研究生学位论文开题考核表.docx

1、研究生学位论文开题考核表研究生学位论文开题考核表学科专业： 海洋生物学 姓 名： 马晓欣 学 号： 0911071144 研究方向： 精子发生过程中相关功能基因的研究 导师姓名： 竺俊全 入学年月： 2009年9月 填表日期：2010 年 9 月 30 日填 表 说 明一、本表需用Word文档电脑输入，并用A4纸打印。本表需一式二份，一份交导师，一份交所在学院研究生办公室。二、研究生应如实填写相关内容，对弄虚作假者，一经发现即取消其开题考核资格。三、按照开题考核表中规定的撰写提纲撰写开题报告，附在开题考核表后。四、根据学位点要求撰写文献综述，含主要参考文献、资料目录，附在开题考核表后。一、课程

2、学习（可按实际数量增删此表）类别课程编号课程名称学分成绩有无补考学位课07G02002A科学社会主义理论与实践282无07G02003A自然辩证法概论284无07G06010A第一外国语（英语）12免修无07G06020A第一外国语（英语）22免修无07G13101B分子生物学283无07G13102B高级生物化学275无07G13103B海洋生物学280无07G13104A实验生态学289无07G13105A生物显微与亚显微技术289无非学位课07G00302A高级学术交流英语1190无07G00302B高级学术交流英语2179无07G13106A重要仪器性能与分析482无07G13304A

3、发育生物学285无07G13307B细胞生物学286无07G13313A生物信息学381无07G13801A开题报告107G13802A文献阅读（含专业英语）207G13803A学术交流活动（学术研讨与学术报告）107G13804A社会实践（含教学实践）1学院审核意见1、是否完成个人培养计划规定的课程学习： 2、有无补考课程及门数：3、学科综合考试通过情况（限博士生）：研究生秘书签字： 年 月 日二、个人总结及开题报告个人总结（简述自入学以来的个人政治思想、学习、身心健康状态等情况）：本人自进入宁波大学以来，在各方面都严格要求自己，积极努力，力争达到一名合格的研究生应有的标准。在政治思想上，时

4、刻严格要求自己并随时准备接受党组织的考验，紧跟时代步伐，了解党和国家的新政策和社会的动向，与时俱进。在学习方面，我认真学习专业知识，课余时查阅与专业相关的中外文文献，全面提高自己的理论知识水平及英语能力，为以后就业或者继续深造奠定基础。科研和实践能力方面，我十分注重自己动手能力的培养，并不断加强与相关实验室的交流，培养严谨的科学的态度和素养。在学习之余，我经常体育活动，并经常与同届的同学、师兄师姐交流谈心，热爱生活，生活态度乐观积极。在以后的学习中，我会一如既往地勤奋刻苦，认真钻研，争取成为一名优秀的专业人员。学生本人签字：年 月 日开题报告题目曼氏无针乌贼精巢kifc1和nup62基因的克隆

5、及表达模式研究开题报告字数0.6万字 参考文献数39 篇开题报告撰写提纲：（一）论文选题的背景、意义和依据，有关研究的最新成果和动态（二）课题研究的主要内容、拟采取的技术路线及实施方案、拟解决的关键技术和难点、预期达到的目标（三）论文的工作量及具体进度安排（注：请将开题报告和文献综述附在开题考核表后）导师意见：导师签字： 年 月 日三、考核过程和结果考核过程结果1、考核过程（可附页）： 记录人签字：2、成绩评定： 同学的开题考核成绩为 。（注：开题考核成绩分“合格，不合格”两个等级）考核小组组长签字： 成员签字： 年 月 日学院审核意见主管领导签字：（加盖公章） 年 月 日宁 波 大 学研究生

6、学位论文开题报告表论文题目： 曼氏无针乌贼精巢kifc1和nup62基因的克隆 及表达模式研究 学科、专业： 海洋生物学 研究方向： 精子发生过程中相关功能基因的研究 姓 名： 马晓欣 学 号： 0911071144 指导教师： 竺俊全 杨万喜 入学年月： 2009年 9月 一、论文选题的背景、意义和依据，有关研究的最新成果和动态（一）、论文选题的背景、意义和依据 曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni）为一年生、食性凶猛、生长迅速的海洋头足类（以下简称乌贼），属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、乌贼科(Sepiidae)

7、、无针乌贼属(Sepiella)，俗称墨鱼。乌贼分布于中国东南沿海，俄罗斯、日本、朝鲜以及东南亚沿海，舟山海区是最重要的分布区。乌贼肉鲜味美，风味独特，营养价值高，深受消费者群体的喜爱。由于近年来乌贼产量极少，市场销售主要以鱿鱼为主。乌贼全身是宝，乌贼骨是传统中药海鳔蛸，其内脏粉是动物饲料的优良诱食剂，富含不饱和脂肪酸、脂溶性维生素和未知生长因子，是优良的饲料添加剂。乌贼曾是我国的“四大海产”之一，浙江省历史上渔业捕捞最高产量6万吨，占全省海洋捕捞产量的9.3%。20世纪70年代以来，由于春、夏汛时，多种渔具大量围捕未产卵的“进港乌贼”秋、冬汛时，包括渔轮拖网、张网作业的多种渔具大量捕捞幼乌贼

8、和越冬乌贼，致使乌贼生长型和补充型群体数量减少，破坏了渔业资源的生态平衡，导致舟山渔场乌贼资源几近枯竭（常抗美等，2009）。导致乌贼资源枯竭的主要原因包括：1、乌贼的过度捕捞和生态恶化，导致乌贼资源缺乏；2、乌贼的自然繁殖率成功率以及成活率均低：对于乌贼繁殖机制的无知，导致在乌贼产卵受精等关键步骤受到影响，从而对乌贼的产量有很重要的影响；乌贼的繁殖机制包括精卵发生机制的研究及受精过程的机制研究。因此对乌贼繁殖机制进行研究，是未来大规模人工繁殖的需要，也是将来通过大量人工放流增加乌贼自然资源量的重要措施。国内外对头足类精卵发生机制的研究从二十世纪六十年代初期开始，文献显示，到目前为止已有的研究

9、物种包括Squid (Loligo pealii)的精子发生（Austin et al.，1964），章鱼属的北太平洋巨型章鱼（Octopus dofleini martini）的雄性生殖腺的精子发生（Mann et al.，1970），Octopus dofleini martini精子的能动性研究（Brooks et al.，1971），Octopus dofleini martini精子发生（Dott et al.，1970），Larmark (Eledone cirrhosa)精子发生（Maxwell，1974），vampyroteuthis infernalis Chun精子发生（H

10、ealy，1989），Rossia macrosoma 精子发生的超微结构研究（Hou & Maxwell，1992），two Eledone species 精子结构的研究（Selmi，1996），Octopodids (Mollusca: Cephalopoda )雄性生殖系统的组织学分析（Voight，2002），Octopus Tankahkeei 精子发生的超微结构分析（Zhu et al.，2005），Sepia ofcinalis 精核形成的组织学研究（Martnez-Soler et al.，2007）。关于乌贼的精子发生，吴常文等在2007年对乌贼雄性生殖系统进行了研究，而后

11、在2008、2009年分别对乌贼精子发生和成熟精子的超微结构进行了报道。在动物的精子发生中，有至少以下三大结构影响未来的受精：顶体的形成、精核形态建成以及中段结构。目前，上述三大结构的形成的分子机制是研究热点。有研究显示：有一种称为微管套的微管结构环绕在伸长的核尾端四周，在精核形态建成中起到了关键作用（Russell et al.，1991）。微管套是由平行排列的，包围在细胞核周围，从核周延伸到细胞质中的一些微管形成的结构，它在精核形态开始变化时出现，在核形态建成过程中体积增大且明显，最后在成熟精子中消失。由于微管套的变化是与细胞核形态建成同时发生的，因此它在圆形拉长到纺锤形的过程中起到了关键

12、的作用。在哺乳动物大鼠中，已经有研究发现微管套是与细胞核形态构建和顶体形成过程是相关的（Yang et al.，2003）。精细胞核膜与微管套之间的连接被认为是细胞核形态变化的动力基础，这种结构特点也表明精细胞向精子的转化过程涉及到了与微管有关的运动机制。微管与线粒体，内质网和高尔基体等细胞器的形成和分布有密切的联系，并参与了这些膜状结构之间的囊泡运输。这些过程中至少有两类与微管相关的马达蛋白参与。这些马达蛋白携带着不同的物质沿着各自唯一的轨道在微管上移动，为物质运输起关键的作用。驱动蛋白Kinesin家族就是其中一种，呈异性四聚体结构，有两端，一端与微管结合固定在微管结构上随之移动，另一端携

13、带不同的物质进行运输。利用微管激活的ATP水解作用将物质沿着特定方向运输（Hirokawa，1996；Hirokawa，1998; Hirokawa & Takemura，2005；Hirokawa et al.，1998）。驱动蛋白首先是在神经细胞中发现的，它与轴突中顺行的快速传导有关。后来进行的驱动蛋白介导的运动行为的形成和破坏方面的研究，表明它在膜运输过程中起到了一定作用。KIFC1作为在Kinesin家族中C端的一种驱动蛋白，可以在精巢中表达，已有文献显示：KIFC1参与大鼠中精子顶体形成过程及膜泡的运输（Yang et al.，2003）,参与中华绒螯蟹精子顶体的形成（Yu et a

14、l.，2009; Wang et al.，2010）,参与嘉庚蛸精子形成过程中精核的建成（Wang et al.，2010）,以及在大鼠精子形成过程中与Nup62复合物结合参与精核的形态建成（Yang et al.，2006），说明kifc1在哺乳动物和嘉庚蛸精核形成过程中起了一定作用。核孔复合体蛋白（nuclear pore complex），它们结合于核膜，是一种参与核膜内外物质运输的蛋白。因为精核形成最主要的就是核的延伸拉长形变，因此核形变过程中有核孔复合体蛋白的参与（Martnez-Soler，2007）。Nup62就是核孔复合体蛋白的一员，有文献显示它可以与KIFC1结合在大鼠精子形

15、成中核建成过程起关键作用（Yang et.al，2006）。因此我们推测nup62在精核形成中起一定的作用。乌贼的精子发生过程与嘉庚蛸类似，只是在不同阶段精子形态有所差异，如顶体形状，精核的形状，尾部中段形态等，但是整体过程是大致相似的；与哺乳动物相比，精子发生过程都是差不多的，染色质的浓缩，核形变以及尾部中段的形成，以及微管套在精核形变初期存在，成熟时期消失等都是类似的（叶素兰等，2008）；并且在嘉庚蛸的精子发生过程中已有文献显示kifc1基因在精核形变过程中参与了一定的作用（Wang et al.，2010）。基于上述三点以及前面已有文献，我们假设认为：在乌贼精子发生的过程中kifc1和

16、nup62两个基因的表达产物发生相互作用，参与了精核形变的过程。本课题的主要目的是验证这个假设。我们拟克隆乌贼精巢中kifc1和nup62两个基因，并在基因表达水平上探明其表达特征，为后续的蛋白水平上研究KIFC1和Nup62的生理作用机制打下基础。（二）、有关研究的最新成果和动态1 哺乳动物从九十年代初期到现在，已经有很多关于微管对精子发生过程中很多形态上的变化至关重要（Moreno et al.，2000）。在精子发生过程中，微管的形成和运动，顶体的形成及细胞核的浓缩与拉长是紧密相关的(Yang et al.，2003)。有人提出微管套参与了精细胞核的浓缩和形态变化，且某些特定的分子马达蛋

17、白在精子发育和成熟的过程中起到了重要的作用。这一过程包括精细胞在上皮细胞内的运输，纺锤体和微丝的形成以及顶体的形成(Russell et al.，1991)。驱动蛋白KIFC1最早在研究小鼠胚胎大脑中的马达蛋白、做RT-PCR时发现的，进一步的分子分析表明这一蛋白属于高度相关的C端马达蛋白家族的一员，它在精巢中也得到表达（Yang et al.，2003）。从已有的研究中可以发现它广泛的存在于很多的组织中，如卵巢，脾，肺等，说明它作为驱动蛋白在物质运输过程中的重要作用（Hall et al.，1992）；而且它可以与很多其他相关的功能蛋白结合，如核孔复合体nup62(Yang et al.，2

18、006)，及TLRR（富含亮氨酸的重复片段，含有蛋白磷酸化的位点，有助于蛋白的运输）(Wang et al.，2008)，因此说明它在运输过程中起着重要的作用。具体到KIFC1在精子发生中核建成中的作用，已有研究人员通过小鼠实验对其进行研究，发现KIFC1在精原细胞时时通过与核周的微管套结合而发生作用的，在精原细胞核开始发生变形拉长的过程中，随着微管套向尾部的移动，KIFC1随之一起作用，使细胞核发生形变，从而将圆形拉长为柱状(Gimenez-Bonafe et al.，2002)。而KIFC1与微管套之间通过极性结合从而达到了物质运输的目的，KIFC1的运输方式是从微管的正极向负极移动。在这

19、种作用模型中，KIFC1分子一端与运输物质结合，一端与微管结合，因而随着微管的移动，达到了物质运输的目的(Healy，1990)。2 软体动物软体动物精子发生过程中生精细胞核的变化具有种属特异性，核的变化主要体现在染色质的形态及核外部形态变化上(Healy，1993)。头足类软体动物精细胞分化过程中核染色质经历了片层化，颗粒化，纤维化，其精细胞核形变化均有明显的延长过程，但是延长后的形状不尽相同，如顶体的形状，胞核的形状有的是长柱状有的则会有弯曲，根据不同的物种而呈现特异性，从而判知进化先后顺序,如八腕目的嘉庚蛸的精核为简单的柱状，而乌贼的精核为稍弯曲的长柱形纺锤形，Healy认为直的核起源于

20、弯的核，是后者的进化类型(叶素兰等，2008)。有学者认为头足类动物精核形态建成过程涉及染色质的凝集与核周微管的作用(Kubo & Ishikawa，1981)。染色质的凝集是由于结合蛋白的作用(Kato et al.，2004)，染色质的浓缩时DNA与蛋白质相互作用促使形态发生改变；核周微管则如哺乳动物中所发现的，微管套为核周施加压力，促使核的延伸和拉长(Kierszenbaum，2002)。乌贼精子发生的过程中，核周微管在核开始变形拉长的时候出现，此时，核前端的前顶体形成，核在核周微管的作用下挤压，变形，拉长，延伸；此时，核内的染色质颗粒化，进而纤维化，片层化，最后形成纺锤状的精细胞，微管

21、套消失不见(叶素兰等，2008)。已有的研究发现嘉庚蛸(Zhu et al.，2005)和墨鱼（Sepia officinilis）的精核形态建成都是核周微管和浓缩的染色质通过核膜相互作用的结果(Martnez-Soler，2007)。KIFC1在嘉庚蛸的精子顶体发生的许多阶段密切相关，在核周微管和浓缩的染色质之间相互作用的过程中，马达蛋白KIFC1也起到了关键作用(Wang et al.，2010)，而在曼氏无针乌贼上的有关此项研究还没有报道。二、课题研究的主要内容、拟采取的技术路线及实施方案、拟解决的关键技术和难点、预期达到的目标（一）、课题研究的主要内容1 曼氏无针乌贼精子发生过程中各发

22、育阶段生精细胞核的形态结构及核周微管结构的变化；2 曼氏无针乌贼精巢中kifc1及nup62基因的克隆；3 kifc1及nup62基因在曼氏无针乌贼精子形成过程中表达模式。（二）、拟采取的的技术路线及实施方案：1.曼氏无针乌贼精子发生过程中各发育阶段生精细胞核的形态结构及核周微管结构的变化利用透射电镜技术观察。1.1 取材：组织块小于1mm31.2 固定：2.5%戊二醛(磷酸缓冲液配制)固定2小时或更长时间；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分，三次；1%锇酸固定液固定1-2小时；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分，三次1.3 脱水：50%乙醇 15-20分；70%乙醇 15-20分；90%乙醇 15-

23、20分；90%乙醇 90%丙酮（1：1）15-20分；90%丙酮15-20分；以上在4度冰箱内进行；100%丙酮室温15-20分，三次。1.4 包埋：纯丙酮+包埋液（2：1）室温1-2小时；纯丙酮+包埋液（1：2）室温1-2小时；纯包埋液室温过夜1.5 固化：37度烘箱内12小时；60度烘箱内48小时以上1.6 超薄切片机切片 50-60 nm1.7 3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色1.8 透射电镜观察。拍片2.曼氏无针乌贼精巢中kifc1及nup62基因的克隆取不同时期的精巢组织，进行组织总RNA的抽提，利用反转录试剂盒对总RNA进行RT-PCR，得到cDNA。利用在线设计网站进行兼并引物设计，再

24、通过巢式PCR技术进行目标条带的扩增，选取目标的特异性条带进行回收，与PMD18-T载体链接，然后大肠杆菌转化，菌落PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，然后测序。得到的结果即为目标基因的一段序列。利用primer5软件进行特异性引物设计，进行3-RACE和5-RACE进行序列的3端序列和5端序列扩增，从而得到基因的全部序列。其中引物设计是其中关键的步骤，兼并引物的设计是通过在线网站设计，选取与乌贼最接近的头足类进行引物设计，并根据兼并度，退火温度，CG含量等进行引物的选取，从而得到特异性更高的引物。3 kifc1及nup62基因在曼氏无针乌贼精子形成过程中表达模式研究在原位杂交之前应进行特异性探针

25、的设计，以及冰冻切片的制备。3.1 杂交前预处理(1) 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定l0min。 (2) 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1DEPC-1PBS溶液)洗2次，每次5 min。 (3) 5SSC中平衡15 min。3.2杂交(1) 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 l玻片)，置于放有湿盒液(50甲酰胺v/v；0.3 M NaCl；1mM EDTA；10 mM Tris-Cl，pH 8.0)的湿盒中，5558 下的烘箱中预杂交2 h。(2) 甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng/l)经70 变性10

26、分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60l/玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在4858 下杂交18-30 h。3.3杂交后处理(1) 取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 预热的5SSC洗30 min。(2) 在无DNA的RNA酶A(20g/ml)溶液中37 下孵育30 min。(3) 分别依次用52 预热的2SSC，1SSC和0.1SSC洗2次，每次30 min。3.4杂交信号检测(1) 在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。(2) 在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：5001:2000稀释于

27、含0.5阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。(3) 用缓冲液A洗2次，每次15 min。(4) 在缓冲液B(0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；0.05M MgCl2，pH 9.5)中平衡5min。 (5) 硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.51 NBT和3.51 BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。(6) 充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。(7) 在95乙醇中洗l h以除去非特异的背景。(8) 用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。(9) 脱水

28、、透明，用中性树胶封片。(10) 充分干燥后在显微镜下观察、照相。（三）、现有的实验条件1. 样品来源可以得到保证，活体材料采集方便。2. 实验条件和仪器设备保证。浙江大学生科院和宁波大学生命学院具备完善的实验仪器，指导老师在此领域有着多年的研究经验，颇有造诣，可解决实验中遇到的技术问题。3. 宁波大学和浙江大学图书馆文献信息资源充足，为实验的顺利进行提供了便利资料资源。（四）、拟解决的关建技术和难点：1. 乌贼精巢kifc1及nup62基因全长的克隆；2原位杂交技术中 kifc1及nup62基因的探针设计。（五）、预期达到的目标1、克隆乌贼精巢kifc1及nup62基因全长；2、探明kifc

29、1及nup62基因在乌贼精子发生过程中的表达模式特征。三、论文的工作量及具体进度安排2010.9-2011.12 查找相关资料、熟悉基本的实验操作，进行部分预实验； 2011.12011.4不同发育阶段精巢的取材固定；制备乌贼不同发育阶段精巢的RNA，并做反转录实验。进行kifc1和nup62基因的克隆测序2011.52011.7制备冰冻切片，用原位杂交技术研究不同阶段kifc1和nup62基因的分布与细胞核和微管的位置之间的关系；透射电镜观察精子发生不同时期核形的变化，核周微管的形态以及马达蛋白的分布。2011.82011.9综合分析kifc1和nup62基因在乌贼精子形成过程中的可能作用。

30、2011.92011.11数据和材料整理、分析，论文写作。四、主要参考文献1 吴常文等.曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)繁殖习性及其产卵场修复的研究J.海洋与湖沼,2010,41(1):39-462 常抗美等.曼氏无针乌贼胚胎发育于人工育苗技术的研究J.浙江海洋学院学报（自然科学版）,2009,28(3):257-2633 竺俊全,杨万喜.双壳类软体动物精子发生及其在系统演化研究中的应用前景J.海洋与湖沼通报,2002,4:25-314 叶素兰等.曼氏无针乌贼雄性生殖系统的组织学研究J.浙江海洋学院学报（自然科学版）,2007,26(4):371-3775 叶素兰等.曼氏无

31、针乌贼精子形成的超微结构J.海洋与湖沼,2008,39(3):269-2756 叶素兰等.曼氏无针乌贼精子的超微结构J.中国水产科学,2009,16(1):8-147 Yang W.X. & Sperry A.O. The C-terminal kinesin motor KIFC1 participates in acrosome biogenesis and vesicle transport J. Biol. Reprod,2003,69:1719-1729.8 Yang W.X. et al. The molecular motor KIFC1 associates with a complex containing nucleopor