他汀类药物的生物技术合成以及应用.docx

1、他汀类药物的生物技术合成以及应用他汀类药物的生物技术合成以及应用摘要：他汀类药物是一类可以非常显著降低血液中胆固醇含量的药物;还可以减少中风或其他疾病的风险。近几年来报道，他汀类药物还有其他的生物活性以及许多潜在的治疗用途。天然他汀类药物有洛伐他汀和康帕丁，而普伐他汀是通过生物转化形成的。辛伐他汀，是领先市场的第二他汀类药物，是一种洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀主要是由Aspergillus terrus（土曲霉）菌株合成的，而康帕丁是由penicillium citrinum菌株合成。洛伐他汀和康帕丁是通过液体深层发酵进行工业生产，但也固态发酵进行生产，这种新的生产方式具有一定的优势。洛伐

2、他汀在生物化学和遗传学上的一些研究进展让辛伐他汀在新的生产方式方面得以发展。这种洛伐他汀衍生物可以通过monacolin J（无侧链洛伐他汀）过程有效合成，这个过程是一个酰基转移酶LovD进行的。利用基因lovF的组合生物合成，可以通过一种不同的方法设计土曲霉，从而使聚酮合成酶在体内合成2,2- dimethylbutyrate（simvastatin的侧链）。这样产生的转化菌株能通过直接发酵产生辛伐他汀而非洛伐他汀。关键字：他汀类药物 生物合成和遗传学 生物技术生产简介：据世界卫生组织的报道，心血管疾病是威胁健康的主导因素。2005年，约有1750万人死于这些疾病，死亡率占全球约30。这种疾

3、病是由于血浆中的胆固醇含量提高而致，因而胆固醇血症成为了动脉粥样硬化和冠状动脉疾病（Kannel等人，1961年）的主要危险因素。一般来说， 人体中的胆固醇只有三分之一是从饮食取得的，而其三分之二是由肝脏合成，还有一小部分是由其他器官合成的（Furberg 1999年;Alberts等人1980年）。 出于这个原因，抑制胆固醇的生物合成来控制其含量成为一个重要策略，以降低胆固醇在血液中浓度，如manzoni和Rollini（2002）关于他汀类的一篇报道中如是说。 他汀类药物可以选择性抑制胆固醇的合成的限速酶，即HMG-CoA还原酶。因此，这些化合物便可以降低胆固醇含量，尤其是降低低密度脂蛋白

4、（LDL）或低密度胆固醇（“坏胆固醇”）含量，而稍微增加高密度脂蛋白胆固醇（“好胆固醇”）的含量，因此，防止动脉内斑块的集结。此外，他汀类药物已经运用于预防性药物前列心血管疾病，因为大量的临床试验数据显示，他汀类可以降低风险冠状动脉疾病的发病率和死亡率。这就解释了的他汀类药物在医疗和商业领域取得巨大成功的原因。2006年，两种他汀类药物出现于Forbes杂志的的名单之首，并入美国的20个最畅销药物之中，同为8.4美元和44亿美元的年销售额，预计他汀类药物使用量在增加。然而，由于有关他汀类药物的专利即将关闭，再加上多种生产过程的盛行，他汀类药物与仿制药的竞争也将更加的棘手。过去几年里，天然他汀类

5、药物（洛伐他汀和康帕丁）的生物化学和遗传方面在科学领域取得了重要进展。这些研究的生物技术开发创新也使衍生物的生产取得了显著进步。一组不同的研究已经表明，他汀类治疗已经超越了降低高密度胆固醇水平的生物效应。一些新的研究已经发现了他汀类药物许多新的生物（药）活性，如在癌症、阿尔茨海默氏症和与年龄有关的骨质流失等疾病的潜在应用。他汀类药物的历史发展他汀类药物可分为天然他汀类和半合成衍生物，以及合成他汀类药物。所有的天然他汀类药物都是hexahydronaphtalne内酯。第一种他汀类药物是由科学家Sankyo Co. Ltd在日本分离出来的，他在老鼠肝提取物通过真菌培养发现了可以抑制HMG-CoA

6、还原酶的化合物，这种物质由Penicillium citrinum所生产的，即原名为ML236B或美伐他汀，以后叫做康帕丁（Endo et 等1976年）。一旦弄明白了这种新化合物的潜力，默克公司的科学家便可以通过真菌进行选育。他们分离出了土曲霉，能够产生一种非常有效的他汀类药物：洛伐他汀（Alberts等人，1980年）。Endo et 等人（1979）从红曲霉中同样分离出同一种化合物，尽管这个物种不能经过工业生产而得到代谢产物。除了额外的一个甲基，洛伐他汀与康帕丁的化学结构是相同的。临床试验证明洛伐他汀可以显著降低低密度脂蛋白，而且副作用很小。1987年，食品和药物管理局批准洛伐他汀以Me

7、vacor的名称上市。Sankyo研制出了普伐他汀，是一种更有效的康帕丁衍生物。这个公司与Bristol - Myers Squibb公司联手注册分发普伐他汀和销售（如Pravachol销售）。Merck研制的洛伐他汀第二代半合成衍生物，目前仍占领着他汀类药物的第二大市场。这种衍生物就是辛伐他汀，虽然它是由洛伐他汀人工合成的，但它也可以利用生物技术进行生产。Merck赞助了纳维亚辛伐他汀生存研究，对2221个被确诊为中度高胆固醇血症（200-300毫克/分升）的病人运用了辛伐他汀。结果显示，使用辛伐他汀的患者不仅降低了胆固醇（25）含量和低密度脂蛋白含量（35），更重要的是，还减少42他们的死

8、亡率。这些成功的的业绩吸引了其他药品公司进入他汀类药物市场。他们花费一部分努力用于制造合成他汀类药物，紧随众所周知的商业名称为立普妥的阿托伐他汀之后，氟伐他汀（Sando Ag，Lescol）成为第一个完全合成的他汀类药物.这种产品很快成为了畅销药物。各种合成他汀类药物的结构是不同的，而且与天然他汀类药物的结构完全不同。只有戊二酰辅酶A的类成分，它负责抑制HMG-CoA还原酶，是常见的天然和合成他汀类药物。(Manzoni 和 Rollini 2002)。正如前面提到的阿伐他汀（立普妥），是最重要的合成他汀类药物，其次是氟伐他汀（Lescol），瑞舒伐他汀（Crestor），拥有较小的市场份额

9、。还有匹伐他汀也出现在目前商业化一些东方国家。洛伐他汀生物合成对红曲霉早期的研究表明，莫纳克汀 L和J是洛伐他汀的生物合成途径中间体（Endo等人，1985）。结果表明，莫纳克汀 L是由九个醋酸分子首先合成的，然后，反过来，经羟基转换为莫纳J克汀因子。羟基化反应中，18O2通过一个单加氧酶系统被纳入莫纳J，这个系统存在于红曲霉中自由提取的细胞色素P -450中（Komagata等人，1989）。随后的实验展示了莫纳克汀J转化为洛伐他汀的过程（Kimura等人，1990）。在土曲霉的研究中，经过使用标记前体表明，洛伐他汀的生物合成途径也开始醋酸，醋酸分子相互之间头尾相连连接成二聚链。甲基常常是在

10、侧链或蛋氨酸的C6上，并插入到结构中，然后关闭环（Shiao和Don 1987年）。然后，主练呈环化状态，有些他汀类的主链还会通过侧链C8主链环化。随之，经有氧氧化主链上的氧原子插入（Alberts等人1980，Greenspan和Yudrovitz 1985年，Moore等，1985年）。对P.citrinum 和 M.ruber进行的研究途径是相似的（Endo 1985; Chakravarti和Sahail 2004年）。因此，已经证明，洛伐他汀是由聚醋酸通过派生途径而来的（Moore等人，1985）。由Peeves、McAda和骨髓增生异常综合征Panlabs公司的学者首创基因研究确定

11、，I型聚酮合酶（PKS）基因对于土曲霉合成洛伐他汀是必不可少的（亨德里克森等，1999年）。它的产品也就是现在的洛伐他汀nonaketide合酶（LNKS）已被证明（马，唐 2007）要包括七个活性中心（活性中心序列：KS ketosynthase;MAT =丙二酰辅酶A：非加太酰基转移酶; DH=脱水;MT=甲基转移酶;KR= ketoreductase;ACP=酰基载体蛋白; CON=缩合域）。在LNKS（lovB）基因的表征为理解二氢莫钠L和洛伐他汀的碳链的组装设置提供了一个平台。此外，由于次生代谢的基因都存在于微生物体内，该基因还为克隆和定性其他参与洛伐他汀合成的基因提供了一个方便的通

12、道。Kennedy等人在1999年将此基因用作探针从基因组文库里面分离出两个粘粒，这两个粘粒包含完整的洛伐他汀基因产业集群。他们发现18个超过64 kb的基因的存在。这些基因中有两个（lovB和lovF）编码PKS。如前所述，基因lovB编码LNKS，而lovF编码diketide合酶（DKS）。在LNKS和DKS甲基域的存在表示，在这两种物质中甲基组可能是在聚合的过程中由S -腺苷甲硫氨酸添加上去的。此外，该基因的功能可能在很大程度上通过序列的比较而得到预测的。对其功能更多的了解，是通过功能诱变策略的缺失，通过中断群集中的单个基因。 现在很清楚，洛伐他汀合成簇包含两个I型聚（lovB和lov

13、F）合成酶基因。此外，lovE编码一个拥有典型的双核锌指结构的转录因子调控蛋白质。lovE中断突变体不能产生洛伐他汀或中间体，而过多的中断突变造成产生更多的代谢产物。据推测，lovE在转录水平上调节洛伐他汀的生产。然而，哈钦森等人于2000年发现有第二个具有相似的结构基因lovH。由于Keller和霍恩在1997年发现，大多数次生代谢产物集群包含一个专门的调节基因，所以洛伐他汀生物的合成过程是如何应用这两个调控基因的，这并不明显。另一方面，lovA和ORF 17编码细胞色素450单加氧酶。主要nonaketide -派生骨架合成需要LNKS（lovB），还需要至少一种其他蛋白（烯酰还原酶lov

14、C）与LNKS相互作用，并负责处理所需要的正确成长链，在没有lovC的情况下，LNKS就会形成共轭吡喃酮类化合物。LNKS是包含七个活性部位的聚酶物质，并以某种类似于动物脂肪酸合成酶方式和I型PKS的细菌的功能。此外，LovB正在减少迭代酶，使得病因不同于模块化、细菌型酶。LovB的最小领域是反复使用丙二酰辅酶A合成nonaketide萘烷核心。不同程度的polyketide剪裁后进行修改,每个缩合一步LovB由组合不同催化领域(包括上述所提到的分离enoylreductase,LovC)提供了关键中间体dihydromonacolin L。LovB也包含了一个C-terminus领域内同序列

15、的一个nonribosomal-peptide合成酶相似的领域。在其领域中，不了解dihydromonacolin生物的功能。最近,催化酶作为一个个体的领域已被用来分析生化和结构特点以及其他特点。马和唐(2007)检查了最小的洛伐他汀nonaketide合成酶didomain与蛋白质。他们调查表明,大多数检查的领域都能表示为独立的蛋白质,除了KS领域。LovB垫的显示板上对malonyl-CoA acetyl-CoA有强的选择性。这种LovB垫相比于哺乳动物的FAS垫领域显示明显的不同特性,特别是在acetyl-CoA基体的特殊性上。有趣的是我注意到, KS和FAS领域的广泛专一性是针对外源A

16、CP领域，也提供机会,让新颖的polyketide实体进行组合生物合成。莫纳J要求用细胞色素P450氧酶进行转化，可能由lovaA和ORF 16基因编码。 五碳侧单元侧链通过乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合合成了其他聚合酶的lovF产品（也称为作为LDKS）。由该LDKS组成了七域线性排列，依次是：KS，MAT，DH，MT，ER（enoylreductase），KR，ACP。diketide经过剪裁甲基化与还原由单个LovF催化结构域生产的-S-methylbutyryl tyioester共价连接到 phosphopantetheine臂酰基载体LovF蛋白域 (Kennedy et al. 1

17、999年）。编码基因lovD 2-mehtylbutyryl/monacolin transesterase催化的最后一步是连接在一起的二聚洛伐他汀，即transacylates组件，酰基从LovF到莫纳C8的羟基用来生产洛伐他汀（图2）。尤其是这种高度降低PKSs类型独特的特征之一是缺乏一个内置卸载域以便于完成发行产品。这是形成鲜明对比的细菌I型或非还原PKSs真菌，其中一个专门的thioesterasedomain是在megasynthase末端追加，催化聚酮所释的放。如前所述， 从LovF diketide侧链转移到莫纳 J的羟基是由一个分离酰基转移酶催化 LovD而生成（Kennedy

18、 et al.1999年）。使用策略重组催化领域的个别酶。 （2009a的）表明，proteinprotein LovF和LovD之间的相互作用在促进作用底物从LovF到LovD的diketide快速卸载发挥关键作用，以确保洛伐他汀的有效合成。也只有完全量身定制，RSmethylbutyryl - 机场核心计划才能由LovD访问（即无中间体的酰基转移）。一个可能的机制，可以将这一现象解释为， 甲基转移，脱水和烯酰削减步骤从acetoacetyl-ACP到KS活性部位可能发生的非常迅速。另一个可能性是，acetoacetyl-ACP可能无法访问的 LovD在裁剪步骤。 从应用的观点来看，可以看出

19、，这些知识对于品种遗传改良是非常重要的。例如，来源于洛伐他汀相关基因的启动子序列可用于基础选择配置报道，以迅速确定改进洛伐他汀生产株，Askenazi等。 （2003年）构建的菌株含有lovF启动基因融合的竹叶（phleomycin电阻）。这个转化子是经过诱变和电镀转化在phleomycin琼脂培养基上形成的。由此产生抗性种群表现出洛伐他汀的产量显着增加，可见这是一个复杂的有效合理的选拔制度。在其他一方面，有趣的是可以操纵lovB 生成新的化合物。然而，操纵生产的lovF不同侧链的化合物是更容易设想的，删除这个基因的活动也许会加进一步模块，可能允许在预测生物技术中生产各种洛伐他汀类似物，用化学

20、过程策略来代替而合成有价值的衍生品，像辛伐他汀(见相应的部分)。生物合成康帕丁 在P. citrinum and M. ruber中提出对洛伐他汀和康帕丁碳结合的研究，预测出了新的方法途径（1985年远藤等。查克拉瓦提和Sahai1（2004年）。后来，安倍等。（2002）康怕汀的克隆及其特征从桔青霉康帕丁中使用基因簇中得到类似的策略。九个基因，mlcA到mlcH和mlcR （调节器）在38 kb的区域集群，当康帕丁工作时分别转录。这些预测的氨基酸是由这九个基因所编码的，与洛伐他汀生物合成的编码基因相似。之后，在mlcA和mlcB和其他一些基因簇的启动子中，特殊途径的转录活化剂MlcR化合物序

21、列被确认及定位。值得特别注意的是，如果（compactin？）也是如此，引进多余拷贝的调节基因mlcR提高了代谢产物的产量。洛伐他汀和康帕汀的生产洛伐他汀（mevinolin或者monacolinK）是在马德里的CIBE实验室中从一种分离自土壤菌株中获得的并被分类于土曲霉一类；另外它也可以从M.ruber中获取(命名为monacolinK)。数年之后，洛伐他汀也可以从17种不同种属的monascus中提取（特别是包括M.ruber在内的一下菌种）。值得注意的是，种属monascus中，特别是anka和M purpureus这两个菌种,传统上在亚洲国家应用为“红曲”为，也应用于发酵食品(红麴大米

22、)和饮料产品，同时还有红色染料。然而,商业生产洛伐他汀是建立在terreus分批发酵的基础上而且大多数的文献资料是关于这个菌种的。A.terreus次发酵通常在约为28C，pH5.8-6.3，溶氧水平控制在40%的空气饱和度的条件下进行。分批次发酵一般进行大约10天。A.terreus的增长以及洛伐他汀的生产都是由Casas-Lopez研究的。研究结果表明洛伐他汀的生产受到了以下类型的碳源(乳糖、甘油但没有果糖甜)和氮源(酵母提取物、玉米发酵酒和大豆)的使用影响，并且C：N在培养基中的质量比也有影响。慢慢加入代谢的碳源(乳糖)同时结合要么豆粕或在N源控制下的酵母，可以提供最高的类似条件和特定的

23、产量。洛伐他汀在生物量方面最大的产量系数价值为30毫克/ g，只是在使用乳糖/大豆以及乳糖/酵母提取物作为培养基的条件下。最适的获得高产量的初始碳氮质量比洛伐他汀40。有些研究已开始采用响应面的方法确定培养基对洛伐他汀生的影响。自有了它的发现,洛伐他汀的生产研究就在摇瓶,实验室规模生物反应器并且在复杂和确定的培养基中进行。. Novak和Kumar为了提高洛伐他汀的产量提出了不同的分批培养策略，同时Porcel提出了一个分两阶段的培育策略。颗粒形态以及它与在曝气池中水动力条件和洛伐他汀发酵生产的培养基中耗氧量的关系也同样进行调查研究。最近,碳源和氮源以及发酵参数对洛伐他汀生产的影响也被Bizu

24、kojc和Ledakowics进行了评估检测。然而,A.terreus也能够生物合成其他化合物,从而使工业生产得净化阶段变得复杂。一个主要的生物代谢合成阶段是二苯甲酮，同样对引发自一个聚酮化合物的途径有反应。这种化合物是由典型诱变和筛选出的抑制剂的目标产物，并且有助于洛伐他汀增产。获得采用遗传工程工具等也会有同样的结果，即基因破坏。另一个重要的生物代谢合成是geodine,这也是聚酮化合物途径的一个产物。一些研究者探索了在控制发酵参数的洛伐他汀发酵过程中降低晶体，特别是在通风和pH控制值下降的情况下的对应策略。 用于工业生产生产过程洛伐他汀生产创立于1980年，当时使用一个土曲霉A。发展过程包

25、含了不同发酵参数的分析，比如培养的同源性，不同碳源的影响，ph，溶氧量，以及搅拌装置的设计。生产菌株的再分离以及ph控制和缓慢流加碳源，特别是甘油的使用，可以提高产量至最初的五倍。很显然,生产水平,是达到了180毫克/升。大部分的工业生产过程使用搅拌釜反应器,连续或间断的加入含氮的培养基。P. citrinum 进行相似的研究，用来发展发酵技术生产康百汀。几个重要的因素影响了康百汀的产量，如真菌的形态，pH，表面活性剂，培养基组分，以及被研究和优化的喂养的策略。在P. citrinum 和 P. cyclopium,的例子中，pellet-like发酵汤有较低的粘度，比丝状汤有较高的产量。重要

26、的努力，用来发现较高的洛伐他汀或康百汀菌株用来商业生产。菌株突变一般是通过紫外线或化学诱变剂，进而随机或者有意的提高产量。这种策略的有效性可以通过巨大增长的工业人工变种生产看到。明显的，A. terreus ATCC 20542（最初的洛弗斯塔特因生产商）的生产效率大概在每升15g。同样的，康帕丁工业菌种的生产率也已经增长到了大约15g每升。一种从Streptomyces carbopilus得到的突变体菌种，可以抵抗3 mg/l的康百汀和80%的转换产量被Metkinen (2009)得到。然而，随着洛伐他汀和康帕丁生物合成物以及其相应基因克隆领域知识的发展（stepping stones

27、toward），并通过分子遗传学技术方面的进步，提高了弗斯塔特因和康帕丁的商业生产。洛伐他汀的固态发酵尽管洛伐他汀传统的工业生产是用液面发酵，然而固体发酵很快成为了一种可以替代的工业生产系统。固态发酵是一种自古以来被很多东方国家使用的微生物培养系统 ，使用大豆大米等谷物来调制各种各样的发酵食品。在最近的20年不同的固态发酵系统已经被开发出了新的用途功效。几个比较研究表明，社保基金理事会经常SMF的优势，包括更高，更快的生产产品，改善过程。此外，一些抗生素只产于社保基金理事会，即使相应的生产者，真菌可以随时在SMF培养。在社保基金理事会此不同的生理原因尚不完全清楚，但它通常被称为“固体培养基生理

28、学”。几年前，印度Biocon公司开始发生了什么事情，就成为一个非常成功的工业规模生产洛伐他汀的社保基金理事会（和其他次生代谢物）。后来，美国食品和药物管理局（美国FDA）批准临床药物社保基金理事会用于生成真菌的起源（Suryanarayan 2003）。两种类型的系统社保基金理事会对使用的固相性质的基础进行区分：在天然固体基质上，这是最常见的系统。显然，该技术是基于对Plafractor，大规模的社保基金理事会生物反应器的使用，尽管这些发酵，也可在其他类型的社保基金理事会反应堆进行发酵，甚至在托盘里，其中固体培养加载在薄层托盘和其余的隔几厘米，放在温室里。第二个SSF系统包括对微生物在在液体

29、培养及表面的生存。这种方法有很多潜在的应用，包括在自然研究及高生产商业系统。差不多所有的惰性支持物都是糖甘蔗，最近Baos et al发展了一个新的洛伐他汀生产过程，通过SSF，在一个人工惰性支持物PUF上。这个系统使用TUB F-514菌株，固体培养基的理化性质可以被控制，30层的洛伐他汀可以被获得，这与在SMF获得具有相似的条件。此外，从SSF里每毫克菌丝生产洛伐他汀815g，而每毫克SMF的菌丝体，只生产洛伐他汀54.7g，在SSF里，一个特定的生产超过14倍。为了了解分子事件在SSF与SMF中代表的不同，作者表明分析了在洛伐他汀的生物合成的两种基因。结果表明，在SSF中与高洛伐他汀生产

30、相关的两个基因有较高的转录积累水平，要有更长的时间。lovE比smF要高4.6倍的积累水平，同样的，lovF与在SMF上获得的高水平的菌丝比，有高于两倍的积累。这些结果表明，第一次，在SSF上高产量的菌丝，是由于其生物合成基因的高转录。最重要的是，这些高转录水平是由于lovE的转录因子的高水平导致。而且，在SSF中的次级代谢中，这很可能含蓄的导致了它的高产。后来，这组的研究基于环境刺激，有着产生的理化变化导致菌丝高产。这允许用基因提升方法，产生适用于SSF的高产菌株。用这些方法可以获得突变，从原生性中获得。TUB F-514可以再PUF SSF系统中生产每单位27.9mg的菌丝。最近在报道用S

31、SF生产康百汀，Shaligram在小麦的bran-based SSF中达到每单位生产0.815mg.这从盘尼西林的野生菌株获得。普伐他汀的生产尽管康百汀不能用于制药，他是个重要的生产普伐他汀的来源，一个更有效地衍生。在第一阶段桔青霉生产康百汀。普伐他汀在第二阶段有链霉菌中的康百汀的生物转化得到。再生产普伐他汀的几个用来工业神产的有效过程中，进行了几组研究来达到高转化速率，着通过在培养基中加入大量的康百汀。一个重要的问题是增加量康百汀会到至细胞生长的抑制。高浓度会导致菌丝体的分解，康百汀转变成普伐他汀的转化提升。由Park等人提出，设计的过程是康百汀的持续培养，是它的集中浓度在100 mg l

32、1。普伐他汀的产量高于在间断喂养康百汀时的1.5倍。另一方面，Chen等人设计的快速筛选方法分离康百汀的抑制菌株，对康百汀的6进行羟基化。大约2%的目标微生物可以这么筛选获得。有趣的是，在分离培养基时找到了可侦查的产物。Ykema 等人的很重要的通知时用一步生物合成过程生产普伐他汀。通过用S. carbophilus的氢化基因转化P. citrinum菌株，是康百汀转变成普伐他汀。一些转化后的模板可以生产量到达9.5 mg/L，这很低。一个低康百汀生产用菌株是要转化的，用来当这种模式的例子。通过生物技术生产辛伐他汀，在菌丝研究的发展和康百汀的生化和基因，通过生物技术获得半合成衍生物也获得了更多

33、的关注。例如，辛伐他汀可以通过用康白汀的生物合成直接发酵，也可以用酰基转移酶LovD从monacolin J中分解。辛伐他汀从洛伐他汀的半合成中获得，用Merck as Zocor标记。是美国第二畅销药。在2005的年销量达到12 billion美元。洛伐他汀与辛伐他汀的不同在侧链的8号位碳原子上。在这个位置,洛伐他汀携带2-methylbutyrate基,sinvastatin有2、2-dimethylbutyrate基。如今人们已习惯于这种化学让洛伐他汀直接烷基化。然而,化学反应条件非常稳固,最终产品很难净化、劳动保护和环境保护的要求是非常高的。这几步过程是辛苦,从而利于辛伐他汀的价近5倍的