青年科学基金填报说明与撰写提纲.docx

1、青年科学基金填报说明与撰写提纲报告正文： 1. 立项依据与研究内容（1）项目的立项依据。（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）肿瘤是全球致死率最高的疾病之一。据统计，全球新肿瘤患者每10万人中就有173人，在中国每10万人中有110人。通过对肿瘤的发生、生长及转移机制的等方面的研究对于寻找可靠的治疗靶点并指导临床治疗是非常重要的。靶向于血管内皮细胞生长因子A（VEGFA）信号通路的抗血管生成药物，例如贝伐单抗（bevacizumab）、舒尼替尼（sunitinib

2、, sutent）、索拉非尼（sorafenib）都是被美国食品药品管理局批准的，然而由于抗药性的问题导致在临床上效果不稳定1,2。而限制这些抗血管生成药物药效的主要原因是肿瘤细胞遗传的多样性。它会分泌过量的血管生成因子，招募造血细胞和炎症细胞便于肿瘤细胞的转移。可以理解的是这些治疗过程刺激了多个血管生成因子，炎症通路，使得在治疗过程中肿瘤的转移进程加快了。所以，找到更加合理的治疗靶点对抗肿瘤药物的设计显得非常关键而迫切。与之相比，Angiopoietin (Ang)-Tie系统对于肿瘤的治疗是一个好的选择，由于它不仅对于血管的生成、血管内平衡的维持是非常关键的，而且它与血管形成、炎症信号通路

3、的关系密切3。Angiopoitein-1(Ang1)/Tie2信号通路在调节血管成熟和维持血管稳态过程中起着非常关键的作用。人Ang-Tie系统由两个1型酪氨酸激酶受体（Tie1和Tie2）和三个分泌型的配体（Ang1，Ang2和Ang4）组成。Ang1是Tie2的功能配体4，Ang2在正常的条件下是Ang1的竞争抑制剂5。而在体外一些条件下，例如缺乏Ang1或是Ang2浓度很高的情况下，Ang2是可作为Tie2的配体的。Ang3是小鼠中与人中Ang4同源的因子。尽管一些相关报道显示Ang3与Ang4与血管的形成相关，但其在肿瘤发生中的具体功能仍需进一步的探索。Tie2主要表达在内皮细胞，通

4、过与配体Ang结合发挥功能，而Tie1并没有已知的配体，已有报道显示它可与Tie2结合并调控其活性6,7,8。Ang1与Tie2结合后，Tie2二聚或多聚体化，并且其碳端的酪氨酸残基磷酸化。内皮细胞中激活的Tie2结合或激活一些因子，包括下游的酪氨酸激酶相关蛋白（tyrosine kinase-related protein, DOKR）、内皮NO合成酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）、含SH2 domain相关的磷酸化酶（SH2 domain-containing phosphatase）、生长因子受体结合蛋白2（growth factor

5、receptor-bound protein 2, GRB2）、PI3K的p85亚基（the p85 subunit of PI3K, PI3K）、血管内皮酪氨酸磷酸化蛋白酶（vascular endothelial protein tyrosine phosphatase, VEPTP）等。Ang1诱导Tie2激活内皮细胞生存的相互作用、维持内皮屏障和静脉系统稳定，同时它可以抑制炎症信号通路的启动。相反，Ang2被认为是Ang1的拮抗剂，它能增强血管的渗透性，破坏静脉系统，启动内皮细胞生长以促进血管生成9。（如图1）图1 Ang-Tie信号通路示意图（按Huang, H et al.,修改

6、9 ）Ang2优先在那些需要血管增生的组织或部位的内皮细胞中高量表达。它通过竞争性与Tie2结合而抑制Ang1的信号，打破血管稳态、促进血管增生的作用，在肿瘤的发生和转移过程中是非常关键的10,11；Ang1在许多成熟个体组织的壁细胞、纤维原细胞、正常血管细胞中表达，为组织、血管的稳态发挥着重要的作用。而目前对于Ang1在肿瘤血管的形成和转移相关研究非常有限。有意思的是，本研究小组前期研究显示，Ang1通过腺病毒载体在小鼠中的过量表达启动了植入的肿瘤向肺中的转移12。这说明Ang1在肿瘤转移过程中是起重要的作用。也有报道显示Ang1在诸如结肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌细胞中高量表达而Ang2则在

7、癌细胞中表达量非常低13,14,15。那么，肿瘤细胞自身合成大量的Ang1在肿瘤血管的形成过程中扮演的角色仍不清楚。肿瘤依靠血管和淋巴管进行转移，而血小板是血液中一种比较独特的存在形式，在肿瘤转移过程中起非常重要的作用。在正常情况下，血小板在血液中独立的游动和循环。当血管损坏后，一些内皮下的基质蛋白包括胶原，或是可溶的激动剂激活了血小板。其中一个最主要的血小板激动剂是凝血酶，它通过两个受体PAR3和PAR4来调控血小板的聚集和分离，进而达到对血管的坏损进行修复的目的16。有研究显示，在血小板中积累了大量的Ang117,18，那么在凝血过程中血小板破裂，释放的Ang1除了修复血管破损之外，肿瘤在

8、转移过程中Ang1-Tie2的信号是如何发挥作用的呢？ 本研究项目将利用CRISPR/Cas9技术构建Ang1特异敲除的肿瘤细胞系分析肿瘤中高量合成的Ang1对肿瘤生长和转移发挥的作用；结合Tie2条件性敲除模型（Tie2Flox/Flox），血管内皮细胞特异性（Apelin-CreERT2）、淋巴管内皮细胞特异性（Prox-1-CreERT2）和巨核细胞特异性（PF4-Cre）表达重组酶的小鼠获得Tie2条件性敲除模型，探究诱导破坏小鼠血管、淋巴管以及血小板中Ang1-Tie2信号通路对肿瘤血管、淋巴管形成及肿瘤生长、转移的影响，研究结果将有助于我们阐明Ang1/Tie2信号通路在肿瘤在生长

9、和转移过程中的作用机理，为研发理想抗肿瘤药物寻找新的作用靶点提供理论依据。参考文献1. Abdollahi A, Folkman J (2010) Evading tumor evasion: current concepts and perspectives of anti-angiogenic cancer therapy. Drug Resist Updat 13: 16-28.2. Bergers G, Hanahan D (2008) Modes of resistance to anti-angiogenic therapy. Nat Rev Cancer 8: 592-603.3

10、. Herbst RS, Hong D, Chap L, Kurzrock R, Jackson E, et al. (2009) Safety, pharmacokinetics, and antitumor activity of AMG 386, a selective angiopoietin inhibitor, in adult patients with advanced solid tumors. J Clin Oncol 27: 3557-3565.4. Davis S, Aldrich TH, Jones PF, Acheson A, Compton DL, et al.

11、(1996) Isolation of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, by secretion-trap expression cloning. Cell 87: 1161-1169.5. Maisonpierre PC, Suri C, Jones PF, Bartunkova S, Wiegand S, et al. (1997) Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 277: 55-

12、60.6. Sallinen H, Heikura T, Laidinen S, Kosma VM, Heinonen S, et al. (2010) Preoperative angiopoietin-2 serum levels: a marker of malignant potential in ovarian neoplasms and poor prognosis in epithelial ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer 20: 1498-1505.7. Imanishi Y, Hu B, Xiao G, Yao X, Cheng SY

13、 (2011) Angiopoietin-2, an angiogenic regulator, promotes initial growth and survival of breast cancer metastases to the lung through the integrin-linked kinase (ILK)-AKT-B cell lymphoma 2 (Bcl-2) pathway. J Biol Chem 286: 29249-29260.8. Volkova E, Willis JA, Wells JE, Robinson BA, Dachs GU, et al.

14、(2011) Association of angiopoietin-2, C-reactive protein and markers of obesity and insulin resistance with survival outcome in colorectal cancer. Br J Cancer 104: 51-59.9. Huang H, Bhat A, Woodnutt G, Lappe R (2010) Targeting the ANGPT-TIE2 pathway in malignancy. Nat Rev Cancer 10: 575-585.10. Zagz

15、ag D, Hooper A, Friedlander DR, Chan W, Holash J, et al. (1999) In situ expression of angiopoietins in astrocytomas identifies angiopoietin-2 as an early marker of tumor angiogenesis. Exp Neurol 159: 391-400.11. Scholz A, Rehm VA, Rieke S, Derkow K, Schulz P, et al. (2007) Angiopoietin-2 serum level

16、s are elevated in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Am J Gastroenterol 102: 2471-2481.12. Holopainen T, Huang H, Chen C, Kim KE, Zhang L, et al. (2009) Angiopoietin-1 overexpression modulates vascular endothelium to facilitate tumor cell dissemination and metastasis establi

17、shment. Cancer Res 69: 4656-4664.13. Tanaka F, Ishikawa S, Yanagihara K, Miyahara R, Kawano Y, et al. (2002) Expression of angiopoietins and its clinical significance in non-small cell lung cancer. Cancer Res 62: 7124-7129.14. Oka N, Yamamoto Y, Takahashi M, Nishitani M, Kanayama HO, et al. (2005) E

18、xpression of angiopoietin-1 and -2, and its clinical significance in human bladder cancer. BJU Int 95: 660-663.15. Chung YC, Hou YC, Chang CN, Hseu TH (2006) Expression and prognostic significance of angiopoietin in colorectal carcinoma. J Surg Oncol 94: 631-638.16. Kahn ML, Zheng YW, Huang W, Bigor

19、nia V, Zeng D, et al. (1998) A dual thrombin receptor system for platelet activation. Nature 394: 690-694.17. Nadar SK, Blann A, Beevers DG, Lip GY (2005) Abnormal angiopoietins 1&2, angiopoietin receptor Tie-2 and vascular endothelial growth factor levels in hypertension: relationship to target org

20、an damage a sub-study of the Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial (ASCOT). J Intern Med 258: 336-343.18. Lukasz A, Hellpap J, Horn R, Kielstein JT, David S, et al. (2008) Circulating angiopoietin-1 and angiopoietin-2 in critically ill patients: development and clinical application of two new im

21、munoassays. Crit Care 12: R94.（2）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）2.1研究内容：1、利用敲除Ang1的人源肺癌肿瘤模型分析Ang1的缺失对肿瘤生长和转移的影响a) Ang1敲除肿瘤细胞系的构建：利用CRISPR/Cas9技术，获得敲除Ang1基因的人肺癌肿瘤细胞LNM35/LUC；结合测序、RT-PCR和Western blot分别在基因组、mRNA水平和蛋白水平分析靶基因的敲除情况；分析细胞的生长状态、分裂速度等指标，评估Ang1的敲除对于细胞的生长、凋亡有无影响；b) 分析Ang1敲除的肿瘤生长情况：将正常的肿瘤

22、细胞与Ang1敲除的肿瘤细胞同时接种到正常小鼠中，测量不同时间的肿瘤体积和重量，制作肿瘤生长曲线；c) 分析Ang1敲除的肿瘤在小鼠体内的转移：用两种接种方法，实验性转移和自发性转移，分析转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率；通过小动物发光活体成像技术，观察肿瘤的转移方式及转移速度（是通过血液系统还是淋巴转移）；2、血管内皮细胞特异阻断Ang1-Tie2信号通路对肿瘤的形成和转移的影响a) 血管内皮细胞敲除Tie2小鼠模型构建：通过LoxP-Cre重组酶系统进行条件性基因打靶，构建在血管内皮细胞中特异敲除Tie2（阻断Ang1-Tie2信号）的转基因敲除小鼠模型（Apelin-Cre

23、 ERT2; Tie2Flox/-）；利用他莫昔酚诱导敲除，然后利用PCR、Western blotting的方法分析敲除的效率； b) 接种肿瘤细胞：用他莫昔酚诱导敲除后接种原瘤，测量不同时间的肿瘤体积和重量，制作肿瘤生长曲线；分析转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率；通过小动物发光活体成像技术，观察肿瘤的转移速度及转移方式；3、淋巴细胞特异阻断Ang1-Tie2信号通路对肿瘤的形成和转移的影响a) 淋巴细胞特异的Tie2敲除小鼠构建：通过LoxP-Cre ERT2重组酶系统进行条件性基因打靶，构建在淋巴管内皮细胞中特异敲除Tie2以阻断Ang1-Tie2信号的转基因敲除小鼠模型(

24、Prox-1-Cre ERT2; Tie2Flox/-)；利用他莫昔酚诱导敲除，然后利用免疫组化的方法分析小鼠视网膜、皮肤等组织淋巴管的形成；b) 接种肿瘤细胞：利用他莫昔酚诱导敲除后接种原瘤，测量不同时间的肿瘤体积和重量，制作肿瘤生长曲线；原位肿瘤切除后，观察转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率；通过小动物发光活体成像技术，观察肿瘤的转移方式（是通过血液系统还是淋巴转移）；4、巨核细胞特异阻断Ang1-Tie2信号通路对肿瘤的形成和转移的影响a) 通过LoxP-Cre重组酶系统进行条件性基因打靶，构建巨核细胞特异敲除Tie2以阻断Ang1-Tie2信号的转基因敲除小鼠模型(PF4-

25、Cre; Tie2Flox/-)；利用他莫昔酚诱导敲除，然后统计敲除组与正常组血小板的数量，用电镜观察血小板的形态；b) 利用他莫昔酚诱导敲除后接种原瘤，测量不同时间的肿瘤体积和重量，制作肿瘤生长曲线；原位肿瘤切除后，观察转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率；通过小动物发光活体成像技术，观察肿瘤的转移速度和转移方式；2.2研究目标：1、分析肿瘤细胞自身表达大量的Ang1在肿瘤的生长和转移过程所起作用；2、研究小鼠血管、淋巴管敲除Tie2对肿瘤的生长和转移的影响； 3、探究小鼠血小板敲除Tie2对血小板的生理状态、血小板生存以及肿瘤的生长、转移是否起着特殊的作用；2.3拟解决的关键问题

26、：本研究拟利用敲除Ang1的肿瘤模型与Cre重组酶介导的Tie2条件性基因敲除小鼠模型，分析Ang1/Tie2信号通路在肿瘤血管、淋巴管形成以及其对肿瘤生长和转移的作用机理。（3）拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）3.1研究方法、实验手段和关键技术1、Ang1敲除肿瘤细胞系的构建：为了便于后续筛选，选择改造的可表达荧光素酶基因的人肺癌细胞系LNM35/LUC（本实验室保存）进行实验；利用CRISPR/Cas9技术，设计特异识别Ang1的guide RNA及转染载体，转染LNM35/LUC肿瘤细胞；阳性细胞的筛选方法：在荧光显微镜下将转染成功的发荧

27、光的细胞挑出，结合筛选抗生素G418进行多代培养和筛选，得到较纯的细胞系。然后利用测序的方法验证敲除的位点和效率；2、Tie2不同的敲除小鼠模型的配置血管内皮细胞特异的Tie2敲除小鼠模型构建：将已有的转基因小鼠Tie2+/-; Apelin-CreERT2小鼠与Tie2Flox/Flox交配，产生Apelin-Cre ERT2; Tie2Flox/-（用于实验组）与Apelin-CreERT2; Tie2Flox/+（用于对照组）两种小鼠；利用他莫昔酚诱导敲除，用定量PCR等方法分析敲除效率。然后利用免疫组化的方法分析小鼠视网膜、皮肤等组织血管的形成；淋巴管内皮细胞特异的Tie2敲除小鼠模型

28、构建：将已有的转基因小鼠Tie2+/-：Prox-1-Cre ERT2小鼠与Tie2Flox/Flox交配，产生Prox-1-Cre ERT2; Tie2Flox/-（用于实验组）与Prox-1-Cre ERT2; Tie2Flox/+（用于对照组）两种小鼠；利用他莫昔酚诱导敲除，然后利用免疫组化的方法分析淋巴管的形成；巨核细胞敲除Tie2小鼠模型构建：将已有的转基因小鼠Tie2+/-：PF4-Cre ERT2小鼠与Tie2Flox/Flox交配，产生PF4-Cre; Tie2Flox/-（用于实验组）与PF4-Cre; Tie2Flox/+（用于对照组）两种小鼠，然后统计敲除组与正常组血小板

29、的数量，用电镜观察血小板的形态；3、肿瘤的接种与分析：小鼠的选择：人肺癌肿瘤LNM35/Luc选择裸鼠接种，鼠源路易斯肺癌LLC/Luc选择基因敲除的黑鼠接种；肿瘤通过两种接种方法：一种是分析实验性转移，将肿瘤细胞注入血管，观察和分析肿瘤通过血管的转移；另一种是分析自发性转移，通过腋下注射一定量的肿瘤细胞，待其形成固体肿瘤块后切除原瘤，观察转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率 。通过小动物活体成像技术，观察肿瘤的转移方式；4、肿瘤血管、淋巴管的形成分析： 利用免疫组化的方法对肿瘤及相关的小鼠器官进行组织学分析，共聚焦显微镜观察实验结果；3.2技术路线（如下图所示）3.3可行性分析1、

30、理论可行性分析研究证明在Ang1-Tie2信号通路中Ang1是作为血管、淋巴管结构稳定，内环境稳态的关键因子。而Ang2通过对Ang1的竞争性抑制，促进血管的新生及肿瘤的转移。但是2009年本团队研究发现，Ang1在小鼠体内的过量表达会促进肿瘤血管的形成、肿瘤生长和转移。本课题组前期研究发现，血管内皮细胞特异敲除Tie2阻断Ang1-Tie2后，影响了肿瘤的转移。这都说明Ang1-Tie2信号通路对于肿瘤的转移是非常关键的。 有意思的是哺乳动物血小板中储存大量的Ang1，另外在肿瘤细胞中有高量的Ang1表达而Ang2几乎不表达，但这些事实并未被研究者重视。这暗示Ang1-Tie2信号通路在肿瘤

31、刺激时，通过多方面的作用为肿瘤的转移营造条件的观点，理论上是可行的。2、技术可行性分析研究项目中所涉及的利用Cre重组技术的条件性基因敲除小鼠的构建，以及各种分析小鼠组织病变的技术均属本课题组擅长的实验技术；课题组已针对血管内皮细胞敲除Tie2的转基因小鼠进行了莫他昔酚诱导条件的摸索以及肿瘤移植后的分析，这为本研究奠定了坚实基础。课题的难点在于，利用CRISPRCas9构建稳定敲除Ang1的肿瘤模型。本室已构建好了带荧光素酶Luc标记的肿瘤细胞系为进一步的研究提供了很好的材料。CRISPRCas9技术是最近几年兴起的基因敲除技术，具有高效、便捷的特点，然而本团队在此方面的经验不足。申请者之前学

32、习所在的西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室有专门的团队进行相关研究，所以希望通过合作，为课题的顺利完成提供理论和技术的指导。因此，总体来说本项目具有实施层面的良好技术可行性。3、条件可行性分析申请者所在单位依靠苏州大学唐仲英血液学研究中心的有力支撑，拥有完成本项目的所有大型仪器和设备，如激光共聚焦显微镜、小动物体视显微镜、免疫组化需要的切片机、用于基因转录水平检测的实时定量PCR仪等；本中心有完善的分子生物学实验平台、细胞生物学平台、组织学实验平台以开展常规的实验；实验室拥有转基因显微注射平台，可以自行制备转基因敲除小鼠； 苏州大学医学部拥有大规模的SPF级动物房，可以饲养和保存实验需要的动物。本项目所需的试剂与耗材均可通过商业渠道购买。课题所需要的培养基及实验相关试剂均能从国内外试剂公司购买。申请者所在本研究中所需的最关键的转基因条件敲除小鼠在前期的研究中均以获得。另外，本实验室保存了丰富的肿瘤细胞系，便于进行基因编辑实验开展。（4）本项目的特色与创新之处。本课题以团队的前期研究工作为基础，探讨Ang1-Tie2信号通路对肿瘤的转移机制，具有以下特色及创新之处在于：a) 本课题提出假设，An