细胞生物学试验设计.docx

1、细胞生物学试验设计设计实验 1. 细胞概述1. Miller证明地球上的有机分子自动合成的装置(图E1-1)（答案） 播放动画 答: Miller推测,大气层中含有甲烷和氨,也含有氢和水蒸气。他把这些气体一起放入实验装置中（图E1-1）,然后一直与电火花接触,在这一装置中靠沸水提供水蒸气。反应一个星期后分析产物。令人惊讶的是,产物中有大量的有机物,包括尿素、生物和非生物的氨基酸等, 实验证明了在雷电作用下能够利用大气中的分子合成有机分子。也就是说在进化的某一过程中地球上有了构成细胞生命物质的基本元件:氨基酸、碱基、单糖等,为细胞的起源作好了物质准备。图E1-1 Miller证明地球上的有机分子

2、自动合成的装置 设计实验 2.细胞生物学研究方法1. 1975年英国科学家Milstein和Kohler发明的单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)的实验原理和技术细节有哪些?（答案） 播放动画 答:1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆抗体技术,因此获得1984年诺贝尔医学奖。它是将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交的技术，其原理是: B淋巴细胞能够产生抗体, 但在体外不能无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代,但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性, 既能产生抗体,又能无限增殖。图E2

3、-1所示是单克隆抗体制备流程。首先用一种抗原注射小鼠，引起产生特异抗体的细胞大量增殖,取出小鼠的脾,分离产生抗体的淋巴细胞，同骨髓瘤细胞进行融合，在HAT培养基上进行初步筛选后，经过进一步鉴定,得到生产单克隆抗体的细胞。图E2-1 单克隆抗体技术筛选用的HAT培养基是选择性培养基，含有氨基喋呤(aminopterin,A)、次黄嘌呤(hypoxanthine,H) 和胸腺嘧啶(thymidine,T)。在HAT培养基中，只有肿瘤细胞和正常细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生存，而未融合的肿瘤细胞、正常细胞及非肿瘤细胞和正常细胞融合形成的细胞都会死亡。因为，正常的未融合细胞具有核酸合成主要通路和旁路所

4、必需的酶但不能在体外长期生长；突变后的肿瘤细胞只具有 RNA和 DNA合成所必需的主通路的酶，而缺乏利用胸腺嘧啶核苷合成 DNA的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)或缺乏利用次黄嘌呤合成 RNA的磷酸核糖转移酶(HGPRT)。当这些细胞的核酸合成主通路被培养基中氨基喋呤阻断后，则因核酸合成障碍而死亡。只有肿瘤细胞和具有合成旁路酶的正常细胞形成的融合细胞，才能在氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下利用其中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核酸而得以生存。由于融合细胞具有肿瘤细胞和抗体分泌细胞双重特征，所以在去除氨基喋呤这一核酸阻断剂后即可在正常培养基中长期传代增殖，并分泌抗体。在 HAT培养基中生存下来

5、的细胞，可以是各种正常细胞与瘤细胞的融合体，还可能是多克隆杂交瘤细胞的混合群体，因此须进一步用稀释法分离出单克隆的杂交瘤细胞和筛选出识别特异性抗原的抗体分泌克隆，才能最终得到特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株。设计实验 3. 细胞质膜与跨膜运输1. Irving Langmuir如何通过实验提出脂单层的设想？这一设想对膜结构的研究有何特长意义？（答案） 答:关于细胞质膜膜的化学组成和结构，Irving Langmuir通过展层实验，提出脂单层(lipid monolayer)的设想。他将提取的膜脂铺展在Langmuir 水盘(Langmuir Trough)的水面上,研究了脂的展层行为,发现脂在水面

6、上形成一薄层。他用苯将脂溶解,然后将苯-脂溶液放在水面上展层,当苯挥发后,留下的脂在水面上形成单脂层(图E3-1),亲水的头朝向水面,疏水尾背离水面。脂单层概念是20世纪初膜结构研究的基础,导致后来脂双层的发现。图E3-1 脂在Langmuir 水盘中展现单脂层水盘有一个浅盘和一个可移动的挡板组成。移动挡板可将磷脂单层向固定挡板端挤压,形成致密的单脂层。1925年两位荷兰科学家E.Gorter和F.Grendel根据对红细胞质膜的研究首次提出质膜的基本结构是双脂分子层。他们看到了Langmuir的研究论文,认为可以用展层方法研究红细胞膜脂的结构,因为Overton已经提出在细胞的外层有脂的包被

7、,推测红细胞的表面也有脂的存在。在红细胞的外侧包被中有多少脂? 尚不清楚。但是,他们在显微镜下观察到人的红细胞是扁平状,直径约为7m。根据红细胞的体积,推测红细胞的表面积约为100m2。他们分离纯化了红细胞,并从一定数量的红细胞中抽提脂类,按Langmuir的方法进行展层,并比较展层后脂单层的面积和根据体积所推算的总面积。比较的结果, Gorter和Grendel发现脂铺展的面积同实际测量的红细胞的表面积之比约为1.82.21，为了解释这一结果，他们提出红细胞膜的基本结构是脂双层(lipid bilayer)。同时，推测脂双层具有热力学的特点,认为极性的亲水基团朝向外侧的水性环境。他们的实验和

8、依据实验所得出的结论具有非常重要的意义,这是人类第一次从分子水平研究细胞膜的结构。2. 细胞膜上有很多蛋白,如何鉴定膜运输蛋白?（答案） 播放动画 答:目前有两种鉴定方法(图E3-2),一种是亲和标记法(affinity labeling),另一种是膜重建(membrane reconstitution)。图E3-2 鉴定膜运输蛋白的两种方法上:亲和标记法,在此法中常常用到特异的运输系统的抑制剂。下:膜重建法。在亲和标记法中,主要是用放射性标记的分子抑制某种物质的运输.这种抑制作用是由抑制剂同膜运输蛋白的结合引起的,然后分离膜蛋白,鉴定同抑制剂结合的膜蛋白。例如细胞松弛素B是葡萄糖运输蛋白的抑

9、制剂,因此将放射性标记的细胞松弛素加入到细胞液中,就可同膜中葡萄糖运输蛋白结合,然后从膜中分离蛋白,通过放射性分析鉴定膜运输蛋白。在膜重建法中,首先要分离纯化膜蛋白,然后将分离纯化的蛋白质同磷脂混合,构建人工脂质体，然后检测脂质体的运输能力。3. 请设计一种方法检测跨膜蛋白的哪一部分位于膜的外侧,哪一部分位于膜的内侧? （答案） 答: 用相对分子质量大而不能透过细胞质膜的胰蛋白酶处理胰蛋白酶完整的细胞:这种处理可以将跨膜蛋白的朝向外侧的肽水解,而位于脂双层和细胞质面的部分则不受影响。 用非离子去垢剂或渗透休克提高膜的渗透性,让膜失去了对蛋白水解酶渗透的障碍作用, 结果使膜蛋白的细胞质部分被蛋白

10、酶水解。处理的结果可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。同时设置对照细胞。实验过程示于图E3-3。图E3-3 测定膜蛋白在膜中定位的实验过程设计实验 4. 细胞环境与互作1. 证明细胞具有识别能力的经典实验是什么?（答案） 播放动画 答:胚性细胞实验:分别用蛋白酶将外胚层和中胚层水解成单细胞，并分别标记上不同的颜色，然后将这两种细胞混合。在混合之初，它们混合得很好，但是随着时间的推移，外胚层的细胞移向外侧，并聚集在一起，这也是它们在胚胎中的正确位置；来自中胚层的细胞移向内侧，这也是它们在胚胎中的正确位置。 这两种游离的细胞迅速重新聚集成团后, 同种细胞形成独立的聚合体, 每种聚合体只含一

11、种颜色的细胞(图4E-1)，这种现象称为拣出(sorting out)。这一实验说明了细胞的识别具有选择性，非同类的细胞不会混合聚集。 5. 细胞通讯1. 如何通过实验分离烟碱样乙酰胆碱受体并证明烟碱样乙酰胆碱受体证明具有通道偶联受体的作用?（答案） 答:烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor)是研究得比较清楚的离子通道偶联受体,它存在于脊椎动物骨骼肌细胞以及某些鱼的放电器官细胞的质膜上；受体与乙酰胆碱结合,引起Na+通道的开放,Na+流入靶细胞，使得质膜去极化并引起细胞的收缩。分离纯化乙酰胆碱受体, 首先要找到一种与该受体结合的配体, 然后进行受

12、体分离。幸运的是发现了一种蛇毒毒素，使得受体的纯化成为可能。-银环蛇毒素(-bungarotoxin)是一种小分子的蛋白质，能够选择性地并且几乎是不可逆地同乙酰胆碱受体结合。这些毒素能够阻止乙酰胆碱同受体相互作用，导致呼吸麻痹和死亡。利用放射性标记的-银环蛇毒素可在显微镜下确定组织切片中的乙酰胆碱受体的位置,以及检查纯化的蛋白样品中是否有受体的存在。利用-银环蛇毒素从电鳐属电辐射鱼的放电器官细胞质膜中分离纯化了乙酰胆碱受体。结构分析发现这种受体是由5个亚基组成的，其中两个亚基、一个亚基、一个亚基、一个亚基，最小的亚基上有乙酰胆碱的结合位点。 分离纯化了乙酰胆碱受体，可用人工脂质体研究其功能。实

13、验发现将纯化的烟碱样乙酰胆碱受体加到脂质体上，Na+的通透性就增加了，由于人工脂质体上没有其它的蛋白成分，根据这一实验推测烟碱样乙酰胆碱受体本身就是一种Na+离子通道，也说明乙酰胆碱受体是神经递质门控离子通道。通道的开启与关闭受神经递质乙酰胆碱的调节(图5E-1)。图5E-1 乙酰胆碱离子通道偶联受体的结构域功能2. 请设计一个实验研究受体与配体结合的特异性.（答案） 答:可采用非放射性标记的底物同放射性标记的配体竞争受体的结合位点的方法。原理是: 如果结合是特异性的,只有信号分子能够同受体结合,而与信号分子无关的分子则不能同受体结合。例如,放射性标记的胰岛素与受体的结合不会受胰高血糖素或AC

14、TH(促肾上腺皮质激素)的抑制,但是能够被非放射性标记的胰岛素或胰岛素衍生物所抑制(图5E-2)。图5E-2 证明激素与受体结合特异性的实验实验中,将放射性标记的胰岛素与分离的膜一起温育,同时加入各种不同浓度的胰高血糖素或ACTH。与胰岛素无关的激素不会与放射性标记的胰岛素竞争质膜受体。通过检测放射性即可证明。3. cAMP是如何发现的?科学家是如何证明腺苷酸环化酶在信号转导中的作用?（答案） 播放动画 答: 1957年Earl Sutherland 及其同事们在研究狗肝组织中糖原是如何断裂时发现了cAMP，这是代谢研究的一个重要里程碑。Sutherland 和他的同事们利用离体系统研究激素的

15、生理反应,经过多次努力后,他们发现胰高血糖素或肾上腺素与细胞一起温育能够激活磷酸化酶。破碎细胞并经离心分离后,分别收集颗粒和溶液,发现磷酸化酶只存在于上清液中；但是,如果要对激素作出应答,颗粒是必不可少的。后来的实验表明,对激素的应答至少涉及两个不同的过程。如果分离肝的匀浆液中的颗粒部分,并将分离的颗粒与激素一起温育,然后将与激素温育过的颗粒添加到上清液中,发现有某种物质的产生,这种物质能够激活磷酸化酶。Sutherland 鉴定了从膜颗粒中释放出的物质是一种小分子的环状单磷酸腺苷,即cAMP。由于cAMP是激素作用膜受体后释放出来的,并且能激活磷酸化酶的活性,所以cAMP被称为第二信使。虽然

16、cAMP是第一信使作用于膜颗粒后产生的第二信使,至于cAMP是如何产生的却有几种推测。最简单的推测是与激素结合的受体本身就有催化ATP生成cAMP的能力,即cAMP是受体催化的。如此解释,就同G蛋白和腺苷酸酸环化酶毫无关系了。 为了证明cAMP的产生与第一信使及G蛋白偶联受体膜机器的三个成员密切相关,科学家们进行了一系列实验获得了证据，证明它们是独立的三个成员，共同完成信号转导。Joseph Orly 和Micheal Schramm通过细胞融合实验首先证明了受体与腺苷酸环化酶是不同的两种蛋白。用于融合实验的两个细胞中一个是带有肾上腺激素受体但缺少腺苷酸环化酶的红细胞，另一个是带有腺苷酸环化酶

17、但缺少肾上腺激素受体的肿瘤细胞。细胞融合以后，加入肾上腺激素能够产生cAMP，而在未融合的细胞中加入肾上腺激素则不会有cAMP的产生(图5E-3)。虽然证明了激素受体和腺苷酸环化酶是两个独立的成员，但是，同受体结合的激素又是如何激活腺苷酸环化酶? 最早是通过一种称为cyc�突变的肿瘤细胞系发现GTP能够增强激素对腺苷酸环化酶的激发作用。这种突变细胞具有正常的腺苷酸环化酶和肾上腺激素受体，但是用肾上腺素处理不能促进cAMP的生成。如果在该细胞培养基中加入从正常细胞分离的G蛋白,就能够恢复对cAMP合成的激发作用。由于这种G蛋白能促进(stimulating) cAMP的合成，故称之称为Gs

18、。上述实验结果令人信服地证明该系统中三个成员的存在和各自独立的作用。 图5E-3 证明肾上腺素受体与腺苷酸环化酶是两个不同蛋白的细胞融合实验设计实验 6. 核糖体与核酶1. 如何证明RNA聚合酶进行5S rRNA基因转录时, 使用的是内部启动子?（答案） 播放动画 答:可通过基因操作。如将5S rRNA基因的5侧的上游序列完全除去，检测转录情况, 然后再切去5S rRNA基因的部分内部序列,再检测转录情况。实验结果表明: 将5S rRNA基因的5侧的上游序列完全除去并不影响5S rRNA基因的转录。但是，如果将5S rRNA基因内部缺失一部分序列(从50位到80位缺失)，RNA聚合酶不仅不能转

19、录这段DNA，甚至不能结合上去(图6E-1)。如果将5S rRNA基因的内部启动子序列插入到基因组的其它部位，会使插入的部位形成一个新的转录起点。图6E-1 RNA聚合酶转录5S rRNA基因启动子的鉴定将图中5S rRNA基因的A片段或D片段缺失都不影响RNA聚合酶的转录,但是将B片段或C片段缺失,都会影响RNA聚合酶的转录。表明5S rRNA基因的启动子位于5S基因内部的控制区。2. 如何证明原核生物的16S-23S-5S三种rRNA位于同一条转录的rRNA分子中.（答案） 答:通过核酸酶(RNase)突变体的研究证明原核生物的三种rRNA位于同一个原初转录物中。在这种突变体中，三种rRN

20、A位于同一条rRNA分子中，但是在正常的细胞中这三种rRNA是以三种独立的小分子存在，这一研究结果也说明RNase是将16S-23S-5S rRNA前体切割成单体的主要核酸酶。 在细菌中RNase不是参与rRNA前体加工的惟一的一种酶，还需要其它一些核酸酶参与，实验证明如果缺少其它一些酶，得不到正确大小的rRNA。设计实验 7. 线粒体与过氧化物酶体1. 请根据线粒体外膜比内膜通透性高这一特性,设计分离线粒体各组份的方法（答案） 答: 将线粒体放在低渗溶液或者去垢剂毛地黄皂苷(digitonin)中直到线粒体外膜裂开，随着外膜的破裂,膜间隙中的物质释放到溶液中, 此时线粒体内膜和基质仍结合在一

21、起(称为线粒体质),通过离心可将线粒体质分离。用去垢剂Lubrol进一步处理线粒体质，破坏线粒体内膜,释放线粒体基质, 破裂的内膜重新闭合形成小泡,其表面有F1颗粒。 实验中要通过离心分离各组分, 并要借助电子显微镜观察将内膜和外膜区分开来分离的外膜看起来象空的囊，而内膜会形成小泡，内膜自我封闭形成内膜小泡的外表面含有F1颗粒。2. 请设计一个实验证明线粒体蛋白合成之后进入了线粒体（答案） 答: 可通过基因工程和分子生物学方法进行研究，主要过程如下：克隆线粒体基质蛋白基因;在无细胞系统中合成酵母线粒体蛋白;检测分离后将合成的蛋白质分成两组,一组直接加入胰蛋白酶,另一组先加入线粒体,然后再用胰蛋

22、白酶蛋白酶处理;结果分析: 如果加入线粒体的一组中的蛋白质对胰蛋白酶具有抗性,而不加线粒体的一组中蛋白质被胰蛋白酶水解, 即可证明加入线粒体后, 线粒体蛋白进入了线粒体。因为胰蛋白酶是水溶性的酶,不能进入线粒体,所以对胰蛋白酶的抗性说明线粒体蛋白进入了线粒体从而得到保护。实验过程示于图7E-1。图7E-1 线粒体蛋白前体转运的实验证明3. 科学家是怎样证明线粒体基质蛋白在转运过程中穿膜中间体的存在？如何证明导序列(导肽)没有特异性? （答案） 答: 主要是通过离体实证实了穿膜中间体的存在,并证明导向序列对所引导的蛋白质没有特异性(图7E-2)。首先利用DNA重组技术构建一个嵌合蛋白，其N-端含

23、有一个长为31个氨基酸的线粒体基质导向序列,其后接上一段间隔序列,长度为51个氨基酸,紧接着是187个氨基酸组成的小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR),该酶在正常情况下存在于胞质溶胶中,并且它的C-末端可在分子伴娘的作用下处于非折叠状态。用无细胞系统合成的DHFR嵌合蛋白能够被转运到线粒体基质,然后切除导向序列。氨甲蝶呤(methotrexate)是DHFR抑制剂,它能够与嵌合的DHFR的活性位点牢牢地结合,使嵌合DHFR锁定在折叠状态而不能进入线粒体基质。但是N-端的导向序列能够进入线粒体基质,并被水解,此时的DHFR仍然被结合在膜上形成稳定的转运中间体。这一实验中,间隔序列的设计非常重要,如果间

24、隔序列较短,譬如说35个氨基酸,就得不到稳定的转运中间体。当除去氨甲蝶呤,嵌合DHFR就能完全进入线粒体基质。这一实验同时证明了导肽没有特异性。图7E-2 线粒体蛋白转运中间体的证明(a)通过重组DNA技术构建的嵌合蛋白的结构。(b)转运中间体的证明。氨甲蝶呤是DHFR的抑制剂,它能够同DHFR的活性位点结合,使DHFR不能解折叠,因而不能穿过运输通道,维持转运中间体的状态,这种状态能够通过电子显微镜进行观察。当除去氨甲喋呤,转运中间体消失,因为DHFR能够解折叠,从而进入线粒体基质。4. 请设计一个实验证明ATPase既能催化ATP的水解,又能催化ATP的合成（答案） 播放动画 答: 可采用

25、来自其它膜结构中的ATPase作实验, 如用质膜中的Na+/K+ ATPase。在细胞质膜中,该酶的功能是水解ATP进行K+的逆浓度梯度运输,这是该酶在细胞质膜中的惟一功能。实验采用红细胞。首先分离红细胞并在高K+离子水溶液中制成血影,使其内部具有极高K+离子浓度，然后将之放入具有极高浓度的Na+离子环境中,“细胞”内的K+向外移动,而Na+向细胞内移动。这两种离子都是沿各自的浓度梯度向下移动,而不像在生活细胞中那样逆浓度梯度移动。如果在红细胞血影中加入ADP和Pi的话,离子的移动会引起ATP的合成而非ATP的水解(图7E-3)。图7E-3利用红细胞血影和Na+/K+ ATPase重组小泡进行

26、的ATP合成实验图中小写字母表示离子移动的方向。上述实验结果表明,在科学研究中，不能总是按常规思维去认识事物，反向理论也有很重要的作用。上述结果是根据酶催化反应的反向理论去认识酶的作用后发现的,同时,该实验也证明了离子梯度能够驱使ADP磷酸化合成ATP。可以用这一结果预测在线粒体膜间隙中由电子传递所建立的质子移动力可用于ATP的合成。实验中合成ATP必须满足三个条件:要有膜结合的ATP合酶、离子梯度、合成ATP的化学材料(ADP和Pi),这三个条件在线粒体内膜的两侧都是具备的。5. 请推测线粒体膜重建实验是如何进行的?（答案） 答: 为了证明F1具有ATP合酶的作用, 最好、最直接的方法是通过

27、线粒体膜的重建实验,验证其功能, 即将线粒体内膜与其嵴上的F1颗粒分离出来,重新装配后研究F1的功能。 实验中先分离附着有F1颗粒的线粒体内膜小泡,然后将小泡置于加有NADH、ADP和无机磷的溶液中,这些小泡能够将NADH的电子经由小泡膜中呼吸链逐步传递给O2,偶联合成了ATP。Efraim Racker实验室第一个成功进行了含有F1颗粒的线粒体内膜小泡的拆装。首先分离完整的线粒体，然后用超声波处理使线粒体破裂。破裂的线粒体内膜能够自我封闭成内膜小泡,其上结合有F1颗粒，然后用脲处理或用玻珠与内膜小泡一起振荡，使内膜上附着的F1颗粒脱落，形成没有颗粒附着的内膜小泡，将处理的样品离心后,分别收集

28、沉淀和上清液。在显微镜下检查收集的沉淀都是表面光滑的小泡。经功能实验，这种光滑型的内膜小泡只有电子传递的功能而没有合成ATP的能力。实验收集的上清液中含有从内膜脱落的F1颗粒,经检查,这种颗粒既不能传递电子又不能合成ATP。非但如此,分离的F1颗粒能够水解ATP,其功能与结合在线粒体内膜时相反。根据这一结果推测,F1的正常功能是附着在线粒体内膜上进行ATP的合成,若是脱离了内膜则具有水解ATP的作用,因为失去了合成ATP所需要的能量。这种假说得到实验的支持。将分离的F1颗粒与光滑的线粒体内膜小泡结合,使F1颗粒重新附着到线粒体内膜上,这种重建的含有F1颗粒的线粒体小泡不仅能够进行电子传递,而且

29、具有ATP合成的能力(图7E-4)。通过线粒体内膜重建实验,人们得出结论线粒体内膜中的F1颗粒是一种ATP合酶，它是呼吸链上氧化(放能)和磷酸化(贮能)的偶联装置。图7E-4 线粒体内膜重建实验6. 请推测David Luck通过什么样的实验证明线粒体是通过分裂增殖的?实验过程如何?（答案） 答: 1965年David Luck通过放射性标记实验证明线粒体分裂增殖的观点。 首先将脉胞菌(胆碱缺陷突变株)培养在加有3H标记的胆碱(一种磷脂的前体物)培养基中,使线粒体的膜带上放射性标记。然后收集放射性标记的细胞,转入非同位素的培养基中继续培养,分别在不同培养时间收集菌体,再通过放射自显影检查经过不同时期培养的细胞中同位素的分布。并预测同位素的分布应是下述三种模式中的一种:如果新的线粒体是由已有线粒体的生长和分裂而来,那么每分裂一次,线粒体中的放射性就会减少一半；如果新的线粒体是重新合成的,那么,新线粒体应该没有放射性,而老的线粒体的放射性应与原初的线粒体相同；如果新线粒体是由其他的膜重新装配而来,那么原有的线粒体仍