春《细胞生物学实验》有图教案.docx

1、春细胞生物学实验有图教案教 案20122013学年 第2学期课 程 名 称细胞生物学实验二级学院(部)海洋学院系或教研室海洋科学教研室任 课 教 师徐淑庆职 称副教授授课对象海洋本112、水产本111钦州学院2013年3月细胞生物学实验指导目 录1前 言 22细胞生物学实验守则 33生物绘图必须注意的问题 4实验一：细胞形态结构的观察与显微测量 5实验二：血涂片的制备和细胞计数 10实验三：观察黑藻的叶绿体和细胞质流动 16实验四：DNA的显示Feulgen反应 17实验五：叶绿体的分离与荧光观察 13实验六：血型的鉴定 19实验七：细胞膜的通透性 21实验八：植物凝集素对红细胞的凝集作用 2

2、4实验九：植物细胞的有丝分裂 26实验十：聚乙二醇（PEG）介导的鸡血细胞融合 28一、 前 言近几年来，随着细胞生物学学科的迅猛发展，教学内容更新较快。细胞生物学被作为主干基础课列入了高等院校生命科学各专业的教学计划中，并且实验课单独作为一门课程开出。为了提高教学水平，反映出本学科更具科学性、先进性和实用性的实验内容，根据教学大纲的要求和课程设置，同时根据本校教学实验条件，在参阅中外相关文献，学习兄弟院校的教学经验和资料的基础上，编写了本实验讲义。 本册子为本校海洋科学学院相关专业细胞生物学实验指导书，同时可作为其他相关专业学生参考。书中引用了其他作者部分内容，在此致以诚挚的谢意。二、细胞生

3、物学实验守则一、细胞生物学实验课的目的和要求 1细胞生物学实验是整个细胞生物学教学的重要组成部分，既与课堂讲授的理论部分有密切关系，又有它独特的目的和要求。 2实验是科学理论的实践与论证，通过实验，使学生了解细胞生物学知识和理论的由来。掌握细胞生物学的基本实验方法和技能，锻炼学生的动手能力。 3通过实验，培养学生观察、比较、分析、综合等科学思维能力，以及独立工作的能力和实事求是的科学作风。 4使学生掌握书写实验报告、生物绘图、制表等方面的基本知识。 二、实验的进行程序和要求 1预习：学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解

4、。 2讲解：教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3独立操作与观察：除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。 4示教：每次的实验都备有示教内容，目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5作业：实验报告必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。学生应认真阅读教师批改后的实验报告，不断提高实验质量。 6小结：实验结束后，由师生共同小结本次实验的收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1每次上课前，必须

5、认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2上实验课时必须携带实验指导、实验报告纸及绘图文具等，按规定入座。 3实验前，要认真检查所用仪器、药品是否完好、齐备，如有缺损应及时向教师报告，自己不得随意调换标本、仪器等。没有得到教师的允许，不能动用实验室其它非本次实验所用的仪器设备。4实验时要遵守纪律。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧哗，不准在实验室吃食和会客。 5实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。使用显微镜检查非永久片时，要特别小心。防止染料或试剂沾污镜头和镜台，不要用高级显微镜观察非永久片。操作要正规，观察要认真仔

6、细，及时完成实验报告。 6要爱护仪器、标本和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告，并主动登记、说明情况。凡是有化学药品的试剂和溶液瓶上，必须贴上标签，注明名称、成份、浓度、配制日期。 7实验结束后，应清理实验台面，所有液体废物、酸类、染料等，应倒在废物缸内，不能倒在水槽中。认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。三、生物绘图必须注意的问题绘图是生物实验报告的一种重要形式，基本要求如下：1准备好3H（HB）铅笔、橡皮、刀、尺子及绘图纸，将绘图纸放在右边。2绘图时，特别注意观察物的形状、各部分的位置

7、、比例和毗邻关系。3每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得，通常图占报告纸左上方2/3 的面积，并考虑注字的位置。4观察清楚后，选择典型的细胞或组织，左眼看显微镜，右眼配合右手，先用铅笔在纸上轻轻描出轮廓，使形状正确，然后再用清晰的线条绘出，线条粗细要均匀不要重复。注意纸面的整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。5用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗和立体感一律以点的疏密来表示（深色用密集的黑点，浅色用稀疏的黑点），点要圆而一致，不得涂暗影或进行其它美术加工。6图绘好后，要在图的右侧注明各部分结构名称，引线用直尺画出，间隔要均匀，长短适度，各引线不能交叉，图注要尽量排列整齐，注字要用正楷。7每

8、一个图下面要注明图的名称、放大倍数。8绘图纸上所有注字（包括姓名、实验日期、题目等）均用铅笔书写，不能用其他笔写。实验一 细胞形态结构的观察与显微测量（必做） 一、实验目的：1掌握临时装片的制作方法；2熟悉动、植物细胞的基本形态结构；3掌握显微测量的原理和方法；4掌握生物绘图的方法。二、实验原理：细胞是生物体结构功能的基本单位，其形态与功能相适应。不同类型的细胞具有不同的大小、形态和结构，以适应其功能。通过制作临时装片，可以观察很多细胞的结构，并借助测微尺测量细胞直径，进而获得细胞的体积。三、实验仪器、试剂及材料：仪器：光学显微镜（每人1台），人血涂片、载玻片、盖玻片、剪刀、镊子、牙签、滴管、

9、测微尺（镜台测微尺；目镜测微尺），试剂：1%碘液、瑞氏染液（如果观察血细胞，则需瑞氏染液）材料：洋葱、红辣椒、紫色落葵（或紫罗兰）、血细胞悬液、口腔上皮细胞四、实验步骤：1洋葱鳞茎表皮细胞的观察在载玻片中央滴一滴1%碘液 用刀片在洋葱鳞茎叶内表面画一个1mm2的方框 用镊子撕下表皮 在碘液中铺平 盖上盖玻片 用吸水纸吸去多余碘液（还可帮助排除气泡） 显微镜下观察（同法制红辣椒表皮细胞装片）2人口腔黏膜上皮细胞的观察在载玻片中央滴一滴1%碘液 用牙签刮取上皮细胞 在1%碘液中搅动分散细胞 染色1分钟 盖上盖玻片，观察。3血细胞观察（见细胞生物学实验教程第9页）在载玻片右端滴一滴血 用另一张载玻片

10、以3045度角（两玻片夹角），紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推， 推移血液成均匀薄膜 滴一滴瑞氏染液染色13分钟， 自来水冲洗染液，吸水纸吸干， 镜检。图21 血涂片的制备五、测微尺的使用 (一)原理：测微尺由目镜测微尺和镜台测微尺组成。目镜测微尺位于目镜内，为玻璃圆片，圆片中央有一条带刻度的直线；镜台测微尺是一块载玻片，中央圆形区域内有一带刻度的直线，长1毫米(1000m)，被分为100格，每格长度是10微米。(二)方法 1.将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测微尺使两尺平行，记录镜台测微尺若干格所对应的目镜测微尺的格数。2.按下式求出目镜测微尺每格代表的长度

11、目镜测微尺每格代表的长度(m)=镜台测微尺的若干格数/对应的目镜测微尺的格数10目镜测微尺镜台测微尺目镜测微尺每格的长度= ? 正确答案: 2.5 m 3.将镜台测微尺取下，换上口腔黏膜上皮细胞或血细胞涂片，用目镜测微尺测量出其长度和宽度。 为什么要测量5-10个细胞的数据，再计算平均值？4.计算细胞、细胞核体积的公式：圆 形 V=4/3r 3(r为半径) 椭圆形 V=4/3ab2(a、b分别为长、短半径) 核质比 ND=Vn(VcVn)(Vn为核的体积，Vc是细胞的体积)【作 业】1、分别求出使用低倍镜(10X)，高倍镜(40X)时目镜测微尺每格代表的长度： 低倍镜：目镜测微尺每格代表的长度

12、= lO(m)= m 高倍镜：目镜测微尺每格代表的长度= lO(m)= m2、绘制所观察的人口腔上皮细胞并注明基本结构。3、计算人口腔上皮细胞的核质比例。 五、思考题：1结合实验分析细胞形态结构的特点及其与功能的适应性。2测量细胞时应注意哪些问题？3绘图：显微镜下观察的各种细胞形态。1洋葱表皮细胞 2口腔黏膜上皮细胞3各种血细胞红细胞：RBC （男性）M: 4.2 5.51012/L（女性）F: 3.55.01012 /L白细胞：WBC 数量 410109/L 中性粒细胞 50-70% 嗜酸性粒细胞 0.5-3% 嗜碱性粒细胞 0-1% 淋巴细胞 20-30% 单核细胞 3-8% 血小板：Bl

13、ood platelet: 100300109/L血小板 骨髓巨核细胞胞质脱落形成的胞质小块，即血小板 透明区： （周边）均质，浅兰色。 颗粒区： （中央）含紫红色血小板颗粒。 1.2.3.单核细胞 4.5.6.淋巴细胞 7.8.9.10.11.中性粒细胞 17.血小板12.13.14. 嗜酸性粒细胞 15.嗜酸性粒细胞 16.红细胞 17.血小板 a嗜酸性粒细胞 N中性粒细胞 嗜中性粒细胞1嗜酸性粒细胞：0.53%，1015m。吞噬免疫复合物，减轻过敏反应。胞核：常分为2叶。如同眼镜 胞质：粗大、均匀的嗜酸性颗粒。 1嗜酸性粒细胞 2中性粒细胞2中性粒细胞：5070%1012m，噬菌，杀菌形

14、成脓细胞，急性炎症时数量增加。 胞核：25叶或杆状核。 胞质：细小，紫红色或淡红色颗粒，嗜天青颗粒特殊颗粒。3、嗜碱性粒细胞：01%，1012m。参与过敏反应。 胞核：不规则，常被颗粒遮盖 胞质：大小不等、分布不均、覆盖核上的嗜碱性颗粒。4、单核细胞：占38%，1420m。参与免疫和造血调控。胞核：肾形或马蹄形。染色质粗线网状。 胞质：丰富，灰蓝色，可含嗜天青颗粒。 3、嗜碱性粒细胞 4、单核细胞 5、淋巴细胞5、淋巴细胞：占2030%，615m，参与免疫。 胞核：圆或卵圆形，可有小凹陷；染色质呈块状，色深。 胞质：少，天蓝色，可含嗜天青颗粒。实验二 血涂片的制备和细胞计数（选做）课前预习1细

15、胞计数的基本原理？2细胞计数与细菌计数的异同点？一、实验目的1制备血涂片，观察了解血细胞的基本形态；2掌握细胞计数方法。二、实验原理细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数。细胞计数时，先将培养细胞或血细胞稀释成细胞悬液，然后将细胞悬液滴入细胞计数板内，计数计数板上计数室四大格内的细胞数。根据计数室的容积及稀释倍数，即可计算出细胞浓度。三、实验仪器、试剂及材料1材料：鸡一只2器材和仪器：显微镜、载片、盖片、吸水纸、手术器材、解剖盘、血球计数板、小平皿、牙签3试剂：0.9生理盐水，四、实验步骤1制备10%的鸡血细胞悬液2鸡血涂片的制备与观察取鸡血悬液，靠近一端滴在载片上，将另一载片的

16、一端呈30-45角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层 (图21)。晾干，显微镜下观察。 图21 血涂片的制备3细胞计数1）制备鸡红细胞悬液：0.85生理盐水按确定的稀释倍数制成10%鸡红细胞悬液。2）熟悉血细胞计数板：血细胞计数板呈长方形，有2个计数室。每个计数室分为9个大正方格，每个大格边长为1mm，计数室的底与盖玻片间的距离为0.1mm，及每大格的容积为1mm1mm0.1mm=0.1mm3。四角的每个大格被分为16 个中格；中央的大格被分为25 个中格，中央的每个中格又被分为16 个小格。3）滴片：每人取1副血细胞计数板及1 张盖玻片，用布将盖玻片擦净，把盖玻片

17、盖在血细胞计数板槽上，然后用吸管将制备好的鸡血细胞悬液混匀，吸取血细胞悬液，滴1 滴于血细胞计数板的盖玻片一侧边缘，使细胞悬液自然流入计数室内。 注意：血细胞悬液不可滴的过多，如溢出或盖玻片内有气泡必须重做，否则将影响计数结果。该吸管加完样后不能再用。4）计数：在低倍镜下按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。数出计数板上计数室四角四大格中的细胞数，如细胞压在格线上时，数上不数下，数左不数右。二次重复计数不应超过5。五、实验结果1鸡血涂片的制备与观察显微镜观察可见鸡红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为

18、圆形。2细胞浓度计算：将四大格的细胞总数除以4，得出平均每大格的细胞数，每大格的容积为0.1mm3，乘以10000 即为1000mm3（1mL）。因此，不同稀释倍数细胞悬液的细胞浓度可用下式计算：细胞浓度（细胞数mL）（四大格的细胞数4）10000 稀释倍数六、实验报告12计数 每毫升 细胞悬液中的细胞数（注意单位：个/ml）3为什么细胞计数时，细胞悬液逸出凹槽外或有气泡时要重做？显微直接计数法的计数原理1 1ml菌液中的总菌数= ？ = N104B = A/525104B N:大方格的总菌数；A:五个中方格的总菌数；B:菌液的稀释倍数； 答案：(3+4+4+3+2)525104 = 8105

19、个/ml 实验三 叶绿体的分离与荧光观察（必做）课前预习：1分离细胞器的一般原理和方法？2叶绿体的荧光为什么不能用普通光学显微镜观察到？一、实验目的：1通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2通过光镜鉴定叶绿体的纯度及了解叶绿体形状；3观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，了解荧光显微镜的原理和使用方法。二、实验原理1细胞经过破碎后制成匀浆，在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 差速离心法：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度和离心时间下分批分离的方法。2利用细胞各组分质量大小、形状和密度的不同，选择不同的离心力和离心

20、时间，即可分离得到所需要的细胞器或大分子组分。3菠菜是分离完整叶绿体的极好材料，其细胞中所含的质体较大，而且它们都能在不积累淀粉和酚类物质的条件下生长。菠菜的叶绿体/湿重比率较高。叶绿体具有荧光现象，可利用荧光显微镜观察。菠菜叶富含叶绿体，可采用徒手切片观察其形态和分布。4叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。5将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 用6层纱布除去组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的

21、叶绿体（混有部分细胞核）。 6分离过程最好在05条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 三、实验用品1材料：新鲜菠菜，临用前先暗置过夜，目的是消除淀粉的积累。最好45冷藏。2试剂：蒸馏水，0.35mol/L 氯化钠溶液，0.4mol/L蔗糖溶液，0.01%吖啶橙，3器材：立式冰冻高速离心机、组织匀浆机、光学显微镜、荧光显微镜、天平、研钵、漏斗、50mL 离心管、纱布、载玻片、盖玻片等。四、实验步骤一、叶绿体的提取 1新鲜嫩菠菜叶洗净擦干去除叶梗、叶脉，称2克于放入匀浆器中，加入 8mL0.35mol/L氯化钠溶液；（同样称2克于放入匀浆器中，加入8mL0.4mol/L蔗糖溶液，作对比实验

22、，贴好标签。）2利用捣碎机低速（5000r/min）匀浆，35min，或快速研磨成匀浆。3将匀浆液用6层纱布过滤于50mL小烧杯中， 4取6ml虑液1000r/min离心2min（去除组织残渣和未被破碎的细胞），弃去沉淀； 5取上清液在3000r/min离心5min，弃去上清液，保留沉淀（沉淀即为叶绿体，混有部分细胞核）； 6沉淀用大约1mL0.35mol氯化钠溶液悬浮； 7取叶绿体悬液一滴置于载玻片上，盖上盖波片，光学显微镜下观察。8若使用荧光显微镜观察(荧光显微镜使用方法)时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1 滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。【实验结果】

23、普通光镜下，可看到叶绿体为 绿色橄榄形 ，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。在选用B（blue兰色）激发滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。加入吖啶橙后，叶绿体发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。 二、菠菜叶徒手切片观察 1新鲜菠菜叶 用刀片切出一斜面置于载玻片上，滴加12滴0.35mol/L氯化钠溶液，盖上盖片显微镜下观察，可以看到三种细胞：（1）表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。 （2）保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。（3）叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞，叶绿体呈绿色橄榄形。保卫细胞 长形的栅栏细胞 椭圆形的海绵细胞 叶绿体橄榄形【实验

24、报告】1绘图：菠菜叶肉细胞的形态，示叶绿体、气孔、表皮细胞的生物图，并对形态、颜色加以说明。 思考题：l叶绿体分离的实验原理是什么？2在分离叶绿体时应注意些什么问题？实验四 观察黑藻的叶绿体和细胞质流动（选做）一、实验目的：1高倍显微镜观察叶绿体形态和分布。2通过显微镜的实际观察，理解细胞质流动是一种生命现象。二、实验原理： 1高等植物的叶绿体存在于细胞质中，叶绿体呈 绿 色、 扁平的椭球形或球形 ，高倍显微镜下清晰可见。 2活细胞中的细胞质处于不断流动的状态，用 叶绿体 的运动作为标记可观察细胞质的流动。三、实验程序： 光照、室温条件下水中培养黑藻取一片幼嫩的小叶做临时装片：清水+小叶+盖玻

25、片低倍观察叶片细胞高倍观察叶绿体的流动及流动方向。四、注意事项：1、细胞质的流动受细胞的代谢状况和外界环境因素的影响，增进细胞代谢作用的因素，如适宜的光照、温度、pH值、生长素等，都可以促进细胞质的流动。反之，不利的环境变化和某些化学药品（麻醉剂等，则可抑制细胞质的流动。2、在做此实验时，如果发现细胞质不流动，或者流动很慢，应立即采取措施，加速其细胞质的流动。其方法有三种：一是进行光照，即在阳光或灯光下放置1520分钟；二是提高盛放黑藻的水温，可加入热水将水温调至25左右；三是切伤一小部分叶片。实验五 DNA的细胞化学Feulgen反应（必做）一、实验目的：1Feulgen反应是专一性染DNA

26、的反应，是经典的细胞化学方法，通过实验使学生掌握Feulgen染色的技术。2观察了解DNA在细胞内的分布。二、实验原理：Feulgen反应是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen和Rossenbeck于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。原理是：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫

27、红色化合物，从而显示出DNA的分布。三、实验仪器、试剂及材料（见教材3132页）1材料：紫色洋葱（取内表皮）2器材：显微镜、染色缸、剪刀、刀片、镊子、烧杯、小平皿、水浴锅、100温度计、 3试剂: Carnoy固定液、l mol/L HCl、5%三氯醋酸、0.5%亮绿染液 （注：30人/班：每样试剂100 mL即可。） Schiff试剂（选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红） 新配制的亚硫酸水溶液(漂洗液)四、实验步骤：1撕取洋葱鳞茎内表皮4块（1cm2，待铺片时剪成1mm2），先放入Carnoy固定液固定1015分钟。之后分别进行下列操作。第1块放在3mL 1M HCL中，加热到60水解8

28、10min。（实验组） 第2块放在3mL 1M HCL中，常温下水解810min。 （对照组1） 第3块放在3mL 5三氯乙酸中90 水浴15min。吸去三氯乙酸，加入3mL 1M HCL中，加热到60水解810min （试管内操作） （对照组2） 第4块不用水解，直接从第3步进行操作 （对照组3） 2蒸馏水水洗。3用Schiff试剂遮光(用黑布或黑色塑料袋)染色3060min。(1块洋葱内表皮约1.5mL, 15 mL可几块一起染) 4用新鲜配制的漂洗液洗3次，每次2mL，2min。 5自来水冲洗5min，再用蒸馏水洗片刻。60.5%亮绿复染30s。7蒸馏水水洗2次，每次5min。8将内表皮

29、放到载玻片上，盖上盖波片，显微镜观察。 实验组：细胞核呈紫红色，核仁及细胞质呈绿色。细胞中凡是有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。 实验组经Feulgen反应显示核结构细致、清晰，细胞核染成粉红色至紫红色，核仁不着色。经亮绿处理的细胞的细胞质部分显绿色。 对照组由于DNA没有释放出醛基，细胞核显示出被亮绿染上的绿色，无红色出现。 如果亮绿处理时间过长，则会造成细胞核区颜色过深。 1. Feulgen反应的实验原理是什么？答：DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。 2. 说明Feulgen 反应中设立的对照组的必要性？答： 进行F

30、eulgen反应时, 设立的对照组以便说明实验结果的真实性。对照组的材料或采取不经盐酸处理，或预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明此反应的专一性。 3. Schiff试剂的主要作用是什么?答：DNA经弱酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性。Feulgen反应成功