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1、Flt3基因突变与急性髓系白血病发生和预后的关系参考模板Flt3基因突变与急性髓系白血病发生和预后的关系【关键词】 Flt3基因；基因突变；急性髓系白血病 Fms样酪氨酸激酶3 ( Fms-like tyrosine kinase 3，Flt3)是型受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族成员之一，在正常造血及免疫系统发育中起着重要作用。Flt3基因突变与急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的发生、预后密切相关。以Flt3作为靶分子已成为AML治疗的一种新策略。1 Flt3基因结构与功能1.1 结构 人类Flt3

2、基因又称作胎儿肝脏激酶-2 (Fetal liver kinase-2，FLK-2)1和人类干细胞激酶-1 (human stem cell kinase-1，STK1)2，位于染色体13q12，全长约100 kb，含有24个外显子，编码993个氨基酸的蛋白质。Flt3蛋白有分子量为143KD的糖基化高甘露醇形和分子量为158KD的复合糖形两种形式，前者存在于胞内，经过糖基化过程后形成后者，并定位于膜上。后者是Flt3在细胞表面的主要存在形式。 Flt3与其它型RTK如kit 、fms、PDGF 受体有相似的结构，包含由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。胞外区是胞外配体结合区，由5个免疫球蛋白

3、样结构域组成；跨膜区有不连续的激酶作用的位点；胞内区为酪氨酸激酶催化区，由1个胞内近膜结构域( juxtamembrane domain， JM)、2个被插入结构域分开的激酶结构域(tyrosine kinase domain，TKD)和1个C末端结构域构成3。近年来的研究表明JM结构域对维持激酶催化中心空间结构稳定性起主要作用，对激酶活性有负调控作用4。图1 Flt3信号转导途径1.2 功能 Flt3在胸腺、肝、脾、淋巴结、胎盘、大、小脑、生殖腺等多种组织中表达。在正常人骨髓中Flt3的表达仅限于CD34干/祖细胞，在红细胞系及成熟T、B淋巴细胞、NK细胞中无表达5。Flt3配体为FL(Fl

4、t3 ligand)。无FL存在时，近膜结构域对Flt3二聚体形成和活化起着抑制作用。当FL与Flt3受体结合，后者发生二聚体化，激酶结构域的活化环(activation loop，A-loop)构象发生改变，酪氨酸残基自身磷酸化。激活的Flt3通过SHC与GRB2结合而激活RAS，从而进一步激活下游的效应因子如RAF、MAPK/ERK激酶。这些下游效应因子激活核因子CREB、ELK、STATs，使造血干细胞发生增殖和活化。此外，激活的Flt3也可以激活PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)和RAS途径，导致增殖加快，细胞凋亡抑制6，见图1。这两种信号途径通过R

5、AS的联系提示了Flt3与白血病发生有关。2 Flt3基因突变 Flt3基因突变是造成Flt3基因异常活化的主要原因。其突变形式主要表现为两种：近膜结构域内部串联重复(internal tandem duplications， ITDs)突变和TKD或/和JM的点突变(point mutation，PMs)。两种突变均可造成Flt3酪氨酸激酶的结构性活化，见图2。 图2 Flt3基因突变常见类型Flt3/ITDs是Flt3基因AML中最常见的突变类型，常出现在外显子11，也可累及内含子11和外显子127。也有报道Flt3/ITD位于外显子14和15，而非外显子11和12810。Flt3/ITD

6、s的插入长度具有多态性，其长度在3400bp之间不等，但串联复制的碱基数多是3的倍数，极少产生框移突变，因而不影响开放阅读框架(open reading frame，ORF)的正常翻译过程11,12。Flt3/ITDs使得Flt3基因持续活化的原因可能的是：(1)Flt3/ITDs造成了近膜结构域的结构改变，从而破坏了近膜结构域的自我抑制功能13。(2)Flt3/ITD突变可以使细胞外的C末端的构象发生变化，有利于Flt3二聚体的形成，导致配体非依赖性磷酸化。Flt3因磷酸化而酪氨酶激酶活性增强，导致酪氨酸残基自发激活发生磷酸化作用，激活下游信号通路，如RAS信号转导途径和转录激活因子5 信号

7、转导途径，促进细胞增殖并与AML的进展存在密切相关14，见图3。 第3期王杰.Flt3基因突变与急性髓系白血病发生和预后的关系图3 Flt3基因突变信号转导示意图在一些无Flt3/ITDs的AML患者中也存在配体非依赖性的Flt3基因组成性激活，说明除Flt3/ITDs之外，可能还存在有其他类型突变导致Flt3基因激活。近年来国内外的研究表明约6.4%7.7%的患者出现TKD或/和JM结构域的点突变，同样可以导致Flt3基因配体非依赖性激活15,16。 TKD点突变，常发生于激酶结构域活化环内，通常为氨基酸残基的突变，插入和缺失，最常见的是D835是第一个核苷酸G被T替代，即D835Y17。此

8、外还有D835V18、D835H19、D835E20、D835N21等。最近，在AML中又发现了两种新的活化环点突变，一种是第836位I的缺失，另一种是第836位I被M替换同时被R插入22。这两种新的点突变与D835一样，突变也位于第2个酪氨酸激酶的活化环内，都能导致无配体情况下受体自身磷酸化，通过激活STAT5信号转导途径而抑制白血病细胞的凋亡23。 JM点突变发生频率不高，目前尚无大量的临床研究统计学数据。已见报道的突变类型有V579A、V592A、F594L和F590GY591D等24,25。研究表明JM点突变可以降低JM区对激酶活性负调节作用，从而使Flt3持续活化并激活下游信号途径，

9、如STAT526。研究也发现JM点突变与Flt3/ITDs相比，对细胞的增殖作用较小，且受体自身的活化程度也较弱，推测可能是JM点突变对近膜结构域的破坏较小，未造成自我抑制功能的完全丧失27,28。3 Flt3基因突变与AML 急性白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，发病率为3/10万，其中AML约占20%30%。近几年来，随着环境致癌因素的增加，AML的发病率及死亡率均呈上升趋势。目前AML的发生机制仍未完全阐明，但随着研究的不断深入，Flt3基因突变在AML发生、预后中的作用日益受到重视。3.1 Flt3基因突变与AML发生 Flt3与其配体FL结合后能通过信号传导途径对造血发育起重要的调控作用

10、，能调节多能造血干细胞、早期前体细胞及不成熟淋巴细胞的生长。1996年，Nakao等首先报道AML患者Flt3基因编码的近膜区(JM)存在Flt3/ITDs29。此后的国内外报道显示Flt3基因在70%90%的AML患者细胞中出现异常表达，其中20%25%的AML患者Flt3基因发生了Flt3 /ITDs，并见于AML 各亚型，其中以M3和M5多见，且突变率各异30。我们的研究发现在儿童白血病患者中Flt3阳性率80.33%，其中Flt3/ITDs突变率为17.21%；各亚型突变率分别为M0 42.86%、M1 22.22%、M2 12.90%、M4 44.44%和M5 15.38%。说明儿童

11、AML在外显子11处发生Flt3/ITDs的频率极高，是儿童AML发生的主要原因31。 目前，Flt3异常表达和基因突变导致AML发生的分子机制尚不完全清楚。目前大量的临床研究证实Flt3/ITDs常集于JM区中从密码子589599富含酪氨酸残基的一段区域，从首尾相按顺序插入若干个复制的核苷酸。研究显示在AML细胞株研究中，Flt3/ITDs可抑制c/EBPa ( repression of CCAAT/ estradiol-binding protein )和Pu.1的表达，阻滞髓源细胞分化；应用Flt3/ITDs抑制剂处理AML细胞株后c /EBPPu.1表达增强32。进一步的研究证实Fl

12、t3/ITDs可干扰激酶磷酸化信号通路，使STAT5 ( singal transducer and activator of transcrip tion 5)活化增强以及c /EBP和Pu11表达抑制33。说明Flt3/ITDs有利于Flt3二聚体的形成，引起配体非依赖性磷酸化，在AML的发病机制中起重要作用。沈 阳 医 学 院 学 报第12卷3.2 Flt3基因突变与AML预后 近年来大量临床研究表明，Flt3/ITDs与AML预后密切相关。Gale等30的结果显示Flt3/ITDs突变阳性AML患者与阴性组比较外周血WBC计数显著增高，CR 率显著降低，化疗相关死亡率高，复发危险增高，

13、无病生存率、无事件生存率及总生存率均显著降低。我们采用PCR方法联合序列检测伴有或不伴有染色体易位的AML患者Flt3基因突变情况，结果显示：46例伴有染色体易位患者Flt3基因表达阳性率67.39%，其中Flt3/ITDs阳性率分别为26.09%；伴有染色体易位Flt3/ITDs阳性患者外周血白细胞、血红蛋白、血小板、骨髓粒细胞比例虽与不伴有染色体易位Flt3/ITDs突变阳性患者基本相似，但平均生存时间明显降低，仅为(8.91.5)个月34。如Flt3/ITDs阳性行自异体基因造血干细胞移植的AML患者无病生存率明显提高35。提示Flt3/ITDs既可作为预测AML预后的一个重要指标，也可

14、以指导临床治疗。3.3 Flt3基因突变与AML微小残留病灶检测 随着急性白血病化疗方案的改善和造血干细胞移植的进展，急性白血病的完全缓解(CR)率明显提高。然而仍有许多CR患者在数年内复发，其主要原因是血液学CR后体内仍残留106109白血病细胞，称为微小残留病(minimal residual disease，MRD)。现在普遍认为MRD是血液学CR乃至持续完全缓解(CCR)期间白血病复发的根源。近年来分子生物学技术的发展，为常规骨髓形态学检查难以检测的MRD提供了新方法，然而目前尚缺乏合适的MRD的检测指标。Flt3/ITDs是与AML发生及预后相关的一种重要因子，可望成为MRD检测的重

15、要标志物。 Schnittger等36分析1 003例AML患者，对34例Flt3/ITDs阳性患者进行多次检测Flt3/ITDs后认为大部分患者Flt3/ITDs为唯一可检测的标志，且与临床阶段、FISH、PCR结果有较好的相关性，4例复发患者检测Flt3/ITDs比其他方法提前23个月检测到复发，认为Flt3可作为MRD检测标志。我们用Flt3基因作为AML的分子标志，通过PCR技术跟踪了AML完全缓解后的MRD，结果表明：PCR技术检测Flt3基因的最低检出值为100 pg；Flt3基因阳性AML患者，经标准治疗后，半数左右的患者达到CR，其中绝大部分患者Flt3基因表达减弱或转为阴性；

16、AML患者达CR后Flt3基因表达持续阳性或转阴后再次出现阳性，提示将发生复发37。说明在完全缓解期追踪检测Flt3并分析其变化极为重要，Flt3转为阴性或长期持续阴性者预示能获得长期无病生存。4 结语 Flt3基因突变是AML中最常见的基因异常，与AML发生有着密切关系。Flt3/ITDs有望成为一种新的生物标志物，用于AML预后不良和MRD判定，并可能成为AML治疗的新靶点。【参考文献】 1Rosnet O， Marchetto S， deLapeyriere O， et al. Murine Flt3， a gene encoding a novel tyrosine kinase re

17、ceptor of the PDGFR/ CSF1R familyJ.Oncogene， 1991， 6：16411650.2Matthews W， Jordan CT， Wiegand GW， et al. A receptor tyrosine kinase specific to hematopoietic stem and progenitor cell-enriched populationsJ.Cell， 1991， 65：11431152.3Abu-Duhier FM， Goodeve AC， Wilson GA， et al. Genomic structure of huma

18、n Flt3： implications for mutational analysisJ.Br J Haematol， 2001,113：10761077.4Griffith J， Back J， Faerman C， et al. The structural basis for auto inhibition of Flt3 by the juxtamembrane domainJ.Mol Cell， 2004， 30：169178.5Sargin B， Choudhary C， Crosetto N， et al. Flt3-dependent transformation by in

19、activating c-Cbl mutations in AMLJ.Blood， 2007， 110 (3)：10041012.6Wang Jie， Wang Tong， Li Shu， et al. Flt3/ITD mutation in pediatric leukemia and its clinical significanceJ.Chinese Journal of Cancer， 2007， 26(1)：5863.7Chen W， Huang Q. Detection of Flt3/ITD， JAK2(V617F) and NPM1 gene mutations in chr

20、onic myelomonocytic leukemiaJ.Leuk Res， 2009， 33 (11)：207209.8Huang Q， Chen W， Gaal KK， et al. A rapid， one step assay for simultaneous detection of Flt3/ITD and NPM1 mutations in AML with normal cytogeneticsJ.Br J Haematol， 2008， 142(3)：489492.9Meshinchi S， Stirewalt DL， Alonzo TA， et al. Structura

21、l and numerical variation of Flt3/ITD in pediatric AMLJ.Blood， 2008， 111(10)：49304933.10Meshinchi S， Appelbaum FR. Structural and functional alterations of Flt3 in acute myeloid leukemiaJ.Clin Cancer Res， 2009， 15(13)： 4263 4269.11Hasan SK， Sazawal S， Dutta P， et al. Impact of Flt3 internal tandem d

22、uplications on Indian acute promyelocytic leukemia patients： prognostic implicationsJ.Hematology， 2007， 12(2)：99101.12Gale RE， Green C， Allen C， et al. The impact of Flt3 internal tandem duplication mutant level， number， size， and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult pati

23、ents with acute myeloid leukemiaJ.Blood， 2008， 111(5)：27762784.13Kim KT， Baird K， Davis S， et al. Constitutive Fms-like tyrosine kinase 3 activation results in specific changes in gene expression in myeloid leukaemic cellsJ.Br J Haematol， 2007， 138(5)：603615.14Sallmyr A， Fan J， Datta K， et al. Inter

24、nal tandem duplication of Flt3 (Flt3/ITD) induces increased ROS production， DNA damage， and misrepair： implications for poor prognosis in AMLJ.Blood， 2008， 111(6)：31733182.15Kang HJ， Hong SH， Kim IH， et al. Prognostic significance of Flt3 mutations in pediatric non-promyelocytic acute myeloid leukem

25、iaJ.Leuk Res， 2005， 29(6)：617623.16Grundler R， Miething C， Thiede C， et al. Flt3-ITD and tyrosine kinase domain mutants induce-distinct phenotypes in a murine bone marrow transplantation modelJ. Blood， 2005， 105(12)：47924799.17Yamamoto Y， Kiyoi H， Nakano Y， et al. Activating mutation of D835 within

26、the activation loop of Flt3 in human hematologic malignanciesJ.Blood， 2001， 97(8)：24342439.18Lu Y， Kitaura J， Oki T， et al. Identification of TSC-22 as a potential tumor suppressor that is upregulated by Flt3-D835V but not Flt3-ITDJ. Leukemia， 2007， 21(11)：22462257.19Scholl S， Krause C， Loncarevic I

27、F. Specific detection of Flt3 point mutations by highly sensitive real-time polymerase chain reaction in acute myeloid leukemiaJ.J Lab Clin Med， 2005， 145(6)：295304.20Reindl C， Spiekermann K. From kinases to cancer： leakiness， loss of autoinhibition and leukemiaJ.Cell Cycle,2006， 5(6)：599602.21Neben

28、 K， Schnittger S， Brors B， et al. Distinct gene expression patterns associated with Flt3-and NRAS-activating mutations in acute myeloid leukemia with normal karyotypeJ.Oncogene， 2005， 24(9)：15801588.22Taketani T， Taki T， Sugita K， et al. Flt3 mutations in the activation loop of tyrosine kinase domai

29、n are frequently found in infant ALL with MLL rearrangements and pediatric ALL with hyperdiploidyJ.Blood， 2004， 103(3)：10851088.23Smith CA， Fan G. The saga of JAK2 mutations and translocations in hematologic disorders： pathogenesis， diagnostic and therapeutic prospects， and revised World Health Orga

30、nization diagnostic criteria for myeloproliferative neoplasmsJ.Hum Pathol， 2008， 39(6)：795810.24Meshinchi S， Alonzo TA， Stirewalt DL， et al. Clinical implications of Flt3 mutations in pediatric AMLJ. Blood， 2006， 108(12)：36543661.25Stirewalt DL， Meshinchi S， Kussick SJ， et al. Novel Flt3 point mutat

31、ions within exon 14 found in patients with acute myeloid leukaemiaJ.Br J Haematol， 2004， 124(4)：481484.26Vempati S， Reindl C， Wolf U， et al. Transformation by oncogenic mutants and ligand-dependent activation of Flt3 wild-type requires the tyrosine residues 589 and 591J.Clin Cancer Res， 2008， 14(14)：44374445.27Reindl C， Bagrintseva K， Vempati S， et al. Point mutation in the juxtamembrane domain of Flt3 define a new class of activating mutations in AMLJ.Blood， 2006， 107 (9)：37003707.28Mattison RJ， Ostler KR， Locke FL， et al. Impli