提高春小麦幼胚离体培养中愈伤组织诱导及分化效率的研究百度文.docx

1、提高春小麦幼胚离体培养中愈伤组织诱导及分化效率的研究XX文提高春小麦幼胚离体培养中愈伤组织诱导及分化效率的研究张金林1，石明辉2，许瑞3，李唯4 王锁民1,*1兰州大学草地农业科技学院 农业部草地农业生态系统学重点开放实验室，兰州 7300202甘肃省酒泉市农科所，酒泉 7350003甘肃中医学院，兰州 7300204甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州 730070*通讯作者：E-mail: jlzhang摘 要：为了提高春小麦生物技术育种中愈伤组织诱导和植株再生效率，本文以甘肃省7个春小麦品种为试验材料，探讨了接种方式、基因型、胚龄和植物生长调节剂等因素对幼胚培养中愈伤组织诱导及分化的影响。

2、结果表明：供试春小麦品种出愈率不受盾片放置方向的影响，而盾片向上放置的分化率明显大于盾片向下放置的；春小麦幼胚离体培养的有效胚龄期为1420d，最适宜的胚龄期为16d ；基因型对愈伤组织诱导无影响，但对愈伤组织再生能力有极其重要的影响；随2,4-D 浓度的增加春小麦幼胚分化率呈单峰曲线变化，且品种间差异很大，对大多数品种而言，适宜的2,4-D 浓度为16 mg/L。0.2 mg/L NAA和0.2 mg/L IAA能有效地诱导芽快速生根，生根率分别达到83.8%和55.1%。关键词：春小麦；愈伤组织诱导；芽分化；植株再生；效率中图分类号：S5035.31. 引言随着生物技术的迅速发展，运用基因

3、手段进行品种改良日益受到重视。利用植物体细胞培养技术诱导产生突变体，或建立转基因受体系统的研究已取得了一定的成就，积累了大量的成熟经验。在几种主要的禾本科作物中，小麦体细胞组织培养的成功虽然比玉米和水稻略晚一些，但据近年的报道，用小麦未成熟胚、幼穗、嫩叶、种子、成熟胚、胚轴、顶端分生组织、胚芽鞘的节或根等作外植体，都已获得成功14。研究表明，上述各类体细胞组织中以幼胚作外植体最为实用，具有取材方便，操作简便，便于诱变处理，诱导分化率高，接种与出苗能够配合小麦生长季节等特点。其中幼胚作为组织培养的外植体已受到人们的广泛重视。这一技术不仅是取得远缘杂交的有效方法，而且也为遗传学研究开辟了新途径46

4、。利用小麦幼胚离体培养技术进行小麦育种具有投资少、见效快、可大大缩短育种年限等优点，是当今世界小麦育种研究中一个新的开发领域7。但小麦幼胚离体培养再生频率低(远低于水稻 ，而且不同基因型之间还存在很大差异，有些基因型特别难于再生810，这都严重妨碍了小麦基因工程研究工作的顺利开展。因此，研究小麦组织培养条件和植株再生频率的影响因素依然是小麦生物技术育种中有待于解决的重要课题。本文以7个春小麦品种为实验材料，探讨了接种方式、基因型、胚龄、植物生长调节剂及其他处理对幼胚培养中愈伤组织诱导及分化的影响。 基金项目: 兰州大学交叉学科青年创新研究基金 (LZU200516和教育部新世纪优秀人才支持计划

5、 (NCET-05-08822. 材料与方法2.1 试验时间及地点研究田间试验于1999年在甘肃农业大学农学院植物生理生化研究室试验田进行，室内试验在植物组织培养试验室进行。2.2 试验材料供试春小麦(Triticum aestivum L. 品种有红农1号、永良4号、甘春20号、陇春16号、定西24号、定西33号和定西35号等7个品种，均由甘肃农业大学作物栽培与耕作教研室提供。2.3 外植体的获得幼胚材料来源于开花后1426d的春小麦幼穗，先用流水冲洗30min ，无菌条件下70%的乙醇消毒2min ，无菌水冲洗23次，再用0.1%的氯化汞消毒12 min，无菌水冲洗34次。用镊子和解剖针剥

6、开颖壳，取出幼胚，立即接种到培养基上。2.4 培养基2.4.1 愈伤组织诱导培养基 MS + 2.5mg/L 2,4-D + 0.5mg/L KT + 20g/L麦芽糖+5.0g/L琼脂。2.4.2 继代培养基 MS + 2.0mg/L 2,4-D + 20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂。2.4.3 分化培养基 MS + 0.2516.0mg/L 2,4-D + 2mg/L KT + 20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂。2.4.4 生根培养基(1MS + 0.2mg/L NAA + 20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(2MS + 5mg/L IBA + 20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(3MS +

7、0.5mg/L PP333 + 0.5mg/L NAA + 20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(4MS + 0.2mg/L IAA + 20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂(5MS + 0.5mg/L 6-BA + 20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂以上所有培养基pH 均控制在5.8，高压蒸汽灭菌20min in (1.1 kg/cm2 。2.5 春小麦幼胚离体培养过程春小麦幼胚离体培养一般分为以下几个过程：选材煎取幼穗消毒无菌操作取出幼胚接种培养愈伤组织诱导继代培养芽分化培养生根培养，产生幼苗。资料表明，大多数学者都采用以上方法3,5,713。2.6 培养条件温度：251；光照强度：18002000

8、 Lx；光周期：16h/d。2.7 数据统计处理方法2.7.1 胚龄的计算 将春小麦幼穗开始开花到接种时所经历的天数(d定义为幼胚胚龄。2.7.2 出愈率的计算 出愈率(%=(诱导出愈伤组织幼胚/接种幼胚数100%。2.7.3 分化率的计算 分化率(%=(分化出芽幼胚数/诱导出愈伤组织幼胚数100%。2.7.4 生根率的计算 生根率(%=(生根幼胚数/分化出芽幼胚数100%。3 结果分析3.1 幼胚盾片放置方向对春小麦愈伤组织诱导及分化的影响供试三个品种的出愈率均为100%，可见，出愈率不受盾片放置方向的影响；而三个品种的分化率差异却很大，盾片向上放置的分化率均明显大于盾片向下放置的(表1 。

9、表1 幼胚盾片放置方向对春小麦愈伤组织诱导及分化的影响基因型 盾片方向接种幼胚数出愈幼胚数出愈率(% 分化幼胚数 分化率(% 甘春20号 向上160 160 100 45 28.0 甘春20号 向下161 161 100 27 16.9 定西33号 向上166 166 100 81 50.0 定西33号 向下161 161 100 42 26.3 定西35号 向上169 169 100 104 61.4 定西35号 向下 161 161 100 60 36.33.2 最适胚龄的确定三个供试品种各期胚龄出愈率都为100%，可见，出愈率也不受胚龄及品种的限制；而分化率在同一品种的不同胚龄期或不同品

10、种之间都存在差异，总的趋势是16d 时分化率最高，其次是14、18和20d ，而24d 和26d 胚龄时基本上没有分化(表2 。可见，春小麦幼胚离体培养的有效胚龄期为1420d，最适宜的胚龄期为16d ，其分化率最高可达61.4%。表2 胚龄期对春小麦幼胚离体培养出愈率和分化律的影响胚龄(d14 16 18 20 24 26 品 种 出愈率(% 分化率(% 出愈率(% 分化率(%出愈率(%分化率(%出愈率(%分化率(%出愈率(%分化率(% 出愈率(% 分化率(%红农1号 100 17.4 100 61 10015.61004.4 1000.9 100 0 永良4号 100 20.8 100 5

11、6.310018.71007.5 1000 100 0 定西35号 100 18.9 100 61.410016.71004.5 1000 100 03.3 不同基因型对幼胚离体培养的反应3.3.1 不同基因型对愈伤组织诱导的影响 四个品种的出愈率都为100%，这说明年基因型对愈伤组织诱导无影响，这与前面的实验也相一致(表3 。可见，虽然基因型不同，但只要取样得当，操作不出问题，出愈率都可以达到100%。3.3.2 不同基因型对愈伤组织分化能力的影响 不同基因型之间的分化率存在着差异(表3 ，这说明基因型对愈伤组织分化率有很大影响。对本试验结果经LSR 测验可知，除了定西24号与甘春20号、甘

12、春20号与定西35号之间不存在极显著性差异以外，其他任意两个基因型之间都存在极显著性差异。说明基因型对愈伤组织再生能力有极其重要的影响，只有选择完全苗分化率较高的基因型材料才有可能产生更多的变异类型。表3 不同基因型对春小麦幼胚愈伤组织诱导率和分化率基因型 出愈率(%分化率(%每块愈伤组织分化芽数甘春20号100 50.00 24 定西24号100 58.62 25 定西33号100 30.98 24 定西35号100 43.01 133.4 2,4-D浓度对不同品种春小麦愈伤组织分化率的影响2,4-D 浓度不同，分化率明显不同(图1 。品种不同，分化率随2,4-D 浓度变化的程度也不一样，总

13、的趋势是随2,4-D 浓度的增加分化率呈单峰曲线变化。永良4号变化幅度最大，其最高分化率为56.35%，此时2,4-D 浓度为4mg/L；其次是定西24号，其最高分化率为26.2%，相应的2,4-D 浓度为2.0mg/L；分化率随2,4-D 浓度变化最小的品种是定西35号，其最高分化率仅为4.5%，相应的2,4-D 浓度为1.0mg/L。可见，2,4-D 浓度对分化率的影响随品种而异，一般在14mg/L范围内分化率最高，2,4-D 浓度超过4mg/L时分化率逐渐降低。 图1 2,4-D浓度对不同品种春小麦愈伤组织分化的影响3.5 不同植物生长调节剂对生根的影响表4 不同植物生长调节剂对生根的影

14、响植物生长调节剂类型浓度配比(mg/L 生根率(% 发达程度NAA 0.2 83.8 极为发达IBA 5.0 0 无根PP333+NAA 0.5+0.5 20.43 不发达IAA 0.2 55.14 发达6-BA 0.5 39.25 较为发达对照 0 38.39 较为发达以春小麦品种定西35号为材料，探讨了不同植物生长芽调节剂对生根的影响。结果表明0.2 mg/L NAA能有效地诱导芽快速生根，再生成植株，生根率达80%以上，并且根系丛生，须根粗长，盘曲，极为发达；5 mg/L IBA不促进生根反而抑制生根；0.5 mg/L PP333+0.5mg/L NAA有促使芽再生丛生小芽，并使芽矮壮的

15、作用，但丛生芽较不规则，在主芽的基部大量不定向丛生，这样就抑制或延缓根的产生，只有少数芽生出根。0.2 mg/L IAA1020304050600.250.51.02.04.08.016.02,4-D浓度(mg/L分化率(%促使生根率达到55.14%，所生须根正常，比对照更为发达。0.5 mg/L 6-BA 促使生根率达到39.25%，略高于对照，根系的发达程度也与对照相当(表4 。4 讨论与结论4.1 供试春小麦品种的出愈率不受盾片放置方向的影响，而盾片向上放置的分化率明显大于盾片向下放置的。这与王常云等的研究结果一致10，因而，在小麦幼胚离体培养育种中，盾片向上放置有利于获得更多再生苗及无

16、性系供后代选择。4.2 春小麦幼胚离体培养的有效胚龄期为1420d，最适宜的胚龄期为16d 。赵占军等14以扬麦158为试验材料，结果表明，幼胚组织培养最适宜的胚龄为1416d。但王睿辉等15研究表明胚龄对小麦幼胚体细胞胚性无性系的高频率诱导有显著影响，表现为愈伤组织诱导率(出愈率 和胚性愈伤组织诱导率在不同胚龄下差异显著。4.3 基因型对愈伤组织诱导无影响，但对愈伤组织再生能力有极其重要的影响，只有选择完全苗分化率较高的基因型材料才有可能产生更多的变异类型。余桂荣等8发现，不同基因型间在愈伤组织的诱导、分化和植株再生方面有显著差异，并筛选出小麦品种89(117在组织培养时反应良好，幼胚愈伤组

17、织的绿原基分化率和出苗率分别为83.3%和32.2%，显著高于其他19个品种的平均值72.5%和19.6%。吉前华和任正隆9研究发现，栽培小麦品种的组织培养能力存在广泛变异性，并指出有针对性地培育小麦转基因受体具有重要意义。4.4 随2,4-D 浓度的增加春小麦幼胚分化率呈单峰曲线变化，且品种间差异很大，对大多数品种而言，适宜的2,4-D 浓度为16mg/L。Shah 等1研究表明，3.5 mg/L和2 mg/L 的2,4-D 分别取得最佳的出愈率和分化增殖率。Shohael 等3 发现，将用1 mg/L 的2,4-D 诱导出的胚性愈伤组织转移到无激素的MS 培养基上即可以成功的再生出植株。H

18、aliloglu 7研究发现，2 mg/L 的2,4-D 最有利于体细胞胚的形态发生。陈军营等17研究表明，在添加0.1 mg/L ABA的基础上再添加2.5 mg/L或5.0 mg/L AgNO3的诱导培养基对幼胚愈伤组织形成和分化最为有利。4.5 0.2 mg/L NAA和0.2 mg/L IAA能有效地诱导芽快速生根，再生成植株，生根率分别达到83.8%和55.1%。蔡黎明16研究表明，1/2MS+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L 6-BAP的激素配比对小麦单倍体幼胚离体培养的效果最好，尤其诱导生根的效果更好。于晓红等18将愈伤组织分化的芽转接于含0.2 mg/L NAA的1/

19、2MS培养基中，结果诱导芽快速生根。绝大多数研究表明1/2MS比MS 更有利于生根，而本实验采用了MS 培养基，在这一点上需要改进。参考文献1 Shah MI, Jabeen M, Ilahi I. In vitro callus induction, its proliferation and regeneration in seed explants ofwheat (Triticum aestivum l. Var.lu-26s J. Pakistan Journal of Botany, 2003,35(2:209-217.2 Fileka M, Zembalab M, Szechyn

20、 ska-Hebdaa M. The influence of phytohormones on zeta potential andelectrokinetic charges of winter wheat cells J. Zeitschrift fr Naturforschung C, 2002, 57:696-704.3 Shohael AM, Akanda MAL, Parvez S, Mahfuja S, Alam MF, Islam R, Joarder N. Somatic embryogenesis andplant regeneration from immature e

21、mbryo derived callus of inbred maize (Zea mays L. J. Biotechnology, 2003, 2(2:154-161.4 Abebe T, Guenzi AC, Martin B, Cushman JC. Tolerance of mannitol-accumulating transgenic wheat to waterstress and salinity J. Plant Physiology, 2003, 131:1748-1755. 5 Patnaik D, Khurana P. Wheat biotechnology: a m

22、inireview J. Electronic Journal of Biotechnology, 2001, 4(2: 1-29. 6 Patnaik D, Khurana P. Genetic transformation of Indian bread (T. aestivum and pasta (T. durum wheat by particle bombardment of mature embryo-derived calli J. BMC Plant Biology, 2003, 3(5:461-471. 7 Haliloglu K. Wheat immature embry

23、o culture for embryogenic callus induction J. Journal of Biological Sciences, 2002, 2(8:520-521. 8 余桂荣,尹钧,郭天财,牛吉山.小麦幼胚培养基因型的筛选J.麦类作物学报,2003,23(2:14-18. 9 吉前华,任正隆.小麦组织培养能力在栽培品种间的变异J.四川农业大学学报, 2004, 22(1: 6-9. 10 王 常 云 , 王 作 全 , 李 晓 亮 , 王 志 新 , 周 德 强 , 卢 建 声 . 小 麦 幼 胚 离 体 培 养 育 种 技 术 研 究 J. 麦 类 作 物,19

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26、ficiency of In-vitro Immature Embryo in Spring Wheat (Triticum aestivum L. Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystem, Ministry of Agriculture, College of Pastoral Agricultural Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020 2 Jiuquan Institute of Agricultural Science and Technology, Jiuq

27、uan 735000 3 Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000 4 College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070 Abstract Effects of inoculation direction, genotypes, embryo ages and plant growth regulators on callus induction and differentiation eff

28、iciency of in-vitro immature embryo of seven Gansu local spring wheat cultivars were investigated in this research. The results indicated: inoculation direction had no significant effects on callus induction, but had significant effects on differentiation with up-shield inoculation having higher dif

29、ferentiation efficiency; the effective embryo ages for in-vitro immature embryo culture ranged from 14 days to 20 days, the optimal embryo age was 16 days; Callus induction had no significant difference among genotypes, but Callus differentiation and regeneration had great difference among genotypes

30、. Differentiation rate presented single-curved trend with the increase of 2,4-D concentration, varying among genotypes, the suitable 2,4-D concentration for most of the cultivars was 16 mg/L, 0.2 mg/L NAA 和 0.2 mg/L IAA induced rooting promptly, with rooting rate up to 83.8% and 55.1%, respectively.

31、 Keywords：Spring wheat, Callus induction, Differentiation, Regeneration, Efficiency 1 Zhang Jinlin1, Shi Minghui2, Xu Rui3, Li Wei4, Wang Suomin1 作者简介：张金林，男，1975 年生，讲师，博士研究生。主要从事植物组织培养、植物逆 境生理和分子生物学方面的科研、教学工作。参加或主持国家、省部级和校级等多项课题的 研究；在New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science植物生理学通讯中 、 、 国沙漠西北植物学报草业学报中国农学通报 、 、 、 等学术刊物上发表论文 20 余篇。 -6-