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1、杜汪洋分子标记技术在植物群体遗传学研究中应用滨州学院学年论文题 目分子标记技术在植物群体遗传学研究中的应用系 （院）生命科学系专 业生物技术 班 级 生物技术13级本科1班学生姓名杜汪洋 学 号1314120209指导教师赵凤娟 职 称副教授 二一五年六月二十日独 创 声 明本人郑重声明：所呈交的学年论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果由本人承担。 作者签名: 二一五年 月

2、日学年论文使用授权声明本人完全了解滨州学院关于收集、保存、使用学年论文的规定。本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其它复制手段保存论文；同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布论文的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。（保密论文在解密后遵守此规定）作者签名: 二一五年 月 日 分子标记技术在植物群体遗传学研究中的应用摘要认识到生物个体之间DNA序列差异并以此作为标记的分子标记技术研究始于1980年，之后随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术也得到迅速发展，与传统的遗传标记相比，DNA分子标

3、记有很多优点:(1)分子标记数量多，在同一基因座位上有较多的复等位基因;(2)分子标本身无害，对重要的经济性状很少有不良效应;( 3)分子标记的多态性可在个体、组织器官及细胞水平上进行检测，不受环境条件的限制。现在DNA标记技术已有数十种，它们被广泛应用于作物遗传育种、基因组作图、基因定位、植物亲缘关系鉴别、基因库构建。基因克隆的等方面。本文仅就分子标记技术的类型、特点以及它在植物群体遗传学中的应用进行阐述。窗体顶端窗体底端关键词： 分子标记技术；遗传学；应用Molecular marker technologyin the adoption of plant population genet

4、icsAbstract Recognition of the differences between the DNA sequence and the molecular marker technique as a marker for the study of the molecular markers of the individual organisms began in 1980,With the development of molecular biology technology,DNA molecular marker technology has also obtained t

5、he rapid development, compared with the traditional genetic markers and DNA molecular markers have many advantages: (1) molecular marker number and have more alleles at the same locus; (2) molecules were harmless. On one of the most important economic traits in very few has adverse effect; (3) molec

6、ular marker polymorphism can be on the individual, organ and tissue and cell level were detected, is not limited by environmental conditions. Now there are dozens of DNA markers, they are widely used in Crop Genetics and breeding, genome mapping, gene mapping, genetic relationship identification, ge

7、ne pool construction. Gene cloning and so on.In this paper, the types, characteristics and applications of molecular markers in plant population genetics are described in this paper.Key words: Molecular marker technology; Genetics; Adoption目 录引言 1第一章 分子标记技术 21.1分子标记的类型 21.1.1基于分子杂交技术的分子标记 2 1.1.2基于P

8、CR技术的分子标记 3第二章 内容 52.1 构建遗传图谱 52.2 亲缘关系和遗传多样性的研究 52.3 DNA 指纹库的建立 52.4 数量性状基因位点（QTL）的分子标记辅助选择 6第三章 结论和建议 6参考文献 7引 言 近年来，分子生物技术的发展为植物育种改良提供了一种基于 DNA 变异的新型遗传标记DNA 分子标记。DNA 分子标记研究与应用的迅速发展为植物遗传育种注入新的活力，并使传统育种技术发生了深刻的变化。DNA 分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性 DNA 片段，也称为DNA 的指纹图谱。DNA 分子标记的研究始于 1980 年，现已有数十种标记

9、技术。与传统的遗传标记相比，DNA分子标记有很多优点。以 PCR 为基础的 DNA 指纹技术大大加快了 DNA 分子标记的研究和利用，广泛应用于植物遗传育种、高密度遗传图谱的构建、基因定位和克隆、植物亲缘关系鉴别及遗传多样性研究、分子标记辅助选择育种等领域。 第一章 分子标记技术1.1 分子标记技术的类型1.1.1 基于分子杂交技术的分子标记 这类标记是基于DNA序列的差异，通过电泳技术分离不同个体DNA的限制内切片段后，利用标记探针进行DNA-DNA杂交，来揭示所研究个体DNA的多态性。(1) RFLP标记 RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。该方法所产生的多态性是由于限制性内切酶酶切位

10、点或位点间DNA区段发生突变造成的。由于不同的限制性内切酶各有其特异的识序列和切割位点，特定物种的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶切后，会产生一些分子量不同的限制性DNA片段。在生物的遗传进化中，由于基因组内出现的由转换、插入、倒位、易位、缺失等导致的各种变异会引起酶切位点的改变，因此，特定的DNA片段被酶切后可以产生特定大小的不同DNA片段，及特有分子指纹图谱，反映出遗传多态性。RFLP通常分析步骤是:DNA的提取、DNA的限制性内切酶酶切、用DNA片段的凝胶电泳分离、DNA片段的Southern杂交、分析结果。对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态性差异检测在1980年之前就己出现由于

11、线粒体和叶绿体DNA较小，前三个步骤就完全可能检测出DNA片段的差异，所以往往不必要后面的几个步骤(黎裕等，1999)。真菌线粒体DNA不含内含子和基因间隔区，很少经历重组，进化速度较核DNA快，其RFLP分析对真菌种间或种内分类灵敏度高。 RFL P具有以下优点:(1)变异丰富;(2)比形态学更变异稳定，其表现不受环境条件影响;(3)比生化变异范围更广泛，区分能力更强;(4)无显隐性之分，均为共显性，非等位基因间无上位效应;(5)其它变异均是从表型或基因作用产物来研究遗传和变异的，而RFLP则是直接研究基因的构成;(6)构建连锁图时要比传统方法快得多;(7)可探测到数量性状基因位点(周洪生，

12、1992)0(2) VNTR标记在生物体存在的DNA串联重复序列区域中，小卫星(Minisatellites)串联重复序列基本单元的核普酸数目为1575个，微卫星(Microsatellites)重复序列基本单元的核普酸数目为16个。小卫星和微卫星合称为重复数可变串联重复(VNTR)标记。VNTR多位于基因的非编码区，广泛分布，其基本原理与RFLP大致相同，只是其限制性内切酶的酶切位点必须位于重复序列之外，且必须采用小卫星序列或微卫星序列作为分子杂交探针。VNTR标记的快速鉴定技术有两种:对已知序列不太长的VNTR座位，可利用PCR扩增产物电泳结果比较其长度变异;对于太长的VNTR座位，则只能

13、通过Southern杂交来检测。1.1.2 基于PCR技术的分子标记 PCR技术又叫多聚酶链式反应技术，它采用分子技术模拟核酸在体内的复制，是1985年美国Cetue公司人类遗传学研究室Mullis等人首创的一项DNA扩增技术。PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核营酸存在的条件下，DNA聚合酶催化的体外DNA合成反应。PCR技术的特异性主要决定于引物和模板DNA结合的特异性。该技术以微量DNA样品为模板，在短时间内合成样品DNA的大量拷贝，结合适宜的检测技术可实现DNA样品的简易、快捷检测。目前广泛使用的分子标记技术大多基于PCR技术。(1) RAPD标记RAPD标记是由美国杜邦公司

14、的Williams和加利福尼亚生物研究所的Welsh等人创立的分子标记方法(Williams et al., 1990; Welsh and McClelland, 1990)。该方法使用短的(10个左右碱基)任意序列的寡核普酸片段作为引物，对模板DNA或RNA进行PCR扩增。由于引物结合位点DNA序列的改变以及引物结合位点之间DNA序列的改变均可导致扩增片段数目和长度的差异，可用普通电泳进行多态性显示和比较。 RAPD标记具有如下优点(1)引物通用性。设计的引物没有种属特异性，无需知道物种序列信息即可使用;(2)反应直接性。不需要克隆制备探针、作同位素标记和印迹杂交等预备性工作;(3)分析快

15、捷性。操作简便易行，设备相对简单;(4）高灵敏性。DNA用量极少，灵敏度高，特别适于检测种下变异;(5)对DNA纯度要求相对较低;(6)分析过程可实现程序化，用一套引物可得到大量RAPD分子标记，最后可以借助计算机进行统计分析。但是，RAPD不足之处也十分明显:(1)其标记为显性标记，不能完全反应个体间的遗传变异，无法鉴别纯合子与杂合子的差异(单倍体除外);(2) PCR扩增反应条件要求较高，结果重复性差;(3)每次反应提供的信息量少;(4)可能有假带出现，给实验结果分析带来困难(张日清等，2001)0 与RAPD原理类似的有DAF标记和AP-PCR标记。DAF标记所使用的引物一般为5-8个核

16、昔酸，比RAPD引物短，因而与DNA模板结合时具有更多的结合位点，扩增的条带数目更多，多态性更高，但其稳定性较差。AP-PCR标记所使用的引物通常为18-24核普酸，稳定性比RAPD好，但是多态性较差。(2) ISSR标记 ISSR标记是由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等首先提出的(Zietkiewicz et al.,1994)，该技术根据基因组内广泛存在的微卫星序列设计单一引物(引物通常16-18bp 3或S端通常锚定1-4个核营酸以增加扩增时的稳定性)，对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增，然后进行电泳、染色，根据谱带的有无及大小，来获得不同样品间的ISSR分子指

17、纹图谱。由于SSR广泛分布于真核生物基因组中，其重复单位和重复次数的变异非常丰富，因而ISSR可以检测到高的多态性。加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布了100条ISSR引物，研究者可以根据不同的材料进行选择 (张青林和罗正荣，2004)。ISSR不需要预先获得序列信息，仅采用半随机引物扩增，其产物多态性远比RFLP, SSR更加丰富，可以提供更多的关于基因组的信息，而且比RAPD技术更加稳定可靠，实验重复性更好(Gilbert et al., 1999;孙洪等，2005)。(3) SSR标记 简单重复序列(SSR)又称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，一般为以1 -6个碱基

18、为核心序列的串联重复序列(Beckmann et al, 1990 )。真核生物基因组中SSR的分布是广泛并随机的，大约每隔1050 kb就有1个SSR。它既可以存在于内含子中，又可存在于外显子中。在不同的生物体间，SSR的数量、重复次数和单位、拷贝数变异及染色体分布等有着很大的差别。由于基本核心序列的重复次数不同，因而在不同菌株的DNA间存在多态性。复制时的DNA链滑动是SSR多态性产生的首要原因( Strand et al., 1993 )。每个SSR座位两侧的序列一般比较保守，可用于设计特异引物扩增该SSR座位。 第二章 结果与分析2.1 构建遗传图谱 遗传图谱既是遗传研究的重要内容，又

19、是作物资源、育种及分子克隆等应用研究的理论依据和基础。遗传图谱可以为育种工作者提供关于某一物种完整详细的基本资料，可以很容易将所需要的基因定位，使育种目的性更强，效率更高。传统的形态和生化方法很难使遗传图精密，很难反映基因组的全部情况。但随着各种分子标记技术的发展和完善，为构建高饱和度的连锁图提供了有力的工具。目前已有 20 种蔬菜作物构建了遗传图谱。2.2 亲缘关系和遗传多样性的研究 基因型不同的品种或不同亲缘关系的物种，基因组内核苷酸序列存在差异，利用分子标记可以检测出不同品种间的多态性，这些多态性反映了被检测材料的遗传多样性。在分子图谱帮助下对品种之间的比较可覆盖基因组，大大提高了基因组

20、的可靠性。可用于品种资源的鉴定与保存，研究作物的起源和发展进化，杂交亲本的选择等。利用分子标记通过相关性、聚类等数量遗传学分析手段，还可以对不同亲缘种间的分类、遗传距离、系统发育、亲缘关系等进行研究，从而确定亲本之间的遗传距离，直到杂交育种亲本选配，减少杂交组合数，有效划分杂种优势群，为提高育种效率提高依据。2.3 DNA 指纹库的建立 同一物种的各个品种间存在着大量的多态性标记，如果某一品种具有区别于其他品种的独特标记即一些特异性 DNA 片段的组合就称为该品种的“指纹”。各品种的独特的指纹片段构成物种的 DNA 指纹库，它具有类似于人的指纹那样的高度个体特异性和稳定性。例如魏臻武利用 RA

21、PD 标记技术构建了 55 个苜蓿品种（系）的 DNA 指纹图谱，用于苜蓿品种鉴定。DNA 指纹在植物育种中具有广泛应用，例如：每个品种 DNA 指纹差异可直接提供与目标性状有关的 DNA 水平的信息，避免了环境的干扰，可以大大提高杂交育种中对亲本及后代理想单株的选择效率；通过检测品种是否具有该品种特有的指纹片段，可以有效地鉴定品种纯度与真伪、新品种登记和品种知识产权保护等。2.4 数量性状基因位点（QTL）的分子标记辅助选择 大多数重要的农艺性状均表现数量性状的遗传特点，如产量性状，成熟期，品质，抗旱性等。数量性状易受环境条件的影响，因此选择效果不好。传统育种方法进行数量性状选择周期长。近年

22、来，由于分子标记技术的发展，人们已可将复杂的数量性状进行分解，象研究质量性状基因一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL 是在高密度的遗传图图谱基础上，通过一定实验设计，获得分子标记，借助 Mapmarker 软件分析确定控制某一性状的基因在染色体上的位置。当目标性状由少数几个基因控制时用标记选择，对发掘遗传潜力非常有效。然而，当目标性质由多个基因控制时（如产量），由于选择的世代较多，加剧了标记与 QTL 位点重组，降低了标记选择的效果。第三章 结论和建议 综上所述，尽管分子标记有很多优点，但不同的分子标记技术仍存在各自的缺点，使其应用受到限制。但这些分子标记技术相互结合使用或能相互转化，

23、其多态性丰富的优点就将得以体现。随着分子生物学的发展，相信各种分子标记技术会逐步完善，或者出现新的分子标记技术，而成为生命科学的一种简便、快捷、高效的分析手段。另外，分子标记技术的应用，将使植物遗传图谱的密度和质量不断提高，在植物遗传育种领域具有更广阔的应用前景。参 考 文 献1蒋彩虹，王元英，孙玉合.SSR和ISSR标记技术应用进展.中国烟草科学，2007，28(28): 1-52黎裕，贾继增，王天宇.分子标记的种类及其发展.生物技术通报，1999 4:19-223肖扬. 几种新星分子标记技术在中国香菇种质资源遗传多样性研究中的应用D.华中农业 学,20094孙秀峰,陈振德,李德全. 分子标记及其在蔬菜遗传育种中的应用J. 山东农业大学学报(自然科学版),2005,02:317-321.5谭亮萍,吴朝林,曾化伟. DNA分子标记技术及其在蔬菜遗传育种研究中的应用J. 长江蔬菜,2007,11:35-396张新叶,黄发新,张亚东. 分子标记技术在林木遗传育种中的应用J. 湖北林业科技,2000,S1:73-77.