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1、全国优秀博士学位论文论文中英文摘要作者姓名：王连荣论文题目： dnd 基因簇对细菌 DNA 骨架的磷硫酰化硫修饰作者简介：王连荣，女，1980年03月出生，2003年09月师从于上海交通大学邓子新教授，于2008年3月获博士学位。中 文 摘 要本研究致力于探索 DNA 硫修饰的发生方式，解析这种 “前所未见” 的生理修饰的精细化学结构，也为后续 DNA 硫修饰的生物途径、生物学意义等研究提供方向性指导。本学位论文成功地揭示了细菌中 dnd 基因簇可以将硫原子整合到 DNA 的磷酸骨架上, 形成序列特异性、空间构象专一性的磷硫酰化修饰，揭示这种特异的生理修饰存在于不同的细菌中,并导致了电泳过程中

2、的DNA降解表型。 DNA降解表型 (DNA degradation，Dnd) 最初是从变铅青链霉菌中观察到的：电泳过程中，变铅青链霉菌的染色体不再是清晰的 DNA 条带，而是呈现降解状态。进一步研究发现，这是由于 DNA 上发生了一种异常的复制后修饰，导致 DNA 在电泳过程中容易遭受阳极产生的 Tris 过酸衍生物位点特异性攻击而产生双链切割反应。最近，研究者发现，这种异常修饰实际上是与 dnd 基因簇相关的 DNA 硫修饰。通过放射性 35S 喂养，在具有 dnd 同源基因簇/Dnd 表型的变铅青链霉菌 66，阿维链霉菌 NRRL8165 和荧光假单胞菌 Pf0-1 的 DNA上检测到放

3、射性硫信号，揭示出除了碳、氢、氧、氮和磷，DNA 上还存在第六种元素硫。 本研究首先通过 35S 半胱氨酸喂养具有 dnd 同源基因簇/Dnd 表型的基因工程大肠杆菌，并分离到放射性硫标记的基因组 DNA。随后，把基因组 DNA 酶解、去磷酸化成单脱氧核糖核苷，并利用高压液相色谱分离，结合液体闪烁计数器对每分钟分离组分的放射性强度进行检测，从而对硫修饰 DNA 分子的保留时间进行了精确定位，由此展开了对这种 “前所未见”的硫修饰 DNA 化学结构的探索。基于硫修饰 DNA 分子在高压液相色谱中的“位置”，继而采用高压液相色谱-质谱联用技术对其组分进行分析，发现了一组可能来自硫修饰 DNA 分子

4、特征性质谱信号 597，446，348，152 和 136。其中，152 是特征性的带有一个正电荷的鸟嘌呤碱基 (G) 的核质比；136 则是特征性的带有一个正电荷的腺嘌呤碱基 (A) 的核质比。提示我们在经过核酸酶的酶切后，可能的硫修饰分子仍然同时包含腺嘌呤和鸟嘌呤。结合这组核质比信号以及该分子对核酸酶具有抗性的特征，提出 DNA分子的硫修饰可能发生在 DNA 骨架上，磷酸二酯键发生磷硫酰化成为硫代磷酸二酯键，并存在于脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间，即 5-d(GPSA)-3 或者 5-d(APSG)-3，暗示 DNA硫修饰不像人们最初预料的那样发生在相对活跃的 DNA碱基上。对基因工程大肠杆菌中硫

5、修饰 DNA 分子和合成标准品进行了高压液相色谱-质谱联用、高精度质谱、紫外特征吸收色谱以及四级质谱断裂模式对比分析，最终揭示出 DNA硫修饰的化学本质，证实基因工程大肠杆菌中硫修饰 DNA 分子的确以硫代磷酸二酯键的方式、按 5-3 的方向序列特异性发生在脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间5-d(GPSA)-3。进一步利用对底物具有空间构象选择性的核酸酶对大肠杆菌中硫修饰 DNA 分子 5-d(GPSA)-3 进行水解；结合其在高压液相色谱中的保留时间提出 DNA 硫修饰不但具有序列选择性，还具有空间构象专一性，特异性地以 RP 构象存在。在 Dnd 表型的发现菌变铅青链霉菌中，利用放射性硫标记、高压液

6、相色谱-质谱、紫外特征吸收色谱以及高精度质谱分析，发现 DNA 硫修饰在不同菌属中具有不同的序列选择性。不同于大肠杆菌中的 5-d(GPSA)-3 RP，链霉菌的 DNA 硫修饰同样以硫代磷酸二酯键形式、RP 空间构象存在，但序列特异性不同，发生在两个脱氧鸟苷之间5-d(GPSG)-3。 目前已经在 100 多种微生物中观察到 Dnd 表型，并在许多广泛分布的细菌中检测到 dnd 同源基因簇的存在。通过对来自截然不同栖息地的厌氧菌 Geobacter uraniumreducens Rf4、遍在远洋杆菌 Candidatus Pelagibacter ubique HTCC1002、荧光假单胞

7、菌 Pseudomonas fluorescens Pf0-1、希瓦氏菌 Shewanella pealeana ATCC 700345、海洋细菌 Hahella chejuensis KCTC 2396，以及海洋杆菌 Oceanobacter sp. RED65 进行序列比对发现这些细菌的基因组中都具有 dnd 同源基因簇，包含 5 个或 4 个 dnd 同源基因。结合高压液相色谱-质谱联用分析，逐一鉴定出这些细菌都发生了 DNA 硫修饰，都以5-d(GPSA)-3 RP 或者5-d(GPSG)-3 RP 的方式在DNA骨架上发生磷硫酰化。说明 DNA 硫修饰不是偶然发生的生命现象，是广泛存

8、在的具有序列选择性、空间构象专一性的新型修饰系统。体外化学合成的硫代磷酸二酯键对很多核酸酶的酶解作用具有抗性，结合 DNA 硫修饰是一种复制后修饰、序列特异性、空间构象专一性的生理特性，提出硫修饰很可能是细菌的一种自我保护机制，通过对自身 DNA进行磷硫酰化修饰，保护 DNA 免受某些核酸酶的酶解；另外，细菌还可以利用硫修饰为标志对自身和外源 DNA 进行区分，针对性地分辨、清除入侵的 DNA 分子，维护自身的遗传稳定性。 dnd 系统是被多种细菌所采纳、代表着完全不同于DNA 甲基化的新型 DNA 修饰体系。 本学位论文还揭示了DNA 磷硫酰化硫修饰导致了 Dnd 表型(电泳过程中的DNA降

9、解)。磷硫酰化的DNA由于受到电泳液中氧化物质的攻击而导致DNA骨架在磷硫酰化修饰处发生断裂，进而导致降解现象。本学位论文完成了对变铅青链霉菌 dnd 基因簇中的 DndB、DndC 和 DndE 蛋白的超量表达和纯化，以及对 DndA 蛋白活性半胱氨酸的定点突变，为下游酶学功能的探索奠定了基础。 综上所述， DNA 硫修饰的本质是DNA骨架上序列特异性、空间构象专一性的磷硫酰化修饰，DNA 硫修饰是一种不同于甲基化的新型的 DNA 修饰体系。DNA 硫修饰是迄今为止国际上唯一发现的发生在DNA骨架上的生理修饰。关键词： DNA 降解，dnd 基因簇，DNA 硫修饰，磷硫酰化，硫代磷酸二酯键D

10、NA sulfur modification-phosphorothioation of DNA backbone by bacterial dnd genesWang Lianrong ABSTRACTThe DNA degradation (Dnd) phenotype was originally observed during electrophoresis of genomic DNA from Streptomyces lividans and was thought to involve a post-replicative DNA modification that react

11、ed with a peracid derivative of Tris formed at the electrophoretic anode. This phenotype was more recently discovered to involve incorporation of sulfur into DNA of strains of S. lividans 66, S. avermitilis NRRL8165, and P. fluorescens Pf0-1 by 35S feeding experiment and to be governed by a five gen

12、e cluster, dndA-E in S. lividans. However, the precise chemical nature of DNA sulfur modification remained obscure although extensive effort had been made.Here we set out to define the chemical structure of the DNA sulfur modification by first isolating 35S labeled nucleosides from Dnd phenotype bac

13、terial strains E. coli B7A and E. coli DH10B(pJTU1238) cultured with 35S-cysteine. DNA isolated from these strains was hydrolyzed and dephosphorylated and the resulting nucleosides resolved by HPLC followed by scintillation counting to localize 35S-containing fractions. Having established chromatogr

14、aphic parameters for 35S-containing species, we next characterized the chemical properties of the molecules by LC-MS using the same HPLC conditions which revealed reproducible m/z values of 597, 446, 348, 152 and 136. These data suggested the presence of a G- and A-containing dideoxynucleotide struc

15、ture for the m/z 597 molecular ion, with loss of guanine yielding the ion at m/z of 446. The 16 mass unit increase over a canonical dG-dA dinucleotide, the expected masses for G and A released from the putative dinucleotide, and the nuclease resistance of the putative dinucleotide species suggested

16、the presence of a sulfur atom in the sugar-phosphate backbone, most likely the phorphorothioate-containing species. The involvement of sulfur atom causes two stereoisomer of phosphorothioate bond, RP and SP.To corroborate the phosphorothioate structure and to define its stereochemistry, we employed

17、synthetic phosphorothioate-containing dideoxynucleotides 5-d(GPSA)-3 and 5-d(APSG)-3, each with the chiral RP or SP configuration of the phosphorous-sulfur bond. Of these model compounds, 5-d(GPSA)-3 RP had an HPLC retention time, high-resolution mass spectral characteristics and LC/MS(4) pattern id

18、entical to material observed in B7A and DH10B(pJTU1238). When DH10B(pJTU1238) and B7A genomic DNA were hydrolyzed with only snake venom phosphodiesterase (specific to RP configuration) and alkaline phosphatase, we could not detect either the RP or SP isomers of 5-d(GPSA)-3 by LC-MS. These results su

19、ggest that phosphorothioation of DNA by the Dnd modification system is at least stereo-selective for the RP configuration of the phosphorothioate. We thus conclude that the S-containing species from the B7A and DH10B(pJTU1238) DNA is a 5-d(GPSA)-3 dideoxynucleoside with an RP phosphorothioate bond.

20、While the present results do not allow us to conclude that the dnd-dependent phosphorothioation of G-A sequences in the E. coli strains occurs sequence specifically, an identical set of studies performed with Streptomyces lividans 1326, which displays the Dnd phenotype, revealed a 5-d(GPSG)-3 RP spe

21、cies. No phosphorothioate form could be detected in a mutant (ZX1) deficient in the dnd gene cluster. To verify that the phosphorothioate modification is indeed the basis for the Dnd phenotype, we performed an in vitro Tris-dependent DNA cleavage assay on the isolated native and syntheticd(GPSA) (Rp

22、) species and on the synthetic d(GA) dinucleotide as a negative control. Both native and synthetic d(GPSA) (Rp), but not d(GA), degraded as expected for the Dnd phenotype.The widespread presence of the phenotype in more than 100 microbe isolates and of sets of dnd gene homologs in diverse microorgan

23、isms suggests that the phosphorothioation may represent a type of restriction modification system. In addition to the structural and replicative compatibility of phosphorothioate-containing DNA molecules, the known resistance of phosphorothioate linkages in nucleic acids to a variety of nuclease act

24、ivities, and the post-replicative and site-specific nature of the modification suggest that phosphorothioates inserted by the dnd modification system might play a protection mechanism for specific DNA against nucleases. To our knowledge, unlike other DNA or RNA modification systems, DNA phosphorothi

25、oation by dnd modification system is the first physiological modification on the DNA backbone.Key words: DNA degradation, Dnd phenotype, dnd gene cluster, DNA sulfur modification, phosphorothioate bond, phosphorothioation论文中英文摘要作者姓名：唐茹琦论文题目：精神分裂症相关基因的连锁不平衡分析和功能研究作者简介：唐茹琦，女，1981年02月出生，2003年09月师从于上海交通

26、大学贺林教授，于2008年06月获博士学位。中 文 摘 要精神分裂症是以基本个性改变，思维、情感、行为的分裂，精神活动与环境的不协调为主要特征的严重的精神疾病，在人群中的发病率约为1%。流行病学研究表明，精神分裂症是由遗传和环境因素的共同作用而发生的一种复杂疾病，其中遗传因素发挥主要作用。然而精神分裂症的遗传模式相当复杂，不同于孟德尔遗传规律，可能涉及多个中效和微效基因，未知的环境因素可能也有一定的影响，再加上该疾病诊断上的不确定，缺少生物学标记，这些都使得精神分裂症的遗传学研究变得更加困难。连锁分析和连锁不平衡分析是近二十年寻找复杂疾病致病基因的主要方法。NRG1, G72, DTNBP1等

27、精神分裂症热门候选基因就是结合连锁分析和连锁不平衡分析方法确定的。因此，用类似的方法可能是寻找其它精神分裂症易感基因的有效途径。此外，在这些研究发现被完全肯定之前，确凿无疑的重复研究仍然是最重要的。本文对精神分裂症易感基因Epsin 4中的6个多态性位点在中国汉族核心家系中进行连锁不平衡分析。通过传递不平衡检验，尽管没有发现单个遗传标记达到显著性水平（P=0.05），却发现由这些位点组成的单倍型和精神分裂症显著相关（global P=0.002）。因此，我们的结果暗示了在Epsin 4基因5区域可能存在着能影响疾病风险的功能位点，从而进一步证实了Epsin 4是精神分裂症的易感基因。研究报道P

28、IK3C3基因核心启动子区域的两个多态性位点可能是精神分裂症潜在的功能变异。我们在中国汉族散发人群中对这两个位点进行病例-对照分析，包括556个病人和563个正常对照。研究结果发现这两个位点在病人和正常人中等位基因的频率有显著性差异。其次，我们用荧光素酶报告基因系统检测发现这两个位点组成的单倍型对基因转录活性有显著性影响（P=0.002），Hap T/C比Hap C/-的转录活性高出20%。综合连锁不平衡分析和荧光素酶报告基因的实验结果，我们支持PIK3C3是精神分裂症的易感基因。基于中国汉族人群的病例-对照分析和核心家系的研究均支持IL-10基因启动子区的遗传变异和精神分裂症关联。为此我们开

29、展功能研究来检测这些位点是否是精神分裂症的功能变异。首先使用凝胶迁移检测和疾病关联的SNP是否会影响某些转录因子的结合。其次，采用荧光素酶报告基因的方法检测这三个SNPs组成的单倍型对基因转录活性的影响。然而以上两个实验都没有得到阳性结果。因此，我们认为这些SNPs是和潜在的功能位点处于连锁不平衡状态。本论文在连锁不平衡分析的基础上，结合功能研究对Epsin 4、PIK3C3和IL10三个精神分裂症相关基因进行研究，为精神分裂症分子遗传学研究提供了新的证据。关键词： 精神分裂症，连锁不平衡分析，病例-对照研究，传递不平衡检验，功能研究LINKAGE DISEQUILIBRIUM AND FUN

30、CTIONAL STUDY OF SCHIZOPHRENIA RELATED GENESTang Ruqi ABSTRACTSchizophrenia is a severe psychiatric disorder that affects about 1% of the worlds population. The disorder is characterized by psychotic symptoms in particular delusions and hallucinations, reduced interest and drive, altered emotional r

31、eactivity and disorganised behaviour. It is suggested that schizophrenia is contributed by genetic and environmental factors, and genetic factors play a dominant role. Nevertheless, due to the lack of Mendalian forms, the heritable model of schizophrenia is very complex. There are multiple susceptib

32、ility genes, each of small effect, which act in conjunction with environmental factors. Moreover, schizophrenia is absent of a diagnostic neuropathology or other biological marker. Therefore, the search for chromosome loci and genes have been slow and frustating.During the past two decades, linkage and association studies have been the main approaches in searching for complex disease genes. To date, there have been several successful examples where candidate genes such as NRG1, G72, DTNBP1 were identified through association analysis targeting chromoso