分子生物学实验报告.docx

1、分子生物学实验报告PCR基因扩增实验目的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。实验仪器：基因扩增仪 移液器实验试剂： 10PCR缓冲液(含Mg2) 4种dNTP Taq酶DNA模板两种引物（正向引物和反向引物） 实验步骤:1、按顺序向微量离心管中依次加入：ddH2O 20l DNA 样品5l 10PCR 缓冲液5

2、ldNTP 4l 引物I 5l 引物 5l 混匀。2、PCR反应参数 (1) 94变性2min (2) 94变性30sec， (3) 66退火30sec， (4) 72 延伸1min。 (5) 重复(2)-(4)40次 （6）72 延伸7min。 （7）4保存3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10l PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。实验结果：照片结果图1 2 3 4 1.10ul样品2.样品3.DNA相对分子质量标准4.对照DNA琼脂糖凝胶电泳实验目的：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。实验原理：D

3、NA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。实验仪器：1. 电泳仪；2. 紫外检测仪；3. 水

4、平电泳槽；4. 移液枪；5. 一次性手套。实验试剂： 1. 配置1000ml 5 x TBE pH8.0Tris 54g硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA 20ml2、EB溶液溴化乙锭溶液（0.5ug/ml）3、凝胶加样缓冲液（6 x ）溴酚蓝 0.25蔗糖 404、 琼脂糖实验步骤：1、琼脂糖凝胶的制备：（1）称取琼脂糖0.3g，加入30ml 0.5 x TBE缓冲液，在微波炉上加热溶解，取出摇匀，配制成1琼脂糖凝胶；稍凉后加入配好的EB溶液数滴。（2）取有机玻璃内槽，洗净晾干，用橡皮膏将机玻璃内槽两端密封，将有机玻璃内槽放置一水平位置，并放好样品梳子。将冷到60左右的琼脂糖凝胶溶

5、液倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面。（3）冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中。（4）加入电泳缓冲液至电泳槽中。2、加样用移液枪取缓冲液，依次点12ul缓冲液在一次性手套上。再取样品溶液5ul左右，加入缓冲液中，混匀后，将溶液加到样品孔中，并记录好点样顺序。同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。3、电泳：加入pH8.0Tris硼酸EDTA缓冲液后，接通电泳槽与电泳仪的电源，最高电压不超过5V /cm，电泳至溴酚蓝走到胶底部边缘时停止电泳。染色及观察：电泳完毕，取出凝胶模具，将其浸入溴化乙锭染色液中，染色15min后将其推到一块干净的玻璃板上，于254nm、 300nm或3

6、60nm波长紫外灯下观察，DNA存在的位置呈现桔红色荧光条带，照相。实验结果 上图为质粒DNA和酶切产物的电泳结果DNA重组实验目的通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。实验原理：外源 DNA 片段和线状质粒载体的连接就是DNA重组，在Mg2+和ATP存在下， DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。在这种情况下产生的两个杂交体分子带 有 2 个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的 5磷酸和 3羟基间磷酸二酯 键的形成可在体外由两种不同的 DNA 连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌 DNA 连接酶和 T4 噬菌体 DNA 连接酶

7、。受体细胞经过CaCl2处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子，即带有异源DNA分子的受体细胞。关于转化子的筛选利用-互补现象筛选方法。 载体上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶 N 端 146 个氨基酸的编码序列。这个 编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏 lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能。宿主细胞 带有-半乳糖苷酶 C 端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, 载体和 宿

8、主细胞编码的-半乳糖苷 酶的片段都没有酶活性。但在他们融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种 lacZ 基因上 缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的 现象叫-互补。由-互补产生的 Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物 X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-D-半 乳糖苷)下存在下被 IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去-互补能力, 因此 在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。实验仪器与材料仪器：

9、恒温摇床、恒温水浴器、恒温培养箱、台式离心机、低温离心机材料：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠(Nacl)、氨苄青霉素、氯化钙(CaCl2)、二甲基甲酰胺、 Eco RI酶、T4 DNA连接酶、pUCl9质粒、DH5a、DNA、培养皿、接种针、玻璃涂棒、试管、酒精灯、镊子、牙签等实验步骤一、 制备重组DNA1. 取灭菌的Eppendorf管，先后加入 pUC19质粒1 l ，2 l酶切缓冲液， 1 l EcoRI酶，无菌双蒸水15ul，至反应混合物总体积20ul，离心混匀，37反应3h。2. 在另一灭菌的Eppendorf管中，加DNA 1.5ug， 1l酶切缓冲液，1 l EcoRI酶，无菌双蒸

10、水补到10ul，37反应3h。3. 将酶解液加入1/10体积的3mol/LKAc溶液，在加2倍体积无水乙醇，-20冰箱，2h沉淀DNA。12000r/min 4离心15min，弃上清，加70%乙醇洗沉淀，再离心，去上清，真空干燥后，加5ulTE溶液。4. 将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1ul，T4DNA连接酶1ul，14保温14h，并作转化试验。二、 制备涂菌的琼脂板LB培养基含100ug/ml 氨苄青霉素，琼脂15g/l ,倒入培养皿，保存。三、 制备感受态细胞1. 在200ul新制备感受态细胞中，加入5ul 连接产物，混匀，冰上放置30min。同时做两个对照

11、。2. 受体菌对照：200ul新制备感受态细胞+2ul无菌双蒸水质粒对照：200ul 0.1mol/l CaCl2 + pUCl9质粒DNA溶液。3. 将管放在42水浴，12min。4. 冰上放置12min5. 每管加800ulLB培养基，37温育45min，慢摇。6. 在预制的LB琼脂平板上，加40ul 20 mg/ml Xgal 和4ul 200mg/ml IPTE溶液，涂布于平板上。7. 将感受态细胞均匀涂布于培养皿上，37温箱30min，至液体被吸收。8. 倒置平板37培养1216h，出现菌落。其中白色菌落为重组DNA质粒。实验结果大肠杆菌感受态细胞的制备及转化试验目的: 学习大肠杆菌

12、感受态细胞的制备及转化的方法及技术试验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫做感受态。在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 。细菌在0 CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含氨苄青霉素的培养基中生长。

13、实验仪器与材料仪器超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、70冰箱、恒温水浴器材料氯化钙(CaCl2)、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠(Nacl)、氨苄青霉素、大肠杆菌DH5a、pUCl9质粒、50mL离心管、吸头、小指管、试管、培养皿、锥形瓶等。试剂 （1）0.1mol/L CaCl2 溶液（2） LB液体培养基配置每升培养基，应950ml去离子水中加入：胰蛋白胨10 g 酵母提取物5gNaCl 510g 加水定容至1L，调节 pH 7.0，121湿热灭菌20min。 （3）氨苄青霉素，用无菌水配制成100mg/ml 溶液，置冰箱保存。（4）LB固体培养基：每升中加15g 琼脂。实验步骤：1

14、. 从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于2mlLB液体培养基试管中， 37振荡过夜。2. 取0.5ml 过夜培养液，接种于50ml LB液体培养基中，37振荡培养2-3hr，至OD600=0.4-0.5时，放置于4冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）3. 将培养液1.5ml分装入1.5ml离心管中，4离心，4000rpm10min，弃去上清。4. 重复第4步。5. 用冰浴的0.1M CaCl2 0.5ml悬浮30min。6. 4离心，4000rpm10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液100l悬浮。7. 分装细胞，每200ul一份，-70冻存备用，

15、此为感受态细胞。取新鲜制备的200L感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。加入2 l重组质粒，轻轻混匀。冰上放置30分钟。同时做两个对照。受体菌对照：200ul新制备感受态细胞+2ul无菌双蒸水质粒对照：200ul 0.1mol/l CaCl2 +2ul pUCl9质粒DNA溶液。8. 于42热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴1-2min9. 每管加800 l LB培养液，37 250转分振荡培养1h。10. 将培养物适量涂于含氨苄青霉素1%琼脂LB平板上。11平皿在37下正向放置12-16小时，待琼脂凝胶表面没有液体流动后，将平皿倒置，培养过夜12-16h。大肠杆菌感受

16、态细胞的制备及转化实验注意事项：制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，高压灭菌20min。实验结果：在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落即为含有pUC19质粒的大肠杆菌外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测实验目的1.通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。2.学习SDSPAGE的基本操作，学会用SDSPAGE检测蛋白。一 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向

17、培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE检测或做Western-blotting，用抗体识别之。原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位操纵子（元），如乳糖（lac）操纵子、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操纵子等。操纵子机制在原核基因调控中具有较普遍的意义。目标基因被克隆到不为大肠杆菌 RNA 聚合酶识别的 T7 启动子之下，因此在加入 T7 RNA 聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到 pET 载体的基因实际上是被关闭的，

18、不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由 lacUV5 控制的 T7 RNA 聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入 IPTG 诱导表达；使用大肠杆菌启动子系统 ( 如 tac 、 lac 、 trc 、 pL) 有困难的许多基因已经在 pET 系统中稳定克隆和表达。 T7 RNA 聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的 50% 。T7表达系统 大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合酶选

19、择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。T7 RNA聚合酶的转录调控的模式决定了表达系统的调控方式。调控方式为化学信号诱导性。T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性就会影响它的生长。解决这一问题的办法之一就是在表达系

20、统中低水平表达T7溶菌酶基因。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖外，还与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质粒导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目标基因的表达水平没有明显影响。此外还有其他表达系统，如营养调控型、糖原调控型、pH调控型等。实验仪器：恒温摇床、培养用锥形瓶、超净工作台、低温离心机、干热灭菌箱、材料：1 克隆在E.coli表达栽体中的外源基因、酵母提取物(yeast extract)、胰化蛋白胨(tryptone)、氯化钠(Nacl)、甘油、氨苄青霉素(ampicillin ,Amp)、异丙基硫代bD半乳糖(IFTG)、滤

21、菌膜，滤器、移液管、吸头，小指管实验步骤：1、含外源基因的表达菌株在LB （含50ug/ml Amp）固体培养基中预培养过夜2、以1/501/100的比例接种于上述LB培养液中于37恒温摇床，250r/min。培养至OD0.7-0.83、加入 50l 1mol/L IPTG （终浓度0.5nmol/L），进行外源基因的诱导表达。于37恒温摇床，250r/min。继续培养45小时。4、4，低温离心，4000r/min，20min，收集菌体备用，放在-20C以下保存二 SDS-PAGE检测表达蛋白实验原理：蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。实验仪器：平

22、板电泳槽及配套的玻璃板，胶条，梳子、普通恒压恒流电泳仪实验材料：十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺(Acr)、N，N亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(G1y)、盐酸(HCl)、过硫酸胺(Aps)、四甲基乙二胺(TENED)、低相对分子质量标准蛋白、预染标准蛋白、溴酚蓝、甘油、冰醋酸、乙醇、琉基乙醇、琼脂、考马斯亮蓝R250试剂：1.5mol/L Tris HCl，pH8.8（4C保存）20.5mol/L Tris-HCl，pH6.8（4C保存）10%SDS（室温保存）30%Acr/Bis（29.2g Acr+0.8g Bis 双氧水 定容至100ml过滤，4C保

23、存）10%Aps （-20C保存）2 x上样缓冲液0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2ml甘油 2ml20%SDS 2ml0.1%溴酚蓝 0.5ml2-b-巯基乙醇 1.0ml双氧水 2.5ml室温存放备用；5 x电泳缓冲液Tris 7.5g 甘氨酸36gSDS 2.5g加双氧水至500ml，使用时稀释五倍考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R250 0.2g + 84ml 95%乙醇+20ml冰醋酸，用双氧水定容至200ml；脱色液95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，体积比保存液：7%冰醋酸封底胶：1%琼脂操作步骤（1）配制分离胶配制10%分离胶。按顺序和量（注意体积单位！）取

24、下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH8.8）：不同浓度的凝胶的成分和用量 单位（ml）凝胶浓度（%）7.51012151820双蒸水1.5mol/L9.68.16.74.72.71.5Tris。HCL（PH8.8）55555510%（w/v）SDS0.20.20.20.20.20.2Acr/Bis(30%)56.658121213.2TEMED10101010101010%Aps0.10.10.10.10.10.1根据被分离的外源蛋白的相对分子质量选择凝胶浓度，将所有成分混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水，约40min，等胶自然凝聚后倾斜倒出蒸馏水，并在

25、两玻璃夹缝中水平插入1.5mn的梳子（在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶）。（2）4%浓缩胶的配置。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH6.8）：4 %分离胶的配制成分成分用量双蒸水6.1ml0.5mol/LTris。HCL（PH6.8）2.5ml10%（w/v）SDS100lAcr/Bis(30%)1.3mlTEMED10l10%Aps50l总体积10ml混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。溶液凝固后。小心拔出梳子，用100ul注射器抽取电极缓冲液冲洗梳子拔出后的加样凹槽底部，清除未凝固的丙烯

26、酰胺。（3）将表达后的菌体与2 x上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中，100C沸水中煮35min。然后立即插入冰中。（可在-20C冰柜中保存）（10）用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入120l 蛋白分子量标准Marker，其它槽中加入1020l自己制作的样品。接好电极，将电流调至1mA/孔，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电压调至120V，当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。把分离胶从玻璃上剥离，倒染于含适量的考马斯亮蓝染色液液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。（4）染色2h后，将染液倒回瓶子里以备重复使用。把胶移入脱色液，过夜。 观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较

27、其分子量（CHI蛋白约30kDa），判断是否是预期的基因产物。实验结果：质粒DNA的提取及酶切实验目的：1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法;2、了解制备原理及各种试剂的作用。实验原理：在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。实验

28、仪器：1、材料 含有质粒pUC19质粒的大肠杆菌菌液2、仪器 离心机，移液器3、试剂（1）、LB 培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，用NaOH 调pH 至7.5，15 磅高压灭菌15 分钟。固体培养基加1.5的琼脂。 （2）、溶液（50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA）（3）、溶液 0.4mol/L NaOH，2%SDS用前等体积混合 （4）、溶液 5 mol/L KAc 溶液60ml， 11.5 ml冰醋酸，28.5 ml 去离子水。（5）、Tris.HCl 饱和酚:固体苯酚在沸水浴中加热融化，16

29、0以上进行重蒸馏。收集的重蒸酚冷却至室温后加入等体积的1MTris.Cl(pH8.0)缓冲液,充分振荡;加入固体Tris(1g/100ml 酚)摇匀溶解,于室温静置,待分层后测上相pH 达7.6-8.0。吸出上层水相（或用分液漏斗收集苯酚），加入适量0.1MTris.Cl(pH8.0)缓冲液使酚与空气隔绝。加入终浓度为0.1%的8-羟基喹啉或0.2%-巯基乙醇以防氧化。于4可保存1 个月，常于-20棕色瓶中保存。（6）、1 M Tris.HCl 溶液：121.1g Tris（三羟甲基氨基甲烷）溶于80 ml 去离子水中，用浓HCl 调pH 至所需值：pH7.4 约需加HCl70ml ；pH7.

30、6约需加HCl 60 ml ；pH 8.0 约需加HCl 42 ml ，补水至1000ml。（7）、RNase 溶液：用0.1M NaAc,pH5.0配成10mg/ml 浓度,在80-100水浴 中加热10min 以除去其中的DNase。分装成小份于-20保存。实验步骤: 一、提取质粒1、将2ml含相应抗生素（Amp：50ug/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌，37震荡培养过夜2、取1.5ml培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥4、弃上清，加100l（5 mg/ml 溶菌酶）溶液，旋涡震荡悬浮菌体，室温放置10min。 3、加200l的溶液（新鲜配置），轻轻混匀，冰浴5 min。 5、加150l的溶液，混匀，冰浴15 分钟。6、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。7、向上清液中加等体积 酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转至另一离心管中。8、吸取上清，加2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置510min。 r/min离心5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。9、用1ml70乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，弃上清