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1、完整版IPP使用教程Image pro-Plus6.0 使用教程感谢丁香园战友:hbchendl 提供教程畅想先锋-整理2010.07.01一、入门既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛。在你开始学习使用 IPP 之前，我假定你是会初步使用 office 及 photoshop 等常用程序的。如果一点电脑常识也没有，那还是先学点简单的程序再回来玩IPP。因此我跳过了打开图片，copy 、paste、象素的概念之类最基础的知识与操作。这些用不着我来讲。这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。处理目标是通过测量图片中黄色部分的黄度来反映相应蛋白表达的的量。对该图片进行观察，可以

2、看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆， 三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作 AOI(area of interest)。AOI 是 IPP 中最有用最重要的概念。如何能够准确地选取 AOI 就是使用 IPP 的关键操作。一旦准确地选取了 AOI，下面的测量分析就好办了。在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在 IPP 程序里，可以通过设置颜

3、色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。可以说，使用 IPP 的要点就是灵活地使用各种 AOI 工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。对不同的图片，需灵活地使用各种适当的 AOI 工具，先用最简单的，当然，简单的工具只能作简单的事，就这张图片来说，用简单工具选黄色有点困难，我们先用它来选择蓝色的细胞核吧。点击 measure-count/size,弹出分类测量窗口。在窗口中选中 manual,再点击 select color,弹出颜色选择窗口 segmentation,这个工具是 IPP 最有特色的颜色选取工具之一。用好这个工具是使用 IPP 的要点。对于目标颜色鲜明

4、的图片，用吸管工具是最简单的。点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。用红框圈起来的四个工具按纽分别是:吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色。图片中被标上红色的区域被定义为一个 class,其中每一个独立的小区块被定义为这个 class 中的一个 object。以此图为例，图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的细胞核都被选中成一个 class，其中每一个细胞核就是一个obj

5、ect。选取完 AOI 后，点击 close 回到 count/size 窗口，下一步就可以对选中的object 进行测量操作了。点击 count/size 窗口中的 measure 菜单，点 select measure，这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测量选择窗口左侧列出了各种可用的测量选项，最常用的测量有:area 面积density(mean)平均光密度diameter 直径IOD(integrated optical density)累积光密度在相应的项目上点一下，该测量项目就被选到中间的窗口中了，同时关于该测量的详细说明会显示在最右边。如果想取消某个已选中的测量项目，则在左边窗

6、口中该项目上再点击一下就可以了。选好了待测量的区域，也指定了测量项目，就可以进行测量统计了，点击一下测量选择窗口的 OK 纽，关闭这个窗口，就回到了 count/size 窗口，再点击一下 count 按纽，就可以看到程序在进行测量，稍等几秒钟即可读取测量数据。分别点击 count/size 窗口中 view 菜单中的 measurement data 和 statistics，就分别弹出这两个数据窗口。前者是这个 calss 中每一个 object 的测量数据，后者是这些测量数据的统计参数，如总数、平均值、累加、标准差等。本例中得到的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径、累积光密度值。统

7、计数据则可得到这张图片中所有细胞核的平均面积、平均光密度值，平均直径、累积光密度值，当然还有细胞核的数目，就是所有object 的数目。测量数据转入 EXCEL 处理起来最方便。只要在数据菜单中点 file - DDE to EXCEL。数据就传到 EXCEL 的 sheet1里去了。在这个示例图片的统计数据中samples 为图中所有细胞核的个数。第一列为 area,其中的 Mean 值为各个核的平均面积，后面就是平均灰度、平均直径，这些是有意义的测量统计数值。但 IOD 却是 SUM 值更有意义。订正：在上述操作中漏掉了一个重要步骤，就是要转换图象 intensity 格式。在默认的 in

8、tensity 格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。转换光密度单位的方法如下:点击:measure-carliberation-intensity，调出 intensity 校正窗口。然后在窗口中点 new 按纽，再点一下下面的 std optical density 选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。然后还要点一下最上面的 system 按纽。最后点 close 关闭窗口。这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。 关于光密度较正的详细内容请参见第十

9、帖及第十一帖。校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行。将光密度单位设定为 system 之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。整个分析测量过程就是这样。当然，光知道这一点是远远不够的。在以上所述各个步骤中有许多技巧和方法能使测量数据更加准确合理。本人将另发帖子分别详细叙述。欢迎大家提问。此主题到此结束。IOD=density(mean) * Areadensity 反映了阳性蛋白的浓度或强度，但 IOD 能反映选定区域的蛋白表达总量。一个典型的示例是:阳性样品切片中有大片的黄色区域，而阴性切片上只有少量的黄色区域，但是两者的黄色都很深。这样测量的阴性切片与阳性切片的黄色区

10、域的 density mean 就没有差异，差异在于其黄色区域的面积上。如果是一个不典型的图片呢:一个黄色深但面积较小，另一个黄色浅却面积较大，那一个蛋白表达更强?这时用IOD 就更准确了。二、AOI技巧（1）在 IPP 中，最有特色，最有用处的工具有两个。一个就是我们已经看过的 segmentation 工具，另一个是 irregular工具。我们先看 irregular 工具。这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具。图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞，为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就是要选取每个细胞的边界线。这就可以用到 irregular 工具了。在工具栏上点一下

11、那个不规则园形的按纽，就调出了 irregular 工具条。这个工具的标题叫Magic wand，就是 photoshop 中的魔棒呀。将鼠标移至图中一个细胞的中间，光标就变成魔棒了，在一个位置左键点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的区域。这里相似的定量范围由 Range 的值来决定。较大的值为较大的灰度范围，点一下能选中一大片区域。较小的 range 值则为较小的灰度范围。在一个区域上多点几下，就能选中这个区域的整个边界了。最后点一下右键，就确定了一个不规则形状的选定区域。点一下左边的问号，就能看到相应的使用说明。smooth 值是用来平滑区域边界的。一般不需要平滑，因此默认值为零。选

12、中一个区域后如果还要在同一张图片上再选另一个区域，不能直接点选，要先点击一下工具栏上的 MultipleAOI 按纽，再点击 add，接下去就可以到另一个选择区域点选。选好一个新的区域后再回去点 Multiple AOI-add 确认，再继续下一个，直到选取完所有的 AOI。最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作。结束后如果又想再增加选择区域，只要再点一下 newAOI 按纽，就可以调出工具条继续增加选择区域。这个 irregular 工具还有另一个操作方式，在问号旁边有个 trace 按纽，点一下它，工具条就变成另一个样子了。这种操作方式是沿着孤立图像的边缘寻迹，从而画出一个沿着孤立形状边

13、缘围成的一个 AOI。第一种是手画法。确认工具条右边的 Auto 选项没有打勾，将光标移至目标图形处按住左键拖出一个闭合图形， 点右键结束。用鼠标画当然是不会准确的。实在没别的招了才会出此下策。第二种方法是自动寻迹。把那个 Auto 给选上，speed 值给减到 1(慢速看得清楚)，在目标图形的边缘处左键点一下鼠标，然后沿着边缘稍移动一下鼠标后再点击一下左键，这是给程序指明一个寻迹的方向，马上就能看到光标自动沿着边界走起来了，一直会走到起点处才会停止。这样就自动围成了一个闭合区域，点一下右键就确认了这个 AOI。重复选取多个 AOI 的方法与楼上一样。如果目标图形边界清晰，那么这个工具是非常管

14、用的。可惜的是在许多情况下边界是模糊不清的，光标走到此处时会乱走一气。这时就要及时先点一下鼠标使光标暂停下来，然后在期望的方向延长再点一下左键，给程序指明一下前进的方向，如此多次，直到光标回到起点为止。最后点一下右键围成一个闭合的 AOI。围好的 AOI 边界是绿色框。自动寻迹挺好玩吧?不过别忘了我们的目的。选好了一个个的 AOI 后当然是要测量每个区域的几何尺寸及光密度啦。下面该怎么作呢?点开 count/size 窗口，点菜单 EDIT-convert AOI to Objects.这样就把刚才选中的一个个 AOI 变成了要测量的object 了，那些小区域的颜色也由 AOI 绿色外框线变

15、成了 object 的标记了。object 的标记类型是可以自己设定的。在 count/size 窗口右边有一个 option 按纽，点开它就能设定 object 标记的外观了。在 option 窗口中，outline style 可以选outline(轮廓线)或 filled(填充 class 颜色)。label style 可以选择为 object 序号或测量值。再下面是 label 的文字颜色。右上角还有一个 class 的颜色选择按纽。估计大家自己试一下都会用的。下一步是点 measure 菜单下的 select measurements。选上要测量的项目。注意，选完后要点击这个菜单中

16、的 measure 按纽(而不是 count/size 窗口中的 count 按纽)。然后是 OK 按纽关闭 measure 窗口，点开 view 菜单下的 measurement date 和statistics 数据窗口。几个 object 的测量数据就已经在里面了。如果你还想继续增加objcet，可以直接用 irregular 工具画 AOI，然后点 convert AOI to object。这期间把数据窗口留着不关闭，可以看到新增的object 测量数据会立即被更新。三、AOI技巧（2）在上一主题中讨论 的主要是 irregular 工具，它对于大个的孤立图形对象的选取是有用的。而面

17、对组织切片中密密麻麻的细胞，就得用本主题讨论的 segmentation 工具了。实际上，在第一部分入门中所用的就是 segmentation 工具，在那里我用颜色吸管选取了图片中蓝色的细胞核， 但是如果仔细观察一下选取的效果就会发现，有一些挨在一起的两个以上的细胞核被识别成了一个，另有一些蓝色的杂质颗粒被错误地识别成了细胞核。如果你试着用吸管工具选取一下图中黄色的免疫反应表达区域，就会发现因为黄色很浅，很不容易准确地选取。所以对于 segmentation 工具还需要有更多的应用技巧。火锅在我之前已经介绍了不少，我在这里班门弄斧是为了保持我这个系列主题的内容完整。同时也是系统地整理一下这个工

18、具的使用方法。让我们还是从打开图片并调出 count/size 窗口开始吧。对这种色彩饱和度低，各种成分颜色区别很小的图片来说，用吸管是很难准确选择到正确的颜色区域的。在 count/size 窗口里选中 manual，并点 select color 调出 segmentation 窗口。窗口里有两个表单，一个是 color cube based，另一个是 histogram based。如果你测量的对象颜色单一，色彩对比大，则使用 color cube based 中的吸管就可以方便地选择到需测量的区域。而对于那些有颜色深浅及亮度不同的测量区域，我们要选取后者， 并且使用 HSI 颜色格式来

19、进行分色选择。当切换到 HSI 时，会弹出一个窗口提示你会 reset 颜色选择，是否继续?当然是 OK 啦。这时的颜色选择全部重置为 0-255。在 HSI 颜色格式中，H 为色调，就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S 为色饱和度，I 为强度。在选择AOI 时，首先保持 S、I 为最大范围，从 H 中选择黄色部分。使用这个颜色格式的好处是，选择的颜色能包括这种颜色的不同深浅及亮度。最适合于测量免疫组化图片。点一下H，直方图显示就是图片各象素 H 值的分布，在直方图的两边各有一根线，这就是选择线，先将右边的线用鼠标左键向里面拉，拉一点停一下看看效果，可以看到最开始时是选中了全部画面，然后是

20、蓝色的区域慢慢显露出来，并且越显越多，选择线的位置也在下面的窗口中有显示，是 0-255 之间的数，共有两个窗口，左边是取值下限，右边是取值上限，先不断减小上限值使得非黄色区域不断地显露出来，再不断增加下限值让另一部分非黄色的区域也显露出来。这张照片中黄色区域为 H:0-33。色饱和度 S 与强度 I 都直接设为 0-255。这就是说，只要是黄色，就被认为是阳性表达的区域。选好了颜色范围，点 close 关闭 segmentation 窗口，回到 count/size 窗口，点 measure 的select measurement ， 选中 area, density(mean),IOD。坏

21、事了，这个窗口的 measure 按纽是灰色的，不能用。回到 count/size 窗口， 按 count 纽，也一样不好用或者点 count 后计算的区域根本就不是刚才选取的正确区域。这是使用 HSI 选色时最常犯的错误:只是操作顺序不对。正确的操作顺序是:先打开 select measurement，选择好各个测量项目，再回到 count/size 中点 select color 进行颜色选取，再回到 count/size 窗口中点 count 计数。这样操作结束后仔细观察一下计算的区域，正是刚才正确选取的区域了。这样选取的区域还是有一点不准确。图片中被选中的区域有许多很小的选点，显然这是

22、各种杂质，并不是成片的蛋白表达区域。对这些杂质小点有一个有效的方法来去除，就是测量过滤。(filter)打开select measurement 窗口，点一下中间被选中测量项目中的 area 项，使其加亮。这时下面的 start 与 end 选项就变黑可调了。对 area 来说，默认值一般是 0，意思是不管区域有多小，都被计入测量范围内。现在我们把它改为 50，也就是说，忽略了象素点小于 50 的杂质点，不予计算在内。改完后点一下旁边的 Filter 按纽，再点 measure 按纽。或者回到 count/size 窗口内把 Apply Filter Ranges inRange 前面的选项给

23、勾上，再点 count 按纽。这回就把小杂质点全给过滤掉了。过滤是一种很有效的选取 AOI 的手段，除了定义面积范围进行过滤以外，还可以选取 BOX X/Y 测量项目，这是 object 外切长方形的长宽比，如果是园形的object，这个值应该是 1，在作园形的细胞计数统计时，把这个值的范围设定在 0.5 到 2.0 之间，就可以滤掉长条形的杂质 Object,当然同时也可以设面积过滤范围。把那些通过颜色选择不能排除的 object 给进一步排除掉。类似的测量选项还有 Radius Ratio 等，通过这些测量值的过滤，可使得 AOI 选得更加准确。显微镜图象千差万别，每一次进行分析都需根据具

24、体的图像情况来选择 AOI 方法。前面所述的各种技巧需交替应用。凡是玩电脑都必会有一个 reset 键。不管作错了什么事，按一下 reset 键就可以全部重新来。选 AOI 也是这样， 如果选得不合心意，想全部重新来的话，按 count/size 窗口中的 delete 键，就可以把刚才作的一切都给全部推倒重来了。另外还有一个是反向选择。在选文件夹与 word 的 edit 菜单里都有这项功能。segmentation 里也有这个哟。在前面的图象里，选好颜色后，点一下用红圈标注的那个按纽，就实现了反向选择。凡是玩电脑都必会有一个 reset 键。不管作错了什么事，按一下 reset 键就可以全

25、部重新来。选 AOI 也是这样， 如果选得不合心意，想全部重新来的话，按 count/size 窗口中的 delete 键，就可以把刚才作的一切都给全部推倒重来了。另外还有一个是反向选择。在选文件夹与 word 的 edit 菜单里都有这项功能。segmentation 里也有这个哟。在前面的图象里，选好颜色后，点一下用红圈标注的那个按纽，就实现了反向选择。关于 segmentation 窗口中其他一些按纽的用处，大家可以从帮助文件中查找。尽管帮助文件是英文的，看起来有点困难，但中文的帮助文件翻译得不准确，有时比英文的还难懂呢。总结一下 segmentation 工具的用法，有两种，一种是在

26、color cube based 模式中用颜色吸管来选取目标颜色。另一种是在 Histogram Based 模式中利用 HSI 范围来选取目标颜色。二种方法各有其优点，其共同之处就是把图片中相同颜色的区域给定义成一个 class，以便对它们进行分析处理。在 segmentation 窗口的下方还有一些有用的功能。在priview 框中，上面一个选项是对选择的区域标注ckass 颜色的，可以选择不标色，只标当前class 颜色(currentclass)或者所有 class 颜色。下面一个选项则是对选中区域与非选中区域分别标上不同颜色的选择，我一般选择 class color on trans

27、parent。这样在选择颜色时能观察尚未被选中的部分。如果把一部分选成 black，其效果就等于把这一部分从图象中抠去，这个处理也是很有用的。标注上了 class 颜色的图象可以点 creat priview image 按纽来另存成一个新图片，窗口最下方的 file 按纽是用来保存颜色选取参数的。这个颜色参数文件非常有用。在处理一组多个图片的时候， 不能每个图片都选择一次颜色，这样各个图片的选择标准不一致，而且费时间。先处理一张典型的图片，把颜色选择参数保存成一个文件，在处理下一张图片时，只要把这个文件再调出来就行了。这个操作在使用宏操作时是必须的。segmentation 工具与 irre

28、gular 工具在 count/size 中可以灵活应用。1.单独使用 irregular 工具画一个或几个孤立区域，只测量它们几个的各种参数。2.单独使用 segmentation 工具，对颜色对比明显的区域可简单使用吸管选色，对颜色不明显的图片用 HSI 格式来选择同样色调的区域。3.同时使用 irregular 与 segmentation 工具，前者可以限制图片上的一个测量范围，后者则选择了这个范围内的特定颜色区域。具体作法请看下面几楼 super270 的跟帖。这可是高级的 IPP 技术呀。相比之下，实际上我讲的都是基本的，初级的使用方法。4.在选色窗口中还有一个 class1 的下

29、拉对话框，就是说，我们可以分别选择两种以上颜色，然后同时计算它们的各种参数。例如，我们可以先选择蓝色的细胞核并给它们标上紫色的标记色，再新建一个 class2，选择黄色的免疫组化染色区域，并给它们标上红色。有时候我们会不得不使用这个技术：有的照片照得偏蓝色。这样在使用segmentation 选择黄色的区域时会发现，一部分黄色的 HSI 值在 0-30，而另一部分黄色区域的 HSI 值却在 230-255 之间。这时就不得不分别选择两个 class，分别计算其 IOD 及area 之后再把它们相加起来。这大概也算是高级一点的技术吧。补充：不规则区域计数1 使用不规则 AOI 工具划出感兴趣的区

30、域。2。然后在 Count/SizeManualselect color 窗口，使用选色滴管选择感兴趣的颜色。在预览状态下，整幅图像内的同类颜色都被显示为选中了，但是不要紧.3.返回 Count/Size 主菜单，点 Count 钮，只有 AOI 内的对象被计算了。4.这样我们就将不要的周边区域“细胞”的干扰去掉了，然后进行选色，再计数。遭了，但是不能计数啊， 怎么办呢是这样的，把不规则区域选定后，选择自动计数/测量按钮，然后选择编辑，然后选择将 AOI 转换为对象，然后计数，再 delete，然后才能重新选色，以后的步骤就同陈老师说的一样了。还有一种可能是你忘记关闭最后的 AOI。把干扰区域

31、填成白色或黑色是可以的。这就跟在镜下选择一个适当的视野一样。用重复选 AOI 的方法对于初学者来说很容易出错，但是当你使用 IPP 熟练了以后，这个方法将非常有效。软件就是这样，高级的技术使用起来很有效果，但学起来得费点事。再次强调在测量前一定要作光密度较正。否则测出的 IOD 值是无效的。四、编制宏我以前也不敢轻易使用宏，但是处理过大批量的数据之后才发现，宏是非用不可的工具，而且编制宏并不难。实际上宏不过是把一连串的操作集合到一个操作的有效工具。当你只处理一张图片时，可真的用不上宏。但是当你作了两组实验动物，每组 5 只，每只动物切出来五张组织切片，每张切片选取了 5 个视野拍下了照片，这就

32、一共有 2*5*5*5=250 张照片。如果你用 IPP 处理一张照片用时两分钟，就一共需要 500 分钟=8 小时。这还不包括你因为操作错误所耽误的时间。在处理一组照片时还有一个重要的因素要考虑，当你选取 AOI 时，是根据眼睛的判断来作出选择的，在两张照片之间仅用眼睛来判断很难保证这之间的判断在客观上完全一致。更何况 250 张照片呢?所以，如果你需要处理大量的图片，花点时间学习编制自动操作的宏是值得的。例如：一大批图片，需要把它们的象素调整到一个较小的值以便上传到网上。一大批图片，对每张图片进行一个扣背景的操作。这些简单的操作虽然只需点几下鼠标，但乘以 100 就费事了，作一个宏操作，处理每张图片只需按一次快捷键， 就省事多了，还不容易出错。对于分析免疫组化图片这样的复杂操作，制作一个宏来进行分析，节省下来的时间就更可观了。首先