效的時間(min)如果第一行是非零時間，MSD不會採集，直到這個時間到達。質譜選擇閥也會將LC流路送到廢液瓶，直

22、到開始數據採集。(6)質量範圍(Mass range): MSD掃描的質量範圍。範圍越大，MSD須掃描得越快。要得到高品質數據，應掃描所需範圍。(7)增益(Gain): 增益是MSD信號放大因子，將信號強度電子倍增器的電壓相關聯，增益5會得到增益為1時的信號強度的5倍。通常，檢測器會在較低的增益值對工作即能產生合適的離子強度。高增益值同時會增加噪音，產生較差的信噪比。通過增加增益值來提高EMV電壓會縮短電子倍增器的壽命。(8)碎裂器電壓(Fragmentor voltage): 設定碎裂電壓。當進行一個方法(Method)時，控制碎裂器電壓優先是：(a)選擇FIA時，包括碎裂電壓的FIA表；(

23、b)當選擇碎裂器ramp時，碎裂器ramp表(FIA未選擇)；(c)如果以上的都沒有選擇時，參考下列信號設定表。(9)閥值(Threshold): 閥值是強度值。只有強度等於或大於這個值的數據點才被保留在每個掃描的質譜中。內定值150。(10)步長(Step size): 步長是設定掃描數據點之間步幅的大小。這個參數影響掃描速率。典型的值是0.1，範圍為0.05到0.4。 Fragmentor值與化合物性質有關: 不同化合物使用不同的Fragmemtor值CompoundMax. Mol. Ion2nd. M/z 50%Acid Red 4 (-)100130Alprazolam (+)100

24、140Caffeine (+)70100Methamphetamine (+)5070Nitrophenol (-)70100Quinine (+)90130Quinine (+)5060Reserpine (+)130170Salbutamol (+)200註: 最佳化碎裂電壓: 表中數據表示不同化合物獲得最強的准分子離子和第一個碎裂離子達到其50強度的碎裂器電壓值。每個化合物均通過FlA模式在碎裂電壓50到200 V範圍內進行分析的。6.選擇離子檢測(SlM)/ 掃描(scan)模式(1)Scan採集在特定範圍中每個質量上的數據。對定性分析通常採用scan模式採集，例如確定樣品的分子量或純

25、度。(2)SlM只採集預先設定離子的數據。此採集方式具靈敏度和專一性。定量分析通常選擇SlM模式。 Greater sensitivity Better peak shape Trace levels easily detected in complex matrices Used for routine quantification Useful when precise ion ratios are desired (a)SlM參數: SlM有三個可用自訂的參數 # of ionsm/z of each ionDwell time(b)每組可檢測30個離子，每次採集可分50組。(c)每組檢

26、測最少數目的離子可獲得最大的信噪比和準確度。(d)駐留時間(Dwell Time)是對每個離子檢測的時間段。該時間取決於峰寬選擇(17+2 cycles/peak)。S/N正比於Dwell Time。(e)可以設定同組中每個離子駐留相同時間或設定每個離子相對駐留時間:*組內(group)為同時SIM的離子，組間為不同對SIM的離子。*組內SIM的離子越多，每個離子的駐留時間就越少。*操作者可根據層析峰的分離情況將不同離子設為組內，或組間SIM。*駐留時間是用於採集每個離子的時間。駐留時間與MSD參數對話框中設定的峰寬度值有關係。軟體會根據峰寬度值，然後根據每個峰要有17+2個循環的需要以確定駐

27、留時間。除非使用者指定相對的駐留時間，否則駐留時間會在組內的離子間平均分配。(3)選擇 SlM 離子(a)定量離子：該離子的響應用於計算待測物的含量。(b)限定離子：該離子的響應值與定量離子響應值之比值用來確認待測物質化合物，以避免假檢出。(c)選擇相對強度較高的離子可以提高靈敏度。(d)選擇質量數高的離子可以避免干擾。(e)選擇唯一性高的離子。(f)盡量避免選擇基質或背景中存在的離子。(g)如果可能，每個化合物選擇多個離子。離子間的比例可以幫助判別化合物，特別是同位素族。(h)對於SIM定量，可以對每個層析峰選擇一個定量離子。這個離子應該峰高且唯一。不要選擇在基體或背景中相同的m/z。 (i

28、)為確定層析峰，選擇一或兩個限定離子。這些離子也應該峰高且唯一。在LC/MSD分析中，離子的出現和峰高度、緩衝液和碎裂器相關。(4)選擇定量/限定離子(a)應用精確質量，不要用名義質量(例如195.2而不用195).(b)為得到最佳效果，用動態校正，即選擇如括弧所示的樣品質量(195.0,195.1,195.2,195.3,195.4)以選擇響應值最佳的離子。(c)為長期的效果，檢測前要對質量軸進行校正。(5)定量方法建立首先要掃描採樣以確定在SIM分析中所要使用的離子。使用掃描採樣數據，得到譜圖列表展示有一位近似值的精確質量並輸入到SIM表中。使用者應使用列表中的質量，例如195.2，而不是

29、名義上的質量195。如果所選擇的SlM質量偏差0.3daltons，則靈敏度會有70%的損失。另一方面，找到SlM分析的最佳m/z，要避免所有離子的SlM實驗產生一位近似值。這就是所謂的動態調整。(6)動態SIM校正動態SIM校正可以獲得最佳的SIM靈敏度。做SIM 試驗：(a)以0.1 dalton為間隔採集多個質量 例如：Caffeine 195.2 : 195.0 ; 195.1 ; 195.2 ; 195.3 ; 195.4(b)積分SIM數據並且選出響應值最大的離子作為定量離子(c)進行動態調整，此例子中，全掃描質譜圖在195.2 daltons處有離子。(d)咖啡因的SIM實驗將包

30、括一組具有五個離子：195.0，195.1，195.2，195.3和195.4 daltons。評估各質量的離子EIC積分結果，或直接看質譜圖以找到最大強度的離子。這就是SIM定量的最佳離子。C. MS說明與解析：1.四極桿質量分析器有兩種掃描方式：(1)全掃描方式(scan) : 主要用於定性分析，未知化合物的鑑定；(2)選擇離子監測(SIM) : 主要用於已知化合物的定量分析。2.質譜常用術語1.分子離子(molecular ion)自由基 (radical)離子M+。很活潑，易碎裂而產生廣義的碎片離子。2.准分子離子*(quasi-molecular ion)由軟電離技術產生的質子或其他陽離子加合離子以及去質子化或其他陰離子加合離子。3.碎片離子(fragment ion)電離後具有過剩內能的分子離子以多種方式裂解生成碎片離子。4.奇電子離子(odd-