绿茶中咖啡因含量的测定.docx

1、绿茶中咖啡因含量的测定摘 要本文对一系列绿茶的化学成分及其抗氧化性进行了研究。利用紫外分光光度法测定其茶黄酮类化合物、茶多糖的含量；绿茶样品多糖含量为57.19-357.8 mg/g。同时提取12种绿茶样品中的咖啡因和茶多酚，分别用氯仿和乙酸乙酯进行萃取，经HPLC分别测定其含量。绿茶样品的咖啡因含量为4.637-12.99 mg/g，其中福建绿螺含量最高。茶多酚含量为48.904-110.86 mg/g，其中浙江龙井含量最高。利用气相色谱-质谱联用技术，通过水蒸气蒸馏提取法对两种工艺相同的绿茶样品的挥发性成分进行分离和结构鉴定。运用气相色谱面积归一化法确定各个成分的相对百分含量。结果表明人工

2、培育的鞍山金壶中二苯胺含量最高。以邻苯三酚碳酸盐缓冲溶液鲁米诺发光体系的发光强度为空白发光峰值，流动注射化学发光法测定12种绿茶样品的抗氧化性，其IC50值为0.182-0.840mg/mL。关键词：绿茶；化学成分；高效液相色谱法；抗氧化性；流动注射化学发光法目 录摘 要.IAbstract.II1绪论.41.1茶的起源.41.2茶文化.51.3饮茶.61.4茶叶的分类.71.5绿茶.71.5.1绿茶简介.71.5.2绿茶的分类.81.5.3绿茶的主要化学成分.92绿茶中咖啡因含量的测定12 2.1 引言.12 2.2 实验部分.13 2.2.1目前的测定方法.19 2.2.2测定.19 2.

3、3 结论.213 咖啡因的应用与展望.21参考文献.231 绪论我国是茶树原产国，也是世界上最早发现和利用茶叶的国家1。茶属双子叶植物，约30属，500种，分布于热带和亚热带地区，我国有14属，397种，主产长江以南各地。绿茶是我国六大茶类之一，属于不发酵茶。绿茶做为中国的主要茶类，全国年产10万吨茶叶，产量位居六大初制茶之首。中国生产绿茶的范围极为广泛，浙江、河南、安徽、江西、江苏、四川、湖南、湖北、广西、福建、贵州为我国的绿茶主产省份。绿茶较多的保留了鲜叶内的天然物质。其中茶多酚、咖啡碱保留鲜叶的85以上，叶绿素保留50左右，维生素损失也较少，从而形成了绿茶“清汤绿叶，滋味收敛性强”的特点

4、。最新科学研究结果表明，绿茶中保留的天然物质成分，对防衰老、防癌、抗癌、杀菌、消炎等均有特殊效果，为其他茶类所不及。现在，茶叶产区已经不在局限于北纬18海南岛的三亚至38太行山脉的灵寿县五岳寨地区了。人们经过不懈的努力在北纬41成功培育了茶树。在云南一带，人们还把茶树以外的其他植物的叶片，甚至叶片以外的部分当做茶来饮用2。这些“茶外之茶”也在广泛的被利用，而我们也会很自然的称其为茶。1.1茶的起源茶叶是当今世界消费量最大的饮料之一，它和咖啡、可可并称世界三大无酒精饮料3。对于其起源问题，历来争论较多，随着考证技术的发展和新发现，才逐渐达成共识，即中国是茶树的原产地，并确认中国西南地区，包括云南

5、、贵州、四川是茶树原产地的中心。由于地质变迁及人为栽培，茶树开始由此普及全国，并逐渐传播至世界各地。神农本草经记载：“神农尝百草，日遇七十二毒，得荼而解之”。据考证：这里的荼是指古代的茶，“茶”字最早出现在百声大师碑和怀晖碑中，时间大约在唐朝中期，公元806年到公元820年前后，在此之前，“茶”是用多义字“荼”表示的。这虽然是传说，带有明显的夸张成份，但也可从中推论，茶的发现和利用已有五六千年的历史了。1.2茶文化据人文社会学家对文化一词的释义认为：文化即“人化”或“人类化”。那么，茶文化可理解为：茶被“人化”了之后，人以茶为载体和活动内容而体现出的一种特有的文化现象4。这包含和体现一定时期的

6、物质文明和精神文明。茶文化是中华传统优秀文化的组成部分，其内容十分丰富，涉及科技教育、文化艺术、医学保健、历史考古、经济贸易、餐饮旅游和新闻出版等学科与行业，包含茶叶专著、茶叶期刊、茶与诗词、茶与小说、茶与祭祀、茶与禅教、茶与谚语、饮茶习俗、茶艺表演、陶瓷茶具、茶馆茶楼、冲泡技艺、茶食茶疗、等廿一个方面。茶叶作为一种饮料，从唐朝开始，流传到我国西北各个少数民族地区，成为当地人民生活的必需品，“一日无茶则滞，三日无茶则病”。与此同时，茶文化也随之兴起。中唐时，陆羽茶经的问世使茶文化发展到一个空前的高度，标志着唐代茶文化的形成。原始茶文化的主要精神是以神农为代表的先民们的实践和艰苦开创精神。中国人

7、饮茶，注重一个“品”字。“品茶”不但是鉴别茶的优劣，也带有神思遐想和领略饮茶情趣之意。品茶的环境一般由建筑物、园林、摆设、茶具等因素组成。饮茶要求安静、清新、舒适、干净。中国园林世界闻名，山水风景更是不可胜数。利用园林或自然山水间，搭设茶室，让人们小憩，意趣盎然。1.3饮茶中医认为，茶叶上可清头目，中可消食滞，下可利小便，是天然的保健饮品。然而，茶叶的产地和品种不同，其药理作用也不一样。一年有春夏秋冬四季之分，茶叶也有寒热温凉性味的差别，因此，四季饮茶也要有所区别。春天，属温，阳气上升，阴气下降，万物复苏。人们经过漫长的冬季，“内热积贮”，因此应注意驱寒御邪，扶阳固气。此时宜饮花茶。因为花茶香

8、气浓烈，香而不浮，爽而不浊，具有理气、开郁、祛秽、和中的作用，促进机体阳气的生发，并能振奋精神，消除春困。夏天，属热，赤日炎炎，气候闷热，出汗甚多，造成水、电解质平衡紊乱，因此必须补充大量水分。此时宜喝绿茶。因为绿茶性味苦寒，清鲜爽口，具有清暑解热、生津止渴和消食利导等作用。秋天，属凉，有萧杀之象，空气渐渐干燥，人们感觉皮肤、鼻腔、咽喉干燥不适，这叫“秋燥”。此时宜喝青茶，色泽绿润，内质馥郁，不寒不热。秋凉饮之，可以润肤、除燥生津、润肺、清热、凉血。冬天，属寒，天寒地冻，寒气袭人，人的机体处于收引状态，新陈代谢迟缓，容易罹患“寒病”。此时宜饮红茶。这种茶，叶红、汤红，醇厚干温，滋养阳气，增热添

9、暖，可以加奶、加糖，芳香不收，还可以去油腻、舒肠胃。1.4茶叶的分类以颜色(或制作工艺)分类以季节分类1.5绿茶1.5.1绿茶简介绿茶，又称不发酵茶。以适宜茶树新梢为原料，经杀青、揉捻、干燥等典型工艺过程制成的茶叶。其干茶色泽和冲泡后的茶汤、叶底以绿色为主调，故名。绿茶为我国产量最大的茶类，产区分布于各产茶省、市、自治区。其中以浙江、安徽、江西三省产量最高，质量最优，是我国绿茶生产的主要基地。在国际市场上，我国绿茶占国际贸易量的70以上，销区遍及北非、西非各国及法、美、阿富汗等50多个国家和地区。在国际市场上绿茶销量占内销总量的1/3以上。同时，绿茶又是生产花茶的主要原料。据日本读卖新闻报道，

10、日本东北大学医学系的栗山进一讲师通过临床调查发现，每天喝2杯以上绿茶的人比每周不足3杯绿茶的人，发生识别功能障碍等老年痴呆症的倾向要小得多。1.5.2绿茶的分类中国绿茶中，名品最多，不但香高味长，品质优异，且造型独特，具有较高的艺术欣赏价值。绿茶按其干燥和杀青方法的不同，一般分为炒青、烘青、晒青和蒸青绿茶。绿茶不发酵的茶(发酵度为零)龙井茶,碧螺春；红茶全发酵的茶(发酵度为80-90)祁门红茶，正山小种；白茶徽发酵的茶(发酵度为10-20)白牡丹，安吉白荣；青茶半发酵的茶(发酵度为30-60)铁观音，冻顶乌龙茶；黑茶后发酵的茶(发酵度为100)六堡茶，普洱茶；黄茶轻度发酵的茶(发酵度为20-3

11、0)君山银针。春茶：是指当年3月下旬到5月中旬之前采制的茶叶；夏茶：是指5月初至7月初采制的茶叶；秋茶：就是8月中旬以后采制的茶叶；冬茶：大约在10月下旬开始采制。-4-炒青绿茶：由于在干燥过程中受到机械或手工操力的作用不同，成茶形成了长条形、圆珠形、扇平形、针形、螺形等不同的形状，故又分为长炒青、圆炒青、扁炒青等等。烘青绿茶：是用烘笼进行烘干的。烘青毛茶经再加工精制后大部分作熏制花茶的茶坯，香气一般不及炒青高，少数烘青名茶品质特优。以其外形亦可分为条形茶、尖形茶、片形茶、针形茶等。晒青绿茶：是用日光进行晒干的。主要分布在湖南、湖北、广东、广西、四川，云南、贵州等省有少量生产。蒸青绿茶：以蒸汽

12、杀青是我国古代的杀青方法。唐朝时传至日本，相沿至今；而我国则自明代起即改为锅炒杀青。1.5.3绿茶的主要化学成分随着科学的发展，到了19世纪初，茶业的成分才逐渐明确起来。经过现代科学的分离和鉴定，茶叶中含有机化学成分达四百五十多种，无机矿物元素达四十多种。茶叶中的有机化学成分和无机矿物元素含有许多营养成分和药效成分。有机化学成分主要有：茶多酚类、植物碱、蛋白质、氨基酸、维生素、有机酸、脂多糖、糖类、酶类、色素等。茶是纯天然的、符合人体生理健康的卫生、安全、保健、无公害的饮料。茶不仅是中国的“国饮”，而且是世界性的饮料。有人预测，21世纪将是茶饮的世纪5。明顾元庆茶谱上记述：“人饮真茶能止渴、消

13、食、除痰、少睡、利尿道、明目、益思、除烦、去腻、人固不可一日无茶。”目前茶叶被广泛应用到医药、保健、化妆品等行业。经现代科学技术分析及临床实践表明具体的茶的二十三功效：少睡、安神、明目、清头目、止渴生津、清热、消暑、解毒、消食、醒酒、减肥、下气、利水、通便、治痢、去痰、祛风解表、坚齿、治心痛、疗疮治瘘、疗饥、益气力、延年益寿。这些功效均是由茶叶中的化合物作用而得，无论这些化合物是单一作用还是协同作用，对人体健康均起到了重要作用。绿茶作为不发酵茶，保留了茶叶最原有的化学成分；绿茶主要含有茶多酚，咖啡碱，糖类，黄酮类化合物等。（1）黄酮类化合物黄酮类化合物是绿色植物特有的产物，而且多存在于一些有色

14、植物中6，天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类。大多数黄酮类化合物具有清除自由基的作用，一些研究结果显示大多数黄酮类化合物清除自由基的能力大于维生素C和维生素E7。黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂8，除了具有抗氧化能力，还能够调节酶活性、抗病毒、调节免疫细胞功能、调节内分泌与代谢等功能。人类通过膳食摄取的黄酮类化合物在人体内发挥着潜在的作用。（2）茶多糖多糖类化合物广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，也是构成生命的四大基本物质之一。茶多糖是一种酸性糖蛋白，并结合有大量的矿质元

15、素，称为茶叶多糖复合物，简称为茶叶多糖或茶多糖（TeaPolysaccharide）。茶多糖具有降血糖9、降血脂10、抗凝血及抗血栓11、增强免疫功能12、降血压、耐缺氧及增加冠状动脉血流量、防辐射13等作用。现已有制备含有茶多糖的降血糖和抗糖尿病用的药物和健康食品的专利和生产工艺14,15。（3）咖啡因咖啡因（Caffeine）是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱。少量的摄入咖啡因可兴奋大脑皮质，振奋精神，提高其注意力；增强警觉性和减少疲乏感，提高警惕性和维持持久的工作能力16,17；增强识别能力，缩短快速与选择反应时间，并能提高瞬时口头记忆力18；影响睡眠19。而摄入咖啡因量较多可引起失

16、眠、焦虑、心烦气躁、易怒等。据资料报道，从茶叶中提取咖啡因的主要方法有水提取法、醇提取法、升华法20及其它有机溶媒提取法21,22；重量法、沉淀法、六十至七十年代报道有离子交换、柱层析、深剂浸提等方法23。（4）茶多酚茶多酚是一种稠环芳香烃，可分为黄烷醇类、羟基-4-黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。在茶叶中的含量一般在15-20。绿茶中的茶多酚含量为20-30，主要包括儿茶素，黄酮醇及其配糖物，无色花色素，酚酸及缩酚酸24。茶多酚能够清除活性氧自由基，阻断脂质过氧化过程，提高人体内酶的活性，从而起到抗突变、抗癌症25-28的功效；还可防治高脂血症引起的疾病血压。茶多酚通过调节免

17、疫球胆白的量活性，间接实现提高人体综合免疫能力、抗风湿因子、抗菌抗病毒的功效29；提高人体的综合免疫能力的功效。此外茶多酚还具有抗脂质过氧化，预防衰老、防辐射26损伤、清除口臭的作用、助消化等作用。在食品工业上可作抗氧化剂，对淀粉酶、蔗糖酶均有良好的抑制能力；是理想的水果保鲜剂；由于茶多酚具有强还原性，可以做保色剂和除臭剂消除异味30。茶多酚的抗氧化性能比BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(二丁基羟基甲基茴香醚)高2-3倍，且安全无毒31。茶多酚在日用化工产品上的应用也还有极为广泛的发展前景。在化妆品中添加少量的茶多酚作保质剂32，茶多酚对波长为200-330 nm埃的紫外线有较强吸收，因而茶多

18、酚可直接阻止紫外线损伤皮肤33，可减少紫外线引进的皮肤黑色素形成。茶多酚在医疗保健上具有防治癌症等多种疾病和抗衰老增强免疫等功能；在农业上可抑制病原细菌，作为植物的生长促进剂34。茶多酚还是一种极有潜力的新型饲料添加剂35。由于实验室条件的限制，本文将重点描述咖啡因的部分。2绿茶中咖啡因含量的测定2.1引言咖啡因属于甲基黄嘌呤的生物碱，是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱，适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用。纯的咖啡因是白色的，强烈苦味的粉状物，其结如图4.1所示。茶叶中咖啡碱的含量占茶叶干物质总量的2-5，其化学名称为1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤49。咖啡因具有兴奋神经中枢，消除

19、疲劳，减弱酒精、烟碱、吗啡等物质的毒害增强肾脏血流量，利尿和强身等作用50。利用水提取法提取绿茶样品中的咖啡因，简便，操作，至今仍被广泛使用。2.2实验部分（1）仪器与试剂HX200A型华西高速中药粉碎机（浙江省永康溪岸五金药具厂）AL204电子天平（梅特勒-托利多公司（上海）有限公司）Waters 1525-2996-tcm液相色谱仪（美国Waters公司）电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）甲醇（色谱纯，山东禹王化学试剂厂）氯仿（分析纯，天津市光复精细化工研究所）咖啡因（标准品，中国药品生物制品检定所）二次蒸馏水，自制（2）样品1：福建绿螺2：浙江龙井3：江西雨雾4：四川竹叶青5：阳羡雪芽6

20、：南京雨花7：安徽松针8：六安瓜片9：广东绿茶10：极峰绿茶11：西乡特炒12：鞍山金壶（3）浸提液用量、浸提时间和浸提次数的选择浸提液用量的选择：准确称取2.2.3中粉碎的绿茶样品1.00 g于50 mL锥形瓶中，分别加入5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL沸水，加塞。在沸水浴中浸提20 min，然后立即减压抽滤。滤液用氯仿萃取三次，实验现象如表4.1所示。由表4.1所示的实验现象可知，浸提液用量为10 mL，提取效果较好。浸提时间的选择：准确称取2.2.3中粉碎的绿茶样品1.00 g于50 mL锥形瓶中，加入10 mL沸水，加塞。在沸水浴中分别浸提10 min、20 m

21、in、30 min、40 min和50 min，然后立即减压抽滤。滤液用氯仿萃取三次（浸提50 min后第一次萃取无透明氯仿层），氯仿层在50下减压浓缩，浓缩液定容到25 mL容量瓶中。从其中移取10 mL，通过0.45m的混纤维孔滤膜过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL，待测。得浸提时间与峰面积的关系如图4.1所示。由图4.1可知，超声时间为20 min时，峰面积最大，即咖啡因的得率最高，因此选择超声20 min最合适。浸提次数的选择：准确称取2.2.3中粉碎的绿茶样品1.00 g于50 mL锥形瓶中，加入10 mL沸水，加塞。在沸水浴中浸提10 min，然后立即减压抽滤，滤渣重复提取一

22、次，合并滤液。用氯仿萃取三次，氯仿层在50下减压浓缩，浓缩液定容到25 mL容量瓶中。从其中移取10 mL，再通过0.45m的混纤维孔滤膜过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL，待测。得浸提次数与峰面积的关系如图4.2所示。由图4.2可知，浸提次数越多，峰面积越大，咖啡因的得率越高，但增幅随次数的增多而减少。因此采取浸提两次即可。（4）样品储备液的制备51,52准确称取2.2.3中粉碎的绿茶样品1.00 g于50 mL锥形瓶中，加入10 mL沸水，加塞。在沸水浴中浸提20 min，然后立即减压抽滤，滤渣重复提取一次，合并滤液。滤液用等量的氯仿萃取三次，氯仿层（下层）在50下减压浓缩，浓缩液定

23、容到25 mL容量瓶中，得样品咖啡因储备液，摇匀待用。（5）色谱条件53色谱柱：Kromasil C18（4.6150 mm，5m.迪马公司）；流动相：V（水）V(甲醇)=7030；色谱柱温：30；进样量：10L；检测器：紫外检测器；检测波长：272.4 nm；扫描波长：210 nm-400 nm；（6）标准曲线的绘制准确称取咖啡因的标准品20 mg于50 mL的小烧杯中，用少量氯仿溶解，定容到25 mL容量瓶中，作为咖啡因标准储备液。分别精确移取0.1、0.7、1.3、1.9、2.5、3.1 mL于10 mL的容量瓶中，用氯仿定容。分别通过0.45m的混纤维孔滤膜过滤。进样量为10L，以积分

24、峰面积为横坐标，咖啡因质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线。以积分峰面积（微伏秒）为横坐标、咖啡因质量浓度（mg/mL）为纵坐标，绘制标准曲线，如图4.3所示，求得二者关系的线性回归方程为：Y=210-8X0.0016，相关系数r=0.9999，说明咖啡因标准品在0.0040-0.12 mg/mL范围内，峰面积与咖啡因浓度呈良好线性关系，可按标准曲线法进行定量分析。（7）精密度实验移取6个不同质量浓度的4.1.2(6)中的咖啡因标准储备液，配制溶液，通过混合纤维膜过滤，进行HPLC检测，每个浓度溶液测定九次，求得该方法的标准偏差和变异系数，如表4.2所示。（8）方法回收率精确称取2.2.3中粉碎的绿

25、茶样品1.00 g，按照4.1.2(4)的方法处理，配成三个系列浓度的溶液，分别加入精确加入4.1.2(6)中的咖啡因标准品储备液0.5 mL，混合均匀后，通过混合纤维膜过滤，进行HPLC检测，计算该方法的回收率如表4.3所示。（9）最低检出限取4.1.2(6)中的咖啡因标准储备液1.0 mL，不断稀释，通过混合纤维膜过滤，进样检测，当响应值为基线噪音二倍时，测定其峰面积，计算此时咖啡因标准品溶液的浓度，即为该仪器对咖啡因的最低检出限。实验结果表明，本实验的最低检出限为：0.01g/mL。 2.2.1 目前的测定方法从茶叶中提取咖啡因一般的方法主要有5种： 茶叶中加人生石灰在索氏提取器中用95

26、 乙醇提取一升华法； 茶叶中加入生石灰95 乙醇回流浸取一升华法；将茶叶在热水溶解浸取一氯仿萃取法；碳酸钠水溶液热浸取一二氯甲烷萃取法； 直接升华法茶叶中含有的生物碱主要是咖啡因，约占茶叶于重的1 5，另外还含有微量的茶碱(约0002)和可可碱(约005 )除了生物碱外，含有约l1 12 的丹宁酸(又名单宁或鞣酸)，约06 的色素，还有纤维素和蛋白质等由于茶叶中的单宁及纤维素对咖啡因的分离造成一定影响，特别是其中的单宁影响更为严重，单宁或水解生成的没食子酸易与咖啡碱生成难溶盐因此，通常是用碱性溶液使咖啡因游离出来，从而达到提取的目的2.2.2测定取4.1.2(4)所得样品储备液，每个样品进样三次，求出三次的积分峰面积的平均值，然后带入标准曲线，计算各样品的咖啡因含量，结果如表4.4所示。根据表4.4，以咖啡因含量为纵坐标，样品名称为横坐标，对其含量大小作柱状图进行比较，如图4.17所示。2.3结论对样品浸提液用量、浸提时间和浸提次数进行研究，浸提1.00 g样品，浸提液用量为10 mL，浸提时间为20 min；随着浸提次数的增加，咖啡因的含量增加，但增加量减小，因此选择浸提2次。用氯仿萃取出茶叶水浸出物中的咖啡因，采用高效液相色谱法测定12种绿茶样品的咖啡因的含量，在波长272.4 nm处积分峰面积最大，该方法的变异系数小于3.34；该方法的回收率为92.28-