HPLC法测定非诺贝特含量的方法学考察.docx

1、HPLC法测定非诺贝特含量的方法学考察镇 江 高 专ZHENJIANG GAOZHUAN毕 业 设 计 (论 文) HPLC法测定非诺贝特含量的方法学考察HPLC method for determining the content of fenofibrate methodology系 名： 化工系 专业班级： 学生姓名： 学 号： 指导教师姓名： 徐 兵 指导教师职称： 讲 师 2010 年 5 月HPLC法测定非诺贝特含量的方法学考察专业班级： 学生姓名： 指导教师： 徐 兵 职称： 讲师摘要 目的：根据中国药典2010版采用HPLC法对非诺贝特进行方法学考察6；方法：采用十八烷基硅烷键

2、合硅胶为填充剂色谱柱，流动相为甲醇-水（81：19），检测波长为286nm，流速为1.0ml/min，进样体积：20 l。结果：非诺贝特在2.75024.750 g/ ml范围内线性关系良好（r=0.9999）；本法精密度良好，符合测试要求；本品的流动相溶液在室温条件下放置，8小时内的稳定性较好，符合测定要求；结论：该法快速，准确，重现性好，可以用于非诺贝特含量测定。关键词：非诺贝特，HPLC法，含量，方法学考察HPLC method for determining the content of fenofibrate methodologyObjective according to Chi

3、nese pharmacopoeia 2010 version of using HPLC fenofibrate on methodology; Methods: using Silica column for the filling agent, mobile phase chromatographic column for methanol-water (81:19), for 286nm detected wavelength, velocity of 1.0 ml/min, volume: 20 l, L. Results: fenofibrate 2.75024.750 g/ ml

4、, G/m range inside (r = 0.9999), This test requirements, with good precision, This product of mobile phase solution at room temperature, 8 hours with good stability, determination of requirements, Conclusion: the method is rapid, accurate, reproducible and can be used for fenofibrate content determi

5、nation.Keywords fenofibrate, HPLC, content and methods引 言随着人们生活水平的提高,血脂异常的病例近年有明显的上升趋势。高脂血症是公认的高血压、冠心病和脑血管意外的主要危险因素，同时它又与许多疾病相关。因此，纠正脂代谢紊乱，对改善冠心病、高血压及相关疾病的症状，降低脑血管意外的发生具有十分重要的意义。而非诺贝特是临床常用的调血脂药物,其主要作用是可显著降低血清甘油三酯(TG)、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平以及升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL)水平1。第一章 立题简介1.1非诺贝特简介非诺贝特（C20H21ClO4）是临床

6、常用的调血脂药物,其主要作用是可显著降低血清甘油三酯(TG)、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平以及升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL)水平。其作用机制主要是通过激活脂蛋白酶，促进富含TG的乳糜微粒和极低密度脂蛋白(VLDL)的分解，并且还可抑制肝脏合成和分泌富含TG的VLDL，从而降低血浆中TG的水平；还可通过减少羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶前体的合成而抑制HMG-CoA的作用，从而减少TC在肝脏的合成，并增加LDL受体的数量，加速LDL由血液转入肝细胞，使血清TC和LDL水平下降，是首选的降TG药物。临床上主要用于治疗高胆固醇血症，高甘油三酯血症及混合型血症2。目

7、前,以TG升高为主的高脂血症治疗药物有苯氧芳酸类、烟酸及鱼油等,其中以苯氧芳酸类疗效为佳。苯氧芳酸类中又首推非诺贝特降TG最有效,且非诺贝特对羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-coA)还原酶有一定程度抑制作用3。因此,非诺贝特能够降低TC,TG,LDL-C,sLDL,apoB及升高HDL-C血浆水平,多方面对脂质代谢紊乱起调脂作用。然而,非诺贝特属难溶性药物,口服吸收较差。近年来发展的微粒化非诺贝特剂型,因药粉粒度减小, 其微粒直径均在50m以下,而极大增加了药物和胃肠道的接触面积,与普通剂型相比, 其优点为口服吸收好, 生物利用度高, 能保持较恒定的血药浓度，在临床使用时较小剂量即可达到与普通剂型

8、相同的效果4。1.2 HPLC法简介高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,简称HPLC）是20世纪70年代迅速发展起来的一种高效、快速的新型分析分离技术,是目前应用最多的色谱分析方法.高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。HPLC是以液体溶剂作为流动相的色谱技术,它是结合经典液

9、相色谱法及气相色谱法的分析分离原理,进一步发展并迅速成长的新型液相色谱法。该法具有高压、高速、高效、高灵敏性等优点7。而且与气相色谱法相比,只要求试剂能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热不稳定性差、相对分子质量大的有机物,原则上都可用高效液相色谱法来进行分离、分析8。HPLC因其独特的优点已经广泛应用于药物的含量测定、组成分析、质量控制等方面,已成为天然药物有效成分分离、分析最重要的方法之一12。现在HPLC经历近40年的发展，色谱工作者可对任何类型的分离提供适用的色谱柱及相应的分离条件，并可在短的时间内，利用计算机提供的软件计算程序，获得可包含40个组分的优化完

10、全分离。现在除低沸点化合物使用GC分析外，其他样品都可用HPLC进行分析。但随着质谱分析技术的快速发展，可以预见质谱分析将在当代发展成为继色谱分析之后的，一种通用的分离和分析方法。HPLC由于具有高选择性、高灵敏度,并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点,已成为医药研究的有力工具15。如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药物成分的定性和定量测定、新型高效手性药物中手性对映体含量的测定以及药物代谢物的测定等方面,都需要用到HPLC的不同测定方法予以解决。 第二章 实验部分2.1检测波长选择精密称取非诺贝特50mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，

11、置另一100ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，照紫外分光光度法（中国药典2010年版二部附录IVA）,测得非诺贝特的无水乙醇溶液在286nm附近有最大吸收，见图1，故选择286nm为含量测定的检测波长。图1 非诺贝特的吸光度与波长关系Figure 1 Fenofibrate enhances the absorbency and wavelength 2.2流动相选择在实验过程中，根据其本身性质及参考相关文献，选择甲醇-水、乙腈水为流动相组成，进行试验，优化流动相，经过对各组份比例的考察，具体见表1、图24，最终确定本品的流动相为甲醇-水，分离效果好，保留时间合适。表1 非诺贝特流动相的选择

12、Table 1 fenofibrate flow of the select编号流动相的选择结 论A甲醇-水（85：15）分离效果差，杂峰与主峰未完全分开B甲醇-水（81：19）分离效果好，分离度合格C乙腈-水（80：20）分离效果较好，分离度合格，但对小杂峰的分离不如甲醇系统图2 流动相 甲醇-水（85:15）Figure 2 mobile phase fisher chem alert guide（85:15）图3 流动相 甲醇-水（81:19）Figure 3 mobile phase fisher chem alert guide（81:19）图4 流动相 乙腈-水（80:20）Fig

13、ure 4 mobile phase anhydrous acetonitrile（80:20）2.3实验仪器及色谱条件仪器：泵： 岛津LC-10ADvp高效液相色谱仪检测器：岛津SPD-10AVvp紫外检测器工作站：N2000色谱数据工作站色谱条件 ：流动相：甲醇-水（81：19）色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂检测波长：286nm流速：1.0ml/min进样体积：20 l2.3方法学考察2.3.1线性与范围取经50减压干燥至恒重的非诺贝特对照品50mg，精密称定，置100ml量瓶中,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀，作为储备液。分别精密吸取储备液1、1.5、4、5、8ml置200ml量

14、瓶中,用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。依色谱条件，分别精密量取20 l，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度C（ g/ml）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，并计算回归方程和相关系数。结果见表2，色谱图见图510。表2 线性相关性实验结果Table 2 relevant results of the linear序 号12345浓度( g/ml)2.7505.50012.37515.09724.750峰面积1189962371385349096536581064235回归方程A=43010X+1612 R=0.9999 (n=5)线性范围2.75024.750 g/ml图5 非诺贝特线性图F

15、igure 5 linear of Fenofibrate图6 2.750 g/ml线性色谱图Figure6 2.750 g/ml linear the color spectrum图7 5.500 g/ml线性色谱图Figure7 5.550 g/ml linear the color spectrum图8 12.375 g/ml线性色谱图Figure8 12.375 g/ml linear the color spectrum图9 15.097 g/ml线性色谱图Figure9 15.097 g/ml linear the color spectrum图10 24.750 g/ml线性色谱

16、图Figure10 24.750 g/ml linear the color spectrum结论：本品在2.75024.750 g/ml范围内呈良好的线性关系。2.3.2进样精密度取非诺贝特样品适量，用流动相溶解并稀释制成浓度为50 g/ml的溶液，作为供试品溶液。依法测定，连续进样5次，每次20 l，记录峰面积，并对结果进行评价，结果见表3 ，色谱图见图1115。 表3 含量测定（HPLC法）进样精密度试验结果Table 2 In this experiment in precision by HPLC进样次数12345峰面积52721595266556525384152480695258

17、487平均值SD52601569660RSD0.18图11 精密度试验色谱图1#Figure11 Refined the color spectrumfigure1 #图12 精密度试验色谱图2#Figure12 Refined the color spectrumfigure2 #图13 精密度试验色谱图3#Figure13 Refined the color spectrumfigure3 #图14 精密度试验色谱图4#Figure14 Refined the color spectrumfigure4 #图15 精密度试验色谱图5#Figure15 Refined the color s

18、pectrumfigure5#结论：本法精密度良好，符合测试要求。2.3.3溶液稳定性取非诺贝特样品适量，用流动相溶解并稀释制成浓度为50 g/ml的溶液，作为供试品溶液。置于室温于0、1、2、4、6、8和24小时，精密吸取20 l，依色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表4，色谱图见图 1621。 表4 含量测定（HPLC法）溶液稳定性试验结果Table 4 In the stability test results by HPLC时间(h)012468峰面积525848753105005253841524806952665565216191平均值SD525894130621RS

19、D0.58图16 稳定性0小时色谱图Figure16 Stability 0 hours the color spectrum图17 稳定性1小时色谱图Figure17 Stability 1 hours the color spectrum图18 稳定性2小时色谱图Figure18 Stability 2 hours the color spectrum图19 稳定性4小时色谱图Figure19 Stability 4 hours the color spectrum图20 稳定性6小时色谱图Figure20 Stability 6 hours the color spectrum图21 稳

20、定性8小时色谱图Figure21 Stability 8 hours the color spectrum结论：由实验可知本品溶液在24小时内较稳定。2.3.4准确度分别精密称取非诺贝特（批号：090901）50mg，置100ml量瓶中；再分别加入非诺贝特对照品40mg,50mg，60mg，精密称定，用流动相溶解，再用流动相稀释制成40 g/ml,50 g/ml，60 g/ml三个浓度的溶液，依色谱条件，分别精密量取20 l，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算测得量，根据测得量和加入量计算回收率。试验结果见表5。表 5 含量测定（HPLC法）准确度试验测定结果Table 5 In determi

21、ning the accuracy of the test results by HPLC浓 度（%）样品加入量（g）对照品加入量（g）测得量（g）回收率（%）平均值SDRSD8010.05010.040010.0399099.7399.660.620.6220.05030.040130.0394398.2630.05080.040820.04084100.0510010.04980.050230.0498399.2020.05920.051020.0508099.5630.05060.050060.05023100.3412010.04990.060240.0602299.9620.0505

22、0.060030.06005100.0430.05040.060080.0599499.77结论：本法准确度良好，符合测试要求。2.3.5重复性试验取非诺贝特样品适量，共5份，精密称定，用流动相溶解并稀释制成浓度为50 g/ml的溶液，作为供试品溶液。依色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。并对结果进行评价。试验结果见表6 ，色谱图见图2226。表6 含量测定重复性试验结果Table 6 In the present experiment份数12345含量（）99.824399.820999.816599.814499.8151平均值SD（）99.81820.004RSD（）0.17图22 重

23、复性试验色谱图1#Figure22 Repetitive the color spectrumfigure1 #图23 重复性试验色谱图2#Figure23 Repetitive the color spectrumfigure2 #图24 重复性试验色谱图3#Figure24 Repetitive the color spectrumfigure3 #图25 重复性试验色谱图4#Figure25 Repetitive the color spectrumfigure4 #图26 重复性试验色谱图5#Figure26 Repetitive the color spectrumfigure5 #

24、结论：上述结果表明，本法重复性良好，符合测试要求。2.3.6中间精密度试验在不同的五天内取非诺贝特样品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成浓度为50 g/ml的溶液，作供试品溶液。依色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，并对结果进行评价。结果见表7，色谱图见附图2731。表7 含量测定中间精密度试验结果Table 7 In the outcome of the refined份数12345含量（）99.24100.1100.299.93100.0平均值SD（）99.890.38RSD（）0.38图27 中间精密度试验第一天色谱图Figure27 Of the experiment the f

25、irst set the precision图28 中间精密度试验第二天色谱图Figure28 The test of the second set the precision图29 中间精密度试验第三天色谱图Figure29 Of the experiment third set the precision 图30 中间精密度试验第四天色谱图Figure30 The test of the fourth set the precision图31 中间精密度试验第五天色谱图Figure31 Of the spectrum of the fifth the preciseness结论：上述结果表

26、明，本法精密度良好，符合测试要求。2.3.7样品含量测定方法：取本品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含50 g的溶液，精密量取20 l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取、对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。结果见表 8 ，色谱图见图3234 表8 三批样品含量测定结果Table 8 Three in the sample批号090901090902090903含量（）99.8999.8399.84图32 090901批含量色谱图Figure32 090901 of the content of the color spectrum图33 090902批含量色谱图Fi

27、gure33 090902 of the content of the color spectrum 图34 090903批含量色谱图Figure34 090903 of the content of the color spectrum 第三章 结果与讨论结果：非诺贝特在2.75024.750 g/m范围内线性关系良好（r=0.9999）；本法精密度良好，符合测试要求；本品的流动相溶液在室温条件下放置，8小时内的稳定性较好，符合测定要求；结论： HPLC法具有重现性好，专属性强、无干扰、分析快速准确的特点，可以用于非诺贝特含量测定。致 谢我要特别的感谢给予我指导的徐兵老师和实习单位的程浩老师

28、，在我写论文期间悉心指导，指出诸多不足之处并给了我很多建议。老师们渊博的知识、踏实的治学风格和认真负责的精神让我受益匪浅，是我学习的榜样。我还要感谢给予我大量帮助的同事朱叶，郭颖等，在我做实验期间，对一些问题的探讨和交流让我开拓了思路，也让我在写毕业论文时非常轻松，愉快。同时我还要感谢给我实习机会的南京卡文迪许生物工程技术有限公司,给我提供做毕业论文和毕业实习的条件,让我学到更多实验实际中的知识，让我对本专业的知识有了更进一步的了解。此外，一并感谢系科，各位老师，教务处以及为所有我提供过帮助的人！参考文献：1 李佳杨; 李芳; 张洪飞; 郭兴杰 高效液相色谱法测定非诺贝特渗透泵型控释片的含量

29、S. 中国药学杂志. 2009，44（10）:799-800 2 张招忠， 项凡英， 高效液相色谱法测定非诺贝特含量. 分析测试技术与仪器，1999，5（3）:1551563 范国荣，林梅，张正行，人血浆中非诺贝特活性代谢物非诺贝酸的高效液相色谱法测定，药物分析杂志J.2000,20(4):231-2344李小燕，反相高效液相色谱法测定非诺贝特片的含量，中国医院药学杂志J2004,24(4):251-2525 何勇 ,夏涛，HPLC 法测定非诺贝特胶囊的含量,安徽医药J2004 ，9 (2):118-1196 非诺贝特.中华人民共和国药典2010版二部7 张玉奎、张维冰、邹汉法。液相色谱分析。第二版。北京：化学工业出版社，2000.128 于世林.高效液相色谱方法及应用。第二版。北京：化学工业出版社，2005.69 高潮译.现代液相色谱法导论.北京:化学工业出版社,1988.110 战英民.英汉色谱技术词汇.第二版.北京:科学出版社,198211 曾元儿，张凌.高效液相色谱法.仪器分析：23425812 张健泓，陈优生.高效液相色谱法概论中国医药导报2008 年第5 卷第22 期 282913 董学畅,张甜.微柱高效液相色谱及其研究进展.云南化工2004 年第31 卷第5 期232614 冯利，庞静秋高效液相色谱法在药物分析专业的应用 黑龙江医药2003，16，1 .4344