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1、酶工程教案酶工程简介酶工程（enzyme engineering）是在1971年第一届国际酶工程会议上才得到命名的一项新技术。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。 根据研究和解决问题的手段不同将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。第一章 酶学概论（Enzyme）新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化，都是在酶催化下进行的。生命的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。第一节 酶的一般

2、概念一、酶的概念及化学本质（一） 酶的概念：酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。（二） 酶的化学本质：绝大多数酶是蛋白质,少数是核酸RNA，后者称为核酶。本章主要讨论以蛋白质为本质的酶。二、酶的组成与分类（一） 根据酶的组成成分，酶可分为：单成分酶（单纯酶）、多成分酶（复合酶）单纯酶(simple enzyme)是基本组成单位仅为氨基酸的一类酶。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均属此列。 复合酶(conjugated enzyme)的催化活性，除蛋白质部分(酶蛋白apoenzy

3、me)外，还需要非蛋白质的物质，即所谓酶的辅助因子(cofactors)，两者结合成的复合物称作全酶(holoenzyme)，即：全酶酶蛋白辅助因子(结合蛋白质)(蛋白质部分)(非蛋白质部分)酶的辅助因子可以是金属离子，也可以是小分子有机化合物。常见酶含有的金属离子有K+、Na+、Mg2+、Cu2+、(或Cu+)、Zn2+和Fe2+(或Fe3+)等。它们或者是酶活性的组成部分；或者是连接底物和酶分子的桥梁；或者在稳定酶蛋白分子构象方面所必需。小分子有机化合物是一些稳定的小分子物质，其主要作用是在反应中传递电子、质子或一些基团，常可按其与酶蛋白结合的紧密程度不同分成辅酶和辅基两大类。辅酶(coe

4、nzyme)与酶蛋白结合疏松，可以用透析或超滤方法除去；辅基(prosthetic group)与酶蛋白结合紧密，不易用透析或超滤方法除去，辅酶和辅基的差别仅仅是它们与酶蛋白结合的牢固程度不同，而无严格的界限。大多数维生素(特别是B族维生素)是组成许多酶的辅酶或辅基的成分。它们的化学结构式见下章维生素。体内酶的种类很多，而辅酶(基)的种类却较少，通常一种酶蛋白只能与一种辅酶结合，成为一种特异的酶，但一种辅酶往往能与不同的酶蛋白结合构成许多种特异性酶。酶蛋白在酶促反应中主要起识别底物的作用，酶促反应的特异性、高效率以及酶对一些理化因素的不稳定性均决定于酶蛋白部分。常见的辅酶，如下表所示：辅酶形式

5、主要作用所含B族维生素硫胺素焦磷酸酯(TPP)-酮酸氧化脱羧、酮基转换作用硫胺素(B1)6,8-二硫辛酸-酮酸氧化脱羧硫辛酸辅酶A(CoA)酰基转换作用泛酸黄素单核苷酸(FMN)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)氢原子转移氢原子转移核黄素(B2)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)氢原子转移氢原子转移尼克酰胺(PP)磷酸吡哆醛氨基酸代谢吡哆素(B6)生物素羧化作用生物素(H)四氢叶酸一碳基团转移叶酸5-甲基钴铵素5-脱氧腺苷钴铵素甲基转移钴胺素(B12)(二)根据酶的结构特点及分子组成形式分为：1.单体酶 ：只含一条肽链，分子量小，大多数水解酶属于此类。2.寡聚

6、酶：由几条或几十条多肽链组成，每条肽链是一个亚基，单独的亚基无酶的活力。如己糖激酶、乳酸脱氢酶，均含四个亚基， 谷氨酸脱氢酶含六个亚基。3.多酶复合体：若干个功能相关的酶彼此嵌合形成的复合体。每个单独的酶都具有活性，当它们形成复合体时，可催化某一特定的链式反应，如丙酮酸氧化脱羧酶复合体，含三个酶六个辅助因子；脂肪酸合成酶复合体，含有六个酶及一个非酶蛋白质。(三)根据酶的存在状态分为：胞内酶、胞外酶1.胞内酶：在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶，大多数的酶属于此类。2.胞外酶：在合成后分泌到细胞外发生作用的酶，主要为水解酶。三.酶催化作用的特性（一）酶与普通催化剂的共性：1.只能催化热力学上允

7、许进行的反应，对于可逆反应，酶只能缩短反应达到平衡的时间，但不改变平衡常数； 2.酶也是通过降低化学反应的活化能来加快反应速度；3.酶在反应中用量很少，反应前后数量、性质不变。（二）酶催化作用的特性：指酶不同于一般的催化剂的性质。1、高度专一性：酶的专一性：也称为酶的特异性(specificity)，它是指酶对所作用底物(substrate)的选择性。根据酶对底物的选择方式不同，酶的专一性分为：（1）、绝对专一性(absolute specificity)：指一种酶只选择一种底物作用，如脲酶。（2）、相对专一性(relative specificity)：指一种酶选择一类底物作用。根据酶选择的

8、对象不同又分为：键专一性(bond specificity)：指酶对所作用键的选择性，如脂肪酶。基团专一性（族专一性,group speicificity）：指酶对所作用的键及键一侧的基团的选择性，如-D-葡萄糖苷酶，胰蛋白酶。（3）、光学专一性(optical specificity )：指酶对所作用底物立体构型的选择性，如L-氨基酸氧化酶。（4）、几何专一性(geometrical specificity )：指酶对所作用底物顺反异构的选择性，如顺乌头酸酶。2、高效性：酶比一般的普通催化剂效率高106-1013倍。3、反应条件温和4、易变性5、酶的活力（activity）受多种因素的调节与

9、控制四、酶的命名与分类（一）酶的命名：通常采用习惯命名法，主要根据以下几个原则：1、根据酶作用的底物来命名：如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等；2、根据酶催化反应的性质来命名：如脱氢酶、脱羧酶、水解酶等；3、根据酶的来源、作用条件等来命名：如细菌淀粉酶、碱性磷酸酯酶、胃蛋白酶等。 从上述可知，酶的习惯命名法不够系统，不够准确，难免会出现一酶多名或一名多酶的现象。为此1961年国际酶学委员会（Enzyme Commission，EC）提出了系统命名法，系统命名法规定，酶的名称包括两部分：底物名称和反应类型，如果反应中有多个底物，每个底物均需列出（水解反应中的水可省略），底物名称之间用“：”隔开。若底物有

10、构型，也需标出，如L丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶。(二)、酶的系统分类方法：根据酶所催化反应的性质，由酶学委员会规定，将酶分为六大类：1. 氧化还原酶类 催化底物的氧化还原反应，如脱氢酶、氧化酶等。2. 转移酶类 催化底物之间基团的转移反应，如氨基转移酶、激酶、甲基转移酶、羧基转移酶等。3. 水解酶类 催化底物的水解反应，如蛋白酶、肽酶、脂肪酶、淀粉酶等。4. 裂合酶类 催化底物裂解或缩合反应，如脱水酶、脱氨酶、脱羧酶、醛缩酶等。5. 异构酶类 催化同分异构体的底物之间相互转换，如磷酸甘油酸变位酶、磷酸己糖异构酶。6. 合成酶类 也称连接酶类，催化两种或两种以上化合物合成一种化合物的反应。反应

11、需吸收能量，通常与ATP的分解相偶连，ATP分解产生能量用于合成反应。（三）酶的系统编号：根据上述酶的系统分类方法，国际酶学委员会还对每个酶做了统一编号，一个酶只有一个编号，因此不会混淆。酶的系统编号由“EC”加四个阿拉伯数字组成，每个数字之间以“.”隔开。“EC”是国际酶学委员会的缩写，这四个数字的含义分别是：第一个数字代表大类，第二个数字代表亚类，第三个数字是亚亚类，第四个数字是酶在亚亚类中的序号。如：EC1.1.1.27（乳酸：NAD+氧化还原酶）。第二节 酶的结构与功能的关系一、 酶的活性中心与必需基团（一）酶的活性中心酶是生物大分子，相对分子质量很大，而与酶反应的底物一般是相对分子质

12、量较小的分子，有时即使是大分子底物时，反应也是逐步进行的，酶仅与大分子底物中的一小部分作用。与底物接触并且发生反应的部位就称为酶的活性中心(active center)。酶的活性中心往往是若干个在一级结构上相距很远，但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，对于结合酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。酶的活力中心通常包括两部分：与底物结合的部位称为结合中心，结合中心决定酶的专一性；促进底物发生化学变化的部位称为催化中心，它决定酶所催化反应的性质以及催化的效率。有些酶的结合中心与催化中心是同一部分。 酶活性中心示意图（二

13、）酶的必需基团(essential group)酶的分子中存在着许多功能基团，例如，-NH2、-COOH、-SH、-OH等，但并不是这些基团都与酶活性有关。一般将与酶活性有关的基团称为酶的必需基团。必需基团可分为四种：1. 接触残基（ contact residue）：直接与底物接触的基团，它们参与底物的化学转变，是活性中心的主要必需基团。这些基团中有的与底物结合称为结合基团(binding group)，有的催化底物发生化学变化称为催化基团(catalytic group)。活性中心中有的必需基团可同时具有这两方面的功能。还有些必需基团虽然不参加酶的活性中心的组成，但为维持酶活性中心应有的空

14、间构象所必需，这些基团是酶的活性中心以外的必需基团。2. 辅助残基(auxiliary residue):这种残基既不直接与底物结合，也不催化底物的化学反应，但对接触残基的功能有促进作用。它可促进结合基团对底物的结合，促进催化基团对底物的催化反应。它也是活性中心不可缺少的组成部分。3. 结构残基（structure residue）：这是活性中心以外的必需基团，它们与酶的活性不发生直接关系，但它们可稳定酶的分子构象，特别是稳定酶活性中心的构象，因而对酶的活性也是不可缺少的基团，只是起间接作用而已。4. 非贡献残基（noncontribution residue）：酶分子中除上述基团外的其它基团

15、，它们对酶的活性“没有贡献”，也称为非必需基团。这些基团对酶活性的发挥不起作用，它们可以被其他氨基酸残基取代，甚至可以去掉都不会影响酶的催化活力。但这些基团并不是真正意义上的“非必需”基团，它们可能在系统发育的物种专一性方面、免疫方面或者在体内的运输转移、分泌、防止蛋白酶降解的方面起一定作用。如果没有这些基团，酶的寿命、酶在细胞中的分布等方面受到限制。这些基团的存在也可能是该酶迄今未发现的新的活力类型的活力中心。（三）.酶活性中心证明方法1.切除法对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活性有关。2.化学修饰法选

16、用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结合、氧化或还原等修饰，称之为化学修饰。酶分子中可以修饰的基团有：-SH、-OH、咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十多种，但专一性的修饰剂不多。判断方法：某一基团被修饰后，酶的活性显著下降或无活性，可初步判断该基团与酶的活性有关；反之，与酶的活性无关。缺点： 也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的正常空间结构，而导致酶活性的丧失。为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂对酶作用，若不能被修饰，说明该基团确实处于活性部位；反之，底物存在下，该基团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团

17、不是活性部位的基团，而是结构基团。根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分为：（1）、非特异性共价共接修饰：修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非活性部位不存在或极少存在。判断标准是一：酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；二：底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。（2）、特异性的共价修饰：修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶失活。如：DIFP（二异丙基氟磷酸）可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸OH而使酶失活。DIFP一般不与蛋白

18、质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应，只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。3.亲和标记法：根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为：N对甲苯磺酰L苯丙氨酰乙酯或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）。4.X射线衍射法：把一纯酶的X射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。(四)酶的活性中心的一级结构应用化学修饰法对多种酶的活性中

19、心进行研究发现，在酶的活性中心处存在频率最高的氨基酸残基是：丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸和半胱氨酸。如果用同位素标记酶的活性中心后，将酶水解，分离带标记水解片段，对其进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一级结构。对各种蛋白水解酶进行类似的分析，功能类似的酶在一级结构上有惊人的相似性。见下表所示：酶氨基酸顺序胰蛋白酶（牛）胰凝乳蛋白酶（牛）弹性蛋白酶（猪）凝血酶（牛）蛋白酶（S.griseus）天冬.丝,半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.缬-丝.丝.半胱.甲硫.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮-丝.甘.半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮-天冬.丙.半胱.谷.甘.天冬.丝

20、.甘.甘.脯.苯丙-苏.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.甲硫从上表可知，一些丝氨酸蛋白酶在活性丝氨酸附近的氨基酸几乎完全一样，而且这个活性丝氨酸最邻近的5-6氨基酸顺序，从微生物到哺乳动物都一样，说明蛋白质活性中心在种系进化上有严格的保守性。二、酶的活性与高级结构的关系 酶的活性不仅与一级结构有关，而且与其高级结构密切相关。就某种程度而言，在酶的活性表现上，高级结构甚至比一级结构更为重要。高级结构是形成酶特定空间结构的保证，高级结构破坏，酶失去活性。三、酶原激活有些酶在细胞内合成时，或初分泌时，没有催化活性，这种无活性状态的酶的前体称为酶原(zymogen)。酶原向活性的酶转化的过程称为酶

21、原的激活。酶原激活实际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形式存在，在一定条件下才转化成相应的酶。某些酶原的激活过程酶原激活条件活化的酶水解掉的肽段胃蛋白酶原胃蛋白酶六肽胰蛋白酶原胰蛋白酶六 肽糜蛋白酶原A-糜蛋白酶两个二肽羧肽酶原A羧肽酶A几个碎片弹性蛋白酶原弹性蛋白酶几个碎片例如，胰蛋白酶原进入小肠后，受肠激酶或胰蛋白酶本身的激活，第6位赖氨酸与第7位异亮氨酸残基之间的肽键被切断，水解掉一个六肽，酶分子空间构象发生改变，产生酶的活性中心，于是胰蛋白酶原变成了有活性的胰蛋白酶。除消化道的蛋白酶外，血液中有关凝血和

22、纤维蛋白溶解的酶类，也都以酶原的形式存在。 胰蛋白酶原激活示意图糜蛋白酶原的激活过程 胃蛋白酶原的激活过程 胃蛋白酶原的激活过程酶原激活的生理意义在于避免细胞内产生的蛋白酶对细胞进行自身消化，并可使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢的正常进行。第三节 酶催化机理酶的催化机理是解释酶催化特性的理论，如：酶为什么能催化化学反应、酶是如何催化化学反应的、酶为什么有专一性、酶为什么有高效性等。一、酶为什么能催化化学反应 一个化学反应要能够发生，关键的是反应体系中的分子必须具备一定能量即分子处于活化状态，活化分子比一般分子多含的能量就称为活化能。反应体系中活化分子越多，反应就越快。因此，设法增

23、加活化分子数量，是加快化学反应的唯一途径。增加反应体系的活化分子数有两条途径:一是向反应体系中加入能量，如通过加热、加压、光照等，另一途径是降低反应活化能。酶的作用就在于降低化学反应活化能，下图1所示图1 非催化过程和催化过程自由能的变化二、酶如何降低化学反应的活化能 中间产物学说中间产物学说认为：酶在催化化学反应时，酶与底物首先形成不稳定的中间物，然后分解酶与产物。即酶将原来活化能很高的反应分成两个活化能较低的反应来进行，因而加快了反应速度。S + E ES P + E 底物 酶 中间产物 产物 中间产物学说已经得到一些可靠的实验依据。如，用吸光法证明了含铁卟啉的过氧化物酶参加反应时，单纯的

24、酶的吸收光谱与加入了第一个底物H2O2后确实产生了变化。三、酶的高效性的解释1、底物与酶的邻近效应和定向效应2、底物分子的形变和扭曲3、共价催化4、酸碱催化5、活性部位的微环境的影响四、 酶的专一性的解释（一）锁与钥匙学说：如图所示锁与钥匙学说示意图 （二）诱导契合理论 如下图所示（三）结构性质互补假说 该学说认为酶同底物结合的专一性，与底物结构和酶的活性中心的空间结构相关，二者的结构是互补的。如果底物是解离的，则酶的活性中心的空间结构必然带相反的电荷才能很好结合。而且底物同酶活性中心的极性也必然相同。第四节 酶促反应动力学酶促反应动力学(kinetics of enzyme-catalyze

25、d reactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。一、 底物浓度对反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响是在酶的浓度一定的条件下测定的，底物浓度对反应速度影响呈现矩形双曲线(rectangular hyperbola)。底物浓度对反应初速度的影响在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，表现为一级反应。随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已

26、被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。(一)米氏方程 Vmax指该酶促反应的最大速度，S为底物浓度，Km是米氏常数，VO是在某一底物浓度时相应的反应速度。当底物浓度很低时，SKm,则VVmaxS/Km，反应速度与底物浓度呈正比。当底物浓度很高时，SKm，此时VVmax，反应速度达最大速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。(二)米氏常数的意义1.物理意义：Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。 2. Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。3.Km值是

27、酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-110-6M之间。(三)Km在实际应用中的重要意义1.鉴定酶：通过测定可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。2.判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个底物，就有几个Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解（Km=28mol/L），也可催化棉子糖水解（Km=350mol/L）,两者相比，蔗糖为该酶的天

28、然底物。3.计算一定速度下的底物浓度：如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99%，则S=99 Km4.了解酶的底物在体内具有的浓度水平：一般地，体内酶的天然底物的S体内Km，如果S体内Km，那么VOVmax,细胞中的酶处于“浪费“状态，反之，S体内Km，那么VOVmax，底物浓度失去生理意义，也不符合实际状态。5.判断反应方向或趋势：催化正逆反应的酶，其正逆两向的反应的Km不同，如果正逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。(四)Km求法：双倒数作图(double reciprocal plot or Lineweaver Burk plot) 将米氏方程两边取倒数，

29、可转化为下列形式：1VO=KmVmax1S+1Vmax从下图可知，1/V0对1/S的作图得一直线，其斜率是Km/ Vmax,，在纵轴上的截距为1/Vmax,横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值。 双倒数作图法二、酶浓度的影响在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大大超过酶浓度时，速度与酶的浓度呈正比。酶浓度对速度的影响机理：酶浓度增加，ES也增加，而V0=k3ES，故反应速度增加。三、温度对酶促反应速度的影响酶促反应与其它化学反应一样，随温度的增加，反应速度加快。化学反应中温度每增加10反应速度增加的倍数称为温度系数Q10。一般的化学反

30、应的Q10为2-3，而酶促反应的Q10为1-2。在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度（optimum temperature Tm）,.一般动物组织中的酶其最适温度为35-40，植物与微生物中的酶其最适温度为30-60，少数酶可达60以上，如细菌淀粉水解酶的最适温度90以上。温度对酶促反应速度的影响机理：1.温度影响反应体系中的活化分子数：温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。2.温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。 最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的，它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。四、pH对酶促反应速度的影响大多数酶的活性受pH影响显著，在某一pH下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。酶表现最大活力的pH称为酶的最适pH(optimumpH pHm)。典型的酶速度pH曲线是较窄的钟罩型曲线，但有的酶的速度pH曲线并非一定呈钟罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度pH曲线。胃蛋白酶的速度-温度曲线如下图。 胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲线 pH对酶促反应速度的影响机理：1.pH影响酶和底物的解离:酶的活性基团的解离受pH影响