病理制片过程.docx

1、病理制片过程病理制片过程病理制片过程 在临床病理科和组织学实验室，切片是最重要的技术之一。切片的质量不好，就无法对标本进行观察。好的切片机只是整个样品制备过程 中的一个环节。要制备一张好的切片，必须要将技术、知识和技巧进行完美的结合。 待切片样品的质量是非常关键的因素，而样品质量有取决于前期处理工作的准确无误（例如：固定、巨检、脱水和包埋）必须选择正确的切片机型号以及合适的钢刀或一次性刀片。切片必须根据实际应用出发，需要根据样品的类型、大小、期望的厚度认真考 虑，还要兼顾操作者的便利性和舒适性。 要且出高质量的切片，经验丰富的操作者也是必不可少的条件之一。操作者必须懂得切片机的工作原理，能够对

2、机器进行精细调节以达到 最佳效果；并且能应对常见故障，消除一些潜在的切片问题；还可以运用恰当的切片技术，提高切片速度但不影响质量。 目前能做病理组织切片的地方很多，但要数上海舜田生物做出的病理切片相对质量上比较好，该公司有1位专业从事病理实验的老师及相关实验技术人员，积累了丰富的实验经验，所作出的切片及染色效果相当不错。1 正确处理标本的重要性1.1 固定 正确的固定是病理制片技术中最重要的一步，这个步骤会影响到后续的每个环节。如果固定不充分，样品的质量就会有欠缺。组织必须在 选定的固定剂中浸泡足够长的时间，使大分子保持固有形态。正确的固定可以防止样品在脱水剂中发生变性以及后期处理步骤对于样品

3、造 成的损害。固定不充分可能增加切片的困难，表现出过度收缩，并且会导致细胞核染色不足和/或胞核呈现“泡沫”状。 1.2巨检 样品需要修切成薄片，并尽可能做到均匀，否则很难在切片机上切出好的片子。如果样品太厚以至于无法渗透充分，则必须经过再次处理 才能进行切片。这样会影响样品的质量，更浪费时间。从最初的步骤开始就正确处理会使后面的工作更简单，因此在大体取材的时候多花 些功夫会为以后的步骤节省大量时间和精力。备注：包埋盒塞满组织且组织过厚就无法很好的固定，后续的处理步骤也会效果欠佳。1.3脱钙 为了后期进行石蜡包埋切片，骨组织需要进行脱钙，钙必须被完全去除才能确保切片的完整，并且可以防止刀具的损坏

4、。在用酸溶液进行 脱钙之前，骨组织必须经过彻底的固定，这样其中的软组织成分才能够被保护，且防止细胞核在酸的作用下被破坏，比如蛋白质水解作用 。1.4组织处理（脱水） 组织经过一系列经典的处理过程，是使原本亲水性的组织最终可以用疏水性的介质进行包埋，比如石蜡，火棉胶和绝大多数树酯。备注：样品无论是处理不充分还是处理过度，都可能导致切片效果不理想。脱水机旋转升降式脱水机目前仍有一些病理工作者使用，但是全自动全封闭负压/压力式脱水机逐渐占据主导地位。后者更有利于保护工作环境 ，更确保组织和试剂的充分作用，可以更有效缩短脱水时间。一些更先进的全自动全封闭脱水机还可以自动记录试剂的使用情况，并对试 剂进

5、行智能监控和更换。 有一点非常重要，就是处理过度对组织造成破坏绝对不亚于处理不充分造成的后果。多种因素，比如试剂的种类，处理步骤的多寡，处理 时间的长短，试剂的清洁度以及加热、真空和/或压力的使用都会影响具体某个样品的处理程度。 注：不同来源和不同大小的样品最好不要共用同一个处理程序，这样可以避免其中部分样品处理过度，而部分处理还不充分。处理步骤：（一）脱水： 脱水的关键就是将样品置于脱水试剂中足够长的时间，其中的游离水分子被除去，但是脱水时间也不宜过长，否则结合水分子也会被除去 ，会导致结构的变化。而脱水时间过短致使水分还残留在样品中，就会导致包埋介质无法很好渗透入样品。但是，脱水过度会导致

6、样品的 皱缩变脆。从过度脱水的组织块上切到的切片，一旦放入水中，切片就会膨胀最后破碎。如果将整个组织块浸入水中，则组织的表面会因 为水化而膨胀，这样再进行切片，虽然片子的性状会有所改善，但是形态学会发生改变，而且染色后会发生色彩偏淡，对比度较弱。最常 用的脱水剂是乙醇和变性酒精。甲基酒精有毒性，会破坏肝脏中的甲醛，因此不太单独使用。异丙醇是乙醇最佳替代物，常规在微波处理 中使用。丁醇，剧毒，适用于较慢的组织处理过程，而且多用在植物和动物组织。 无水酒精往往会含有水分，因此最好能检测一下试剂的纯度。可以用液体比重计来测定，也可以将几毫升酒精滴入几毫升二甲苯或甲苯， 如果混合液出现混浊就表示酒精中

7、至少含有2的水分。（二）透明：用来进行透明的试剂和脱水剂以及包埋介质必须非常容易混合。如果组织在透明剂中时间不够，那么组织就会发软甚至呈糊状。略微延长 时间并/或定期更换新鲜溶液可以避免透明不足的问题。最常用的透明试剂如下： 二甲苯： 目前仍被广泛使用的一种芳香烃类化合物，能够快速替换组织中的乙醇。在正确的脱水步骤后，芳香烃能够改变样品的折射率并使组织变 透明。当有水分存在的时候，二甲苯会变混浊，这时必须更换。作用时间过长会导致组织变硬，尤其一些纤维、肌肉中枢神经系统或软骨 组织更容易变硬。如果发现组织在完成处理后变得太硬或发脆，请减少透明的时间或者寻找二甲苯替代物。请注意，微波处理过程不需要

8、 使用透明剂，可以降低组织处理过度的风险。二甲苯替代物： 苯烯试剂或者短链脂肪酸碳氢化合物（烷烃）也得到了快速普及。苯烯试剂不会像二甲苯那样使组织发生硬化，但是前者更容易污染石蜡 ，因此石蜡需要定的凝固点。“凝固点”是制造商使用的术语，其实相当于“ 熔点”。这个温度是指在石蜡中插入小木棒后，石蜡开始在木棒上凝固的那个温度。凝固点和熔点温度往往是同一个温度或者在两个温度 之间。市售石蜡的特性往往根据其添加物和熔点的不同而有一定差异。56C 到 58C这个范围被常规实验室中普遍应用。较低熔点的石蜡(50C 到 53C)往往有其特殊的应用。一般情况，低熔点的石蜡往往比较柔软，因此更适合包埋较软的组织

9、。进行较薄的切片比较困难，但是很容易连片。（可以选购质地较硬 但是熔点较低的石蜡。）相反的，高熔点的石蜡一般比较硬。对于质地较硬的样品，这样的石蜡有更好的支撑效果，而且很容易得到薄切片，但是连片就比较困难 了。1.5.4样品夹具在切片以前，完成包埋的蜡块必须固定到切片机的样品夹具上。夹持力必须确保样品能被完全固定，因此蜡块往往会附着在一个支持物上 ，比如塑料包埋框或者环行样品夹。在不使石蜡变形且避免造成切片形状不规则的前提下，用最大的力量夹持支撑物。请注意，石蜡块必 须牢固附着于支撑物（例如，在包埋盒中必须有足够的石蜡充填），并且支撑物的背后必须接触实心物体的表面。 塑料 最常用的支撑物就是简

10、单并独立使用的一次性包埋盒。与市售的模具配套使用，蜡块的平面会很平整，且边缘能在X和Y轴向上保持平行 。用相同方法包埋的一批组织块不需要对表面进行调节或仅需要很小的调节。 环行模具也偶尔会用到，其中必须充填足够的包埋剂，而且不能夹持太紧。圆形的支撑物经常在塑料包埋时使用。木块： 这是廉价的包埋盒替代物。尽可能使用硬质木材（避免使用松软的松木）并进行切割以适合夹具的形状。木块的表面可以开槽，从而增加 黏附力。注意：木制的支撑物在水中浸泡后会膨胀，导致在样品夹上固定效果欠佳。 金属： 金属支撑物在塑料包埋时使用较多。金属支撑物可以重复使用，但是相对比较贵，在使用时需要进行X/Y向的定位调节。而且调

11、节这个 平面有一定的难度。如果组织块附着恰当，这种夹具的稳定性非常好。 使用切片机必须遵从最佳的工作秩序，无论使用钢刀还是一次性刀片，切缘必须锋利，并且不能有任何缺口或杂质附着。2.切片机及相关附件耗材简介2.1切片机的类型2.1.1轮转式： 轮转式切片机有一个控制精确进样的手轮，手轮进行360的旋转，控制样品头竖直向下经过刀刃然后竖直向上回到处于最高点的起始 位置。在到达切片行程最高点的时候，样品头会按照设定的切片厚度水平向朝前运动，然后再开始向下的行程。这类切片机常规进行石蜡 或塑料包埋样品的切片。2.1.2平推滑动式： 平推滑动式切片机是一种水平向运动的切片机，其刀架固定不动。样品位于刀

12、的下方，进行切片。这种切片机通常用来切特别大或者特别 硬的样品。2.1.3平推雪橇式：平推滑雪橇式切片机是一种水平向运动的切片机，其样品头固定不动。刀架在样品的上方运动，进行切片。一些轻型的切片机可以进行常 规切片，而重型切片机可以用来切特别硬或者特别大的样品。2.2切片机常见的功能回缩功能：无回缩功能：没有回缩功能的切片机，当样品头下降的时候，组织块就经过刀锋，随后沿同一平面上返回到起始位置，然后样品头按照指 定的厚度前进重复下进行下一个动作。有回缩功能：带回缩功能的切片机，当样品头向下移动时和无回缩切片机的动作完全一样，但是在样品头上升时，样品头会离开原来的平 面，朝刀刃的反向移动，从而防

13、止样品表面和刀锋接触。这个功能有很大的好处，因为首先可以延长刀的使用寿命，还可以减少样品表面 可能的摩擦（从而降低热膨胀），并且防止碎屑积聚在的刀刃背面并确保切片的一致性。 安全功能：手轮锁：切片机一般都配备手轮锁，可以将手轮锁定于任意位置，防止机器闲置期间意外触及手轮，导致人员意外伤害样或品头撞击刀具 。更人性化的切片机往往还配备第二手轮锁，手轮把手只能被锁定于最高点，便于在切片过程中随时更换样品或刀具。 刀架护刀器：无论钢刀刀架还是一次性刀片架，都应当配有牢固的护刀器，在更换样品或机器闲置的时候用户一定要养成良好习惯，将护 刀器覆盖在刀刃上方，对人员和刀具都是一种保护。好的的护刀器必须能安

14、全地覆盖刀刃的全长。 自动切片机安全性：自动切片机必须有紧急制动装置，防止在自动操作过程中有意外发生。人性化的切片机往往无法一键启动，必须依靠 组合键才能使马达运转，这样可以最大限度避免意外启动造成的人员伤害或机器损坏。 2.3操作特点：手动：手动切片机不具备电动切片功能。粗修和切片都必须由操作者手动完成。半自动：半自动切片机往往只有一个驱动马达控制进样，没有切片马达。全自动：全自动切片机有两个驱动马达，既能控制粗进样也能进行切片。2.4刀具分类：2.4.1重复使用型刀 要长时间保持刀刃的锋利，刀必须在不同的阶段进行很好的锻造以达到恰当的平衡。质地较软的刀往往刀刃不锋利，而质地很硬的刀比较 脆

15、，容易在切片过程中刀刃崩裂。经过锻造的刀通常用来切石蜡包埋、火棉胶包埋、冰冻和较软的工业样品。 锋利而无暇的刀刃是获得一张好切片的基础。磨得比较好的刀，斜面很小，从侧面观察，斜边笔直，不会出现锥形。斜边上出现锥形会使 刀刃发生弯曲，导致刀刃只在某个点上贴近蜡块，而其余部分相对远离。所以减小斜面很重要，否则刀刃更多的区域就需要进行打磨以避 免刀对样品的刮擦。刀刃上的擦痕显然会影响切片的质量。放大100倍对刀刃进行观察，应该看到一道很细的反光，呈笔直、不间断的 明亮的细线。不理想的刀刃看上去是不规则并有中断的线条。 刀的角度：刀刃上用来进行切片的区域是由两个相交的平面组成，叫做切面。在这两个平面之

16、间形成的夹角叫做斜角，（通常27-3 2），这个角度通常大于楔角（通常15-18） 在切片机上进行角度的调节：当刀安装到切片机的刀架上时，必须呈一定角度，这样才能在刀刃接触组织平面的那个小平面和组织块平面 之间形成一个间隙。这个角度就是间隙角。在切片机上都一个数字刻度表示间隙角的大小，这个读数在不同的切片机上可能会有差别。更 换了不同的切片刀后，这个数值可能需要调节。寻找合适角度的方法，最好采取试错法。 刀片的宽度同样会影响到间隙角。经过多次磨刀后，刀的宽度会变窄，为了和样品有一个正确的切入点，刀必须被抬高。刀架必须经过调 节，这样被磨过（变窄）的刀的刀锋必须处在和新（宽的）的刀锋一样高低的位

17、置。 不同的剖面：“B”型刀的剖面略向下凹，刀刃处很薄。现在除了在柔软的石蜡包埋或者火棉胶包埋切片中使用外，很少再用到。“C”型刀是一种剖面为楔形的标准刀具，两侧面是一个平整的面(剖面为等腰三角形)。在常规石蜡切片、冰冻切片、硬质火棉胶和较 软的工业样品切片中使用。“D”型刀剖面呈楔形，两条侧边不对称，刀刃非常锋利。这类刀在较硬组织的切片时使用，例如塑料包埋样品或者较硬的工业样品。 不同的长度：重复使用型切片刀有很多不同的长度。长度在120mm的短刀推荐在冰冻切片时使用，160mm和185mm的刀常规 应用于轮转式切片机，而更长的刀通常在平推式滑行切片机或平推雪橇式切片机。 注：所有的刀都应当

18、表面涂抹油脂后存放，以免生锈。2.4.2一次性刀片 一次性刀片，采用优质的不锈钢，由于其便利性和经济性，在绝大多数实验室里作为重复使用型刀的替代品。大多数的切片机都带有集成 的刀片刀架，但是一次性刀片也可以插入安装在标准钢刀刀架上的刀片夹内使用。 宽型和窄型刀片：一次性刀片通常区分为宽型和窄型，这就表明了刀的宽度。大多数窄型刀宽度为1/4英寸（约6mm），厚度为0.010英寸（约0 .23mm）；也有制造商采用厚度为0.012英寸（约0.27mm）的规格。宽型刀大约宽度为1/2英寸（约11.4mm）， 常规的刀片厚度通常在0.012英寸（约0.27mm），重力刀片（硬组织切片专用）厚度可达0.

19、033英寸（约0.75mm） 。实际的尺寸可能因为不同的制造商会有很大的差别，其中可能有些刀片在宽度和厚度上无法适应刀架。请确保刀片和刀架之间兼容性。 无涂层vs.带涂层： 一次性刀片的表面可以带有很薄的镀层或涂层。不同制造商可能采用不同的涂层，但是几乎所有的涂层中都会含有聚四氟乙烯（PTFE ）类聚合物中的一种，这是一种类似Teflon的环保型涂层。涂层的好处在于可以防止刀刃氧化，延长刀片的使用寿命并且可以降低 摩擦力从而减少切片压力。但是如果涂层过厚也会有坏处，最初的几张切片可能卷曲或者打卷，给人造成刀片“过于锋利”的感觉。当刀 片切过数张片子后，涂层被磨去部分，则卷曲的现象会有所改善。在

20、一些物体的表面摩擦刀片这种方法不是很值得推荐。有时候，降低涂 层所造成的摩擦反而会导致连片的困难，切片很容易互相分开。 无涂层的宽型或窄型刀片和有涂层刀片除了表面缺少保护性涂层，通常是一样的，前者往往涂抹优质的油。这种无涂层刀片有时也被称作 “经济型”刀片，因为它们比有涂层刀片价格便宜。刀刃夹角： 绝大多数窄型刀片会有一个大约35的夹角(每个侧面各自夹角则为17½)，而宽型刀片的夹角为32到35。在 制造过程中，夹角可能会有细微的变化。刀片一侧的夹角甚至可能和另一侧的角度略有不同。这就可以解释为什么有时候刀片某一面切片 的效果比另一面好，或者不及另一面。切片机上的角度调节： 不论

21、是嵌入钢刀架内的一次性刀片夹还是一体化的刀片夹都会有一个用来调节间隙角的读数指示，这个读数在不同的切片机，不同的刀架 可以有所不同。当使用不同制造商提供的刀片或者使用不同高度的刀片时，间隙角可能会需要进行相应调节。确定一个适当的角度最好的 方法可能就是“试错法”。（试错法即不断尝试并排除错误可能的方法）。 刀片压板的状态： 压板的作用是将一次性刀片固定在恰当的位置，因此压力板必须保持清洁，也不能有任何损坏。如果在压板表面有明显可见的弧度，而这 部分又会和刀片接触，并导致刀片发生弯曲。因此刀刃会以一种不正常的方式接触阻止块的表面。同样，刀片上的碎屑也会导致同样的效 果。刀夹的夹力： 作用在刀片上

22、的压力必须均匀分布在刀片被覆盖的全部长度。力度必须足够大以确保刀片的稳定，防止任何可能的振动。但是也不能夹持 过紧，否则会导致刀片弯曲而切出不规则的切片。为了达到这种微妙的平衡，需要在反复实践中提高技巧。 3.正确的切片技术：3.1人体工程学和因工造成的肌肉骨骼损伤： 工作习惯合并日常生活方式很可能导致职业相关的肌肉骨骼损伤，比如腕管综合症，肌腱炎和腱鞘炎。不恰当使用切片机完全可以造成潜 在的伤害。在这里，我们会介绍一些实用的小诀窍：a.添置一把符合人体工程学的座椅。调节座椅高度，保证手可以轻松够到手轮，且不占用搁置腿脚的空间。如果脚不能踏到地板，请使 用脚凳。b.将水浴缸放置在切片机区域旁L

23、型的延伸段，这样只需要稍微转动身体和椅子就可以够到水浴缸，不必频繁倾斜身体。c.转动手轮最好完成一周的旋转。最好不要以摆动方式摇手轮（即半刀法）。d.将精确进样手轮的把手的直径增加到1.5英寸（约35mm）。包裹把手的材料可以是有弹性并光滑的物质。e.使手臂尽量贴近身体，不要将手靠在工作台的边缘或者任何尖锐的表面。不要将肘部外展侧伸出。f.在进行切片时，保持肩膀处于放松的位置。不要扛着肩膀工作。尽量使颈部的肌肉放松。颈部肌肉处于紧张状态会阻断该区域的血液 循环，导致神经被压迫。g.经常稍事休息。做体操或者自我按摩以便恢复血液循环并消除紧张。h.如果可能，尽量采用自动化。3.2切片机的设置： 在

24、切片机上设定的切片厚度即表示了手轮旋转一圈后样品头精确进样的距离。但这并不意味每张切片一定是这个厚度。有很多因素都会影 响到切片的厚度，比如温度、切片速度、切片压力、刀的角度、仪器的润滑程度等。判断切片厚度的最好办法就是在显微镜下观察。当然 ，有经验的病理技师在切片时，将切片漂浮在水浴缸中，此时就可以随时识别切片厚度的变化。 3.3样品块的放置（水平vs.垂直定位）： 样品的定位往往由操作者的判断来决定，但是实际情况往往是样品块的底部先接触到刀刃，因此定位应当根据这个实际情况出发。如果样 品是包埋在塑料包埋盒上的话，应当确保夹具均匀夹住两个对等的表面，即包埋的两个侧面。如果样品夹竖直夹住包埋盒

25、印有标记的那个 侧面，这会导致一些样品变得不稳定，因为作标记的侧面往往带有角度并且面积相对较小。如果切片时发现效果很差，可以尝试将样品旋 转90。3.4刀的角度： 当刀或者刀片安装在切片机合适的刀架上以后，刀架必须有一定的倾斜度，这样刀的夹角才能和样品表面之间形成一个间隙，这就是间隙 角。如果倾斜度不恰当，刀刃夹角会因为楔入效应而对组织块的表面造成挤压，就会导致跳片或者厚薄不均切片的产生。间隙角的读数在 不同的切片机会有各种差别。使用不同的刀或者不同的刀片或者更换不同制造商，都需要对间隙角进行略微的调节。要找倒合适的角度， 最好的办法就是试错法。3.5修片厚度： 在修块的时候一定要非常小心，避

26、免把蜡块中的组织不小心剥离出来，切片上就会出现一个空洞。修块的厚度不能超过30mm到50m m，如果可以，尽量再薄些。3.6浸湿法： 如果组织脱水过度显得过于干燥，如不略微增加湿度，就会给切片造成很大的困难。可以用冰块来涂擦已修整过的组织块表面或者将修整 后的蜡块面朝下在湿润低温的表面上放置一段时间。利用这种方法，只有最初的几张切片可以复原。因此，正确的组织处理可以在很大程 度上避免再次增加组织湿度的工序。3.7切片速度/切片厚度： 切片的速度对于切片厚度和整体质量都会造成很大的影响。提高切片速度一定会降低切片的质量。最佳切片速度往往因的组织的类型而异 ，但是通常的规律是手轮完成一周的旋转约耗

27、时一秒钟。在切片的行程中，当组织碰到锋利的刀刃那一刻，切片动作不要有任何迟疑和停 顿。3.8室温和组织块温度： 室温会影响组织块的切片特性。如果房间非常温暖，那么石蜡就会变的难以切片，凉爽的房间是最理想的。但如果房间温度低，就不太容 易得到连续切片，因为在刀和蜡块摩擦时产生的热量不足以帮助切片和切片之间互相粘连。对于操作者，还有些因素也产生负面影响。如 果有气流直接吹向切片机、水浴缸或者操作区域，则必须改变风向。 组织块的最适宜温度不是一成不变的。用冰块冷却组织块有助于切较硬的组织，因为这样做可以使组织和石蜡之间保持均匀一致的硬度。 如果将组织块放入温水中，则可以使硬度均匀降低。用喷雾冷却剂来

28、冷却组织块的表面，效果并不理想。如果必须要使用，那么尽量只喷 洒极少量，以防止组织块表面结冰或者整个组织块开裂。3.9水浴缸的温度： 对于绝大多数石蜡，水浴缸的温度一般设定在40C到44C。如果温度高于45C，切片的皱褶会很快消失，并且石蜡会溶解。3.10静电： 在冬天，静电是很常见的，如果增加环境的湿度，静电很容易被消除（在室内烧水）。用干燥纸摩擦工作区域也会有所帮助。3.11自动切片特点： 自动和半自动切片机因为种种原因而日益普及。这类切片机不仅降低了因工造成的肌肉骨骼疾病，而且在电动切片的时候可以确保整个切 片行程的连续一致，从而提高了切片质量。自动切片最大的好处就是切片力量始终恒定，切片运动不会有任何迟疑和停顿。切片速度可以 随时能够进行调节，而且大部分自动切片机也有手动操作模式。 当操作者从手动切片机切换到自动切片机的时候，会有一个学习过程，在正式投入日常切片工作以前，操作者最好能够有几个星期来充分 适应自动的操作模式。