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1、博视康LUNA研究补充叶黄素和玉米黄质后黄斑色素密度和血清类胡萝卜素浓度的改变译文1995 2 临床研究文献11 LUNA研究：补充叶黄素和玉米黄质后黄斑色素密度和血清类胡萝卜素浓度的改变Meike Trieschmann a,*, Stephen Beatty b, John M. Nolan b, Hans Werner Hense c,Britta Heimes a, Ulrike Austermann a, Manfred Fobker d, Daniel Pauleikhoff aReceived 6 October 2006; accepted in revised form 11

2、 December 2006Available online 19 December 2006LUNA研究：补充叶黄素和玉米黄质后黄斑色素密度和血清类胡萝卜素浓度的改变Meike Trieschmann a,*, Stephen Beatty b, John M. Nolan b, Hans Werner Hense c,Britta Heimes a, Ulrike Austermann a, Manfred Fobker d, Daniel Pauleikhoff aReceived 6 October 2006; accepted in revised form 11 December

3、2006Available online 19 December 2006【摘要】 黄斑色素由叶黄素(L)和玉米黄质(Z)构成，有保护视网膜免受光氧化损伤的作用。本研究主要通过观测黄斑色素光学密度（MPOD）和血清类胡萝卜素成分浓度改变，来显示机体对补充L，Z和抗氧化剂的反应性。干预组有108位观查对象（平均年龄SD：71.57.1），其中92.6%有AMD的特征性表现。他们每日补充12mg L，1mg Z, 全部以酯的形式，120mg维生素C,17.6mg维生素E，10mg锌和40g硒（博视康TM），持续六个月。在补充阶段的5次随访，和补充完成3个月后分别用双波长自发荧光（AF）测量MPOD

4、值。对照组有28位观察对象（平均年龄SD：71.08.1），未给予饮食的补充和调节，分别在基线和平均29.4（9.3）周后进行两次检查。在基线时，平均MPOD值SD（0.5）在干预组和对照组分别为0.504（0.197）和0.525（0.189）。在补充阶段，干预组观测到有统计学意义的MPOD值的上升（0.10.009；p0.05）。为了根据MPOD的反应性对补充对象进行四分法分组，我们计算了第六次随访和基线间MPOD值的差值。组I(非应答组)未表现出MPOD值(0.5处)的增加，尽管可以观测到血清L和Z浓度的增加。其它三个“应答组”最终的MPOD值相仿，组、组、组的最终平均MPOD值（SEM

5、）分别为0.59（0.04）光学密度单位（ODU），0.64（0.03）ODU，0.64（0.03）ODU。基线MPOD水平较低的观察对象与中等或者高基线MPOD水平的对象相比较对补充试验的反应更容易呈现为明显的MPOD值的上升，或无MPOD的上升。补充12mg L和1mg Z，联合抗氧化剂，使大多数研究对象的MPOD值增加，包括那些患有AMD的对象。但是，仍然有很大比例的对象，虽然有血清L和Z浓度的增加，但在整个研究阶段却未观测到MPOD的扩增。这提示这些类胡萝卜素的肠内吸收障碍并不是黄斑无应答的原因。另外，我们的结果提示饱和机制在视网膜摄取和维持黄斑类胡萝卜素中起重要作用。【关键词】 年龄

6、相关性黄斑变性；叶黄素；黄斑色素；博视康TM；玉米黄质 1.引言：老年性黄斑变性（AMD）是发达国家的首要致盲原因。氧化应激，即指活性氧中间产物造成的组织损伤，和短波长光（蓝光）造成的视网膜损伤，被认为是AMD重要致病原因。黄斑色素由三种类胡萝卜素，叶黄素（L），玉米黄质(Z)，内消旋玉米黄质(meso-Z)，在黄斑区聚集而成。在人类，由于叶黄素和玉米黄质无法在体内合成，而完全来源于饮食的摄取。内消旋玉米黄质主要来源于视网膜的叶黄素。由于黄斑色素对短波长光的滤过作用和抗氧化的特性，一般认为黄斑色素具有防止AMD发展的保护作用。一些研究已经证明，血清叶黄素(和玉米黄质)浓度与黄斑色素光学密度(M

7、POD)及饮食的摄入成正相关。另外，一些非饮食因素，包括：年龄，性别，虹膜颜色，种族，体脂含量，紫外光线的暴露情况，吸烟，饮酒和遗传背景等，对血清叶黄素（和玉米黄质）浓度和黄斑色素光学密度也有影响。然而无论怎样，由于饮食摄取是体内叶黄素和玉米黄质的唯一来源，这也就提示它的饮食摄入量是决定其血清浓度和黄斑色素光学密度最重要因素。而这一观点与大多数具代表性的补充试验相符。LUNA研究（自发荧光AF测定叶黄素疗效）是观测补充黄斑类胡萝卜素和抗氧化剂后MPOD的改变，和血清中叶黄素和玉米黄质的浓度的改变。2.材料与方法：2.1研究对象我们选取136个对象进入LUNA研究。所有曾经补充过叶黄素，玉米黄质

8、和抗氧化剂的皆不纳入本研究。本研究以最优的临床实践为指导，通过了当地医学伦理委员会的批准，遵循赫尔辛基宣言的原则。每个对象入组前均获得其知情同意。研究对象的纳入标准：1、年龄50岁或以上。2、无或轻微的晶体混浊，故可清楚的观测到视网膜情况。3、无叶黄素和/或玉米黄质补充史，或抗氧化剂的补充史（避免结果混淆）。4、一般健康状态好。有视网膜中央萎缩斑和中央视网膜色素上皮增生或脉络膜新生血管的不纳入本实验，因为这些会影响自发荧光的形态和测量。在试验初期，每个对象只选取单眼作为研究对象：选择自发荧光较强的为观测眼；若双眼的自发荧光强度相似，则选择视力较好的眼为观测眼；若双眼的自发荧光强度和视力皆相仿，

9、则选择右眼为观测眼。在这136位自愿者中，其中108位进入干预组（I），其余28进入对照组（C）。干预组的平均年龄（SD）为71.5(7.1),年龄范围为51-87岁，男女性别比例为40：68（62.6-37.4%）。干预组的所有对象给予相同的补充制剂，成分包含12mg叶黄素1mg 玉米黄质，皆为酯质形式，120mg维生素C，17.6mg维生素E，10mg锌，40g硒。该补充制剂商品制品为博视康TM,由柏林博士伦公司生产。所有药品的制作工序都遵循高制药标准和GMP,初成品和最终制品的分析采用已确认的标准程序，叶黄素和玉米黄质的含量采用紫外光/可见光光谱分析法测定。其稳定性的测定也遵循ICH的要

10、求。另外，该药品的制作遵循严格的质量控制体系。108位干预组对象中有100位有AMD的特征性表现，包括存在显著的玻璃膜疣（60%），非中央视网膜色素上皮的增生（33%）和萎缩性改变（7%）。另外的8位研究对象黄斑处表现正常。对照组有28位研究对象，年龄范围为57-83岁(平均年龄SD：718.1)，男女性别比例为16：12(57%：43%）。其中有25位存在特征性的AMD改变，包括软性玻璃膜疣（62%），非中心视网膜色素上皮增生（32%）和萎缩性改变（6%）。其余的3位入选者表现为正常的黄斑。眼底检查均采用标准眼底成像技术，眼底图像的分级由同一位观测者在隐瞒入选对象临床细节的情况下进行。本研究

11、为非随机的，公开标记的，控制性试验，对照组的对象并未使用安慰剂。干预组的研究对象进行6次检查，分别为基线，6周，12周，18周，24周（此时停止给予补充剂），27周（停止给药后3周）；而对照组只进行两次检查，分别在基线和10-50周（平均SD：29.49.3）。由于没有完成最终的随访检查，干预组中的11位对象和对照组中的2位对象被排除在最终的分析中。干预组研究对象的依从性通过要求研究对象将服用完的空药瓶带回的方式来监测。2.2 血清类胡萝卜素的测定所有干预组的对象分别测定基线，和补充阶段结束时的血清叶黄素和玉米黄质的含量。取血液样本7.5ml，1500*g离心15分钟，分离血清并分装于两个琥珀

12、色小管，在-70下保存。血清类胡萝卜素含量测定采用的方法曾在其他文献上报道（Dachtler et al 2001）。取300L血清于一琥珀色微离心管中，再加入20L内参（9g/ml-apo-8类胡萝卜醛的乙醇溶液），2ml己烷-异丙醇3：2（v/v）混合液和1ml 0.85%NaCl。涡旋1分钟后800*g离心2分钟。移去上层液，加入2ml己烷，重复上述提取步骤。将两次提取上层液混合，在30氮气流中蒸发干燥，然后用200L乙醇溶解。将上述200L乙醇溶液注入116液体色谱仪（Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany），使用168型二极管阵列探测器分界。样品

13、采用等强度洗脱（流动相：丙酮/水 86：14 v/v），流速为1ml/min。该色谱仪的运行在450nm吸光率处监测。我们使用ProntoSIL 120-3-C30倒相柱（3m颗粒直径，250cm长度*4.6（i.d）, Bischoff Analysentechnik GmbH, Leonberg, Germany）,在室温条件下进行。该分析法通过美国国家标准和技术学会提供的标准参考原料968c（人类血清脂溶性维生素，类胡萝卜素，胆固醇）验证正确。同时，通过间隔12个月重复分析（n=55）正常人和病人样品来确定批间变异率（CoVs）(圆括号内表述的为平均浓度)：正常人和患者的叶黄素CoVs分

14、别为8.2%（0.1g/ml）和6.5%（0.6g/ml）。而对于玉米黄质则分别为9.8%（0.01g/ml）和 6.7%(0.06g/ml)。标准叶黄素和玉米黄质由Carl Roth GmbH &Co. KG公司提供，-apo-8- 胡萝卜素醛向Fluka公司购买。所有溶剂符合高效液相色谱法（HPLC）等级，由Merck KGaA公司提供。峰面积被用于定量分析。2.3其他生物化学分析干预组对象在入组和出组时分别测定血清总胆固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白（LDL）,高密度脂蛋白（HDL）和锌浓度。总胆固醇和甘油三酯采用标准酶素法（CHOD-PAP和GPO-PAP，Roche Diagnostic

15、s，曼海姆, 德国），HDL采用直接酶素法（PEG修饰酶，Roche Diagnostics），LDL采用Friedewald公式计算。所有测量在 747 型 Boehringer Mannheim/Hitach自动分析仪上进行。血清锌浓度测定是使用PerkineElmer 2380 原子吸收分光光度计来测定火焰原子吸收率。该方法通过分析由德国国家INSTAND 测试体系和美国疾病控制和预防中心的国际质量保证体系提供标准血清验证正确。2.4黄斑色素测定使用改良的海德堡视网膜血管造影仪（海德堡工程公司）测定眼底自发荧光。AF是利用存在于视网膜色素上皮（RPE）的脂褐质的荧光性。脂褐质（LF）吸收

16、400nm到580nm的短波长辐射波，释放500nm到800nm的荧光，其峰值在620nm。由于MP吸收波长短与550nm的蓝光，其吸收峰在460nm，而且MP的光吸收量和视网膜的色素含量有关，故可以用来测定MPOD。目前的AF的测定法使用MP吸收的两个不同的激发波长。这种双波长的方法可以用来计算RPE上非均匀分布的脂褐质的量。该方法在其他文献上有更为详细的描述，而且已经在其他的临床研究中使用。在这个研究中，MPOD的测定由主要研究者采用同一台测试设备和标准化方法进行。所使用的散瞳药包含0.5%托比卡胺和2.5%苯肾上腺素。测试者瞳孔直径散大至6mm被认为是安全的。由于测试设备的亮光造成的漂白

17、效应会妨碍测试眼的注视，故要求研究对象使用对侧眼注视。当患者的对侧眼视力过低不能注视时，则要求其直视前方，并尽量减少眼球的运动。使改良的海德堡视网膜血管造影仪和受试眼对齐后，首先使用红外光（IR），然后使用488nm的激发波长光。使用视网膜漂白效应使视紫质吸收入射光引起的荧光效应减少到最小。在获得第一幅图像前，先在488nm波长光下暴露至少20s。漂白范围为20*20，瞳孔区的平均激光强度为240W。此后，分别在两激发波长处获得两段影像。第一段影像在488nm波长处获得包含16幅图像，而第二段包含16幅影像从514nm波长处获得。系统软件按照解剖学细节如视网膜血管将两段影像中的图片线形排列。使

18、用图像分析技术在此基础上获得两个波长处的平均图像。该系统软件采用2-波长技术获得光学密度分布，是专门用于分析488nm和514nm激发光的自发荧光图像。先将488nm和514nm激发光的平均影像相互比较，而各个区域（F）的相应密度计算如下：DF(460)= 1 log IF(488)K(488)-K(514) IF(514)其中DF(460)代表F点在460nm的光学密度，IF(488)和IF(514)分别表示488nm和514nm视网膜均一激发光的强度。激发系数，K(488)=0.781，K(514)=0.255，用于校正黄斑色素密度使其就像是使用单一波长的波峰来测量，从而使1/ K(488

19、)-K(514)值为1.90。但是，Stockman et al. (2000)所使用的常数是用来校正双波长自发荧光技术中所使用的波长，我们应该知道使用514nm而不是540nm或更长的波长，限制了黄斑色素密度的低限，使其结果更可靠。因为1.9这个系数同时纠正了每张图像的干扰误差。黄斑中心凹由软件定义为与相对密度图对应的正态分布曲线的中央。当分布不对称时需要人为的干预。在这种情况下，解剖学的标志如血管在此后的测量中可用于定义中心。然后软件可计算同心圆(1个像素的宽度)处的平均相对密度，在0到153像素的偏心度(约6视角)产生DF(460)辐射状分布图。当偏心度大于4时图像基本上趋于稳定，偏心度

20、6处被选为参考值P(定义为无MP的补偿量)。在此研究中，我们将在视网膜偏心度为0.5，宽度为1像素的同心圆区域的平均值作为平均MP密度。我们避免像先前许多研究一样使用峰密度（中心凹处），是因为采用1个像素作为量度存在可变性。2.5重复性，重复测量和检查者间的可变性双波长自发荧光法的重复性和检查者间/时期间的可变性已经在其他文献上报道。简单说，重复性可以用可靠率来体现，我们在一特定时间对20个对象进行5次重复测量，计算出该方法的可靠率为0.94。重复测试的可变性和检查者间的可变性也在24个对像中进行了评估。检查者间的平均误差（SD）（测量值1由检查者1执行减去测量值2由检查者2执行）为0.002

21、（0.042）ODU。2.6统计分析使用SAS软件（版本8.2）进行统计学分析。描述性比较对连续性变量进行标准t检验，对分类变量进行卡方检验。Pearson相关系数分析被用于评估MPOD(0.5偏光度)和潜在决定因素间的相关性。偏态分布因素，如叶黄素，玉米黄质，和甘油三酯，先进行对数转化以获得更为常态的分布值。干预组和对照组中基线和随访测定的差异性采用配对t检验，而组间比较则采用非配对的统计学方法。混淆因子和多重危险因素的影响采用线形回归分析。P值小于0.05认为有统计学意义。3结果3.1 基线结果干预组的基线特点在表1中表述。干预组和对照组的年龄 平均年龄(SD):干预组=71.5（7.1）

22、；对照组=71.0（9.1），p值为0.77 和性别(男女比例：干预组=40：6837:63%；对照组=12：1643:57%；p=0.77)组成相仿。偏心度0.5处平均MPOD值（SD)：干预组为0.504（0.197)ODU；对照组为0.525（0.189)ODU，（p=0.6）。表1：补充对象的基线特征（干预组）Intervention groupn= 108 (mean + SD)Age (years) 71.5 + 7.1Male:female (%) 37.4:62.6Body mass index (kg/m2) 26.3 + 4.0Total cholesterol (mg/d

23、l) 206 + 38.5HDL cholesterol (mg/dl) 58.7 + 17.9Non-HDL cholesterol (mg/dl) 147.3 + 38.4Triglycerides (mg/dl) (non-fasting) 152.5 + 87.2图1：平均基线MPOD值与年龄相关性（补充和非补充对象）MPOD0.5：偏心度0.5处黄斑色素光学密度。I组为干预组(补充)（第一次随访为基线，n=108），C组为对照组（n=28）Serum lutein (mg/ml) 0.158 + 0.143Serum zeaxanthin (mg/ml) 0.018 + 0.013M

24、POD at 0.5 0.504 + 0.197MPOD,黄斑色素光学密度；HDL，高密度脂蛋白干预组108个对象中，5人（4.7%）目前吸烟，63（58.9%）有高血压病史，11（10.3%）有糖尿病史，20（18.7%）有冠心病史，3（2.8%）有中风史。另外，有33人（30.8%）目前正在服用降脂药。干预组中，偏心度0.5处女性的平均MPOD值(SEM)为0.52(0.03)ODU，高于男性的0.48(0.02)ODU，但是这种区别无统计学意义。同样的，目前吸烟的和无吸烟史之间也无统计学意义：偏心度0.5处平均MPOD值（SEM）：目前吸烟的为0.55（0.10）；无吸烟史的为0.50（

25、0.02）；p=0.64。在基线水平，MPOD水平和年龄无相关性（图1）：高龄组（年龄大于70岁）的MPOD水平高于低龄组（年龄在51到69岁间）偏心度0.5处平均MPOD值（SEM）：高龄组为0.48（0.02），低龄组为0.54（0.03）。但是这种区别无统计学意义。这里我们发现在基线水平血清L和Z的浓度与MPOD水平正相关，且有统计学意义。（血清L：r=0.21，p=0.03；血清Z：r=0.21，p=0.03）。同时发现基线时，血清甘油三酯的含量和MPOD值呈负相关，且有统计学意义（r=-0.3,p=0.001）。血清HDL与MPOD呈正相关，且接近有统计学意义（r=0.18，p=0.

26、06）（表2）。表2：干预组中潜在危险因素和基线MPOD值关系Correlation coefficient p-ValueAge (years) -0.05 0.58Body mass index (kg/m2) -0.08 0.40Total cholesterol (mg/dl) -0.08 0.44HDL cholesterol (mg/dl) 0.18 0.06Triglycerides (mg/dl) log transformed -0.30 0.001*Lutein (mg/ml) 0.21 0.03*Lutein (mg/ml) log transformed 0.23 0.

27、017*Zeaxanthin (mg/ml) 0.21 0.03*Zeaxanthin (mg/ml) Log transformed 0.18 0.07*p 0.01, *p 0.05. MPOD, 黄斑色素光学密度3.2 对补充L,Z 和抗氧化剂的反映3.2.1. MPOD在最后一次随访中，干预组和对照组分别有97（89.8%）和26（92.9%）人参加。干预组中，偏心度0.5处平均MPOD值在最初的第二次随访时有衰减，但这种差异无统计学意义（p=0.74）。此后直至第六次随访（停止补充后三个月）皆处于持续上升的状态。基线与第六次随访间平均MPOD差值在干预组和对照组分别为0.1（0.00

28、9）和0.03（0.02），而只有干预组的这种上升是有统计学意义的（p0.01）.图2表示了每次随访时所有观察对象的平均值。正如在文章开头提到的，干预组只有97人最终完成了六次随访，故第六次随访和第一次之间的差别只计算该97位观察对象。对比干预组和对照组，偏心度0.5处MPOD值的上升有明显的统计学意义（p0.0008）。3.2.2.根据MPOD的反应情况我们将参与补充的对象分为四组，我们计算了第六次随访（随访中的最高值）和基线水平（第一次随访）间的差值（图3）。排除没有完全完成全部随访的观察对象，干预组中有92人进入该分析。视网膜反应最低的一组（组1）中，偏心度0.5处平均MPOD值在基线水

29、平为0.49（0.049），在第六次随访时为0.47（0.051），未表现出有意义的上升（p=0.98）。而在其他三组，表现出明显的MPOD值的增加，尽管它们的基线水平存在差异。这三个反应组最终MPOD值相似，组、组、组的最终平均值（SEM）分别为0.59（0.04）ODU，0.64（0.03）ODU和0.64（0.03）。如果用基线水平的百分数来表示的话，组（无反应组）的最终值比基线水平低3.1%，而组、组、组分别上升11.9%，23%，50.5%。值得注意的是，虽然是根据MPOD对补充试验的反应分组，但各组之间以下指标的差异没有统计学意义：年龄：p=0.34；基线血清L水平：p=0.67；

30、基线血清Z水平：p=0.81；BMI：p=0.59；性别比例：p=0.32；吸烟情况：p=0.37。然而，低反应或无反应组的基线HDL水平明显高于其他组：基线HDL水平(SEM)组I=66.6（3.3）mg/dl；组=61.6(2.9)mg/dl、组=53.9(3.1)mg/dl、组=53.7(3.0)mg/dl；p=0.013。而MPOD反应更高的组中使用抗胆固醇药物的对象比例更高（在组为45.8%），但这种关系并未达到统计学意义（p=0.13）。3.2.3.血清L(和Z)改变和MPOD改变的关系补充后，比较基线和第五次随访时平均血清L(和Z)水平（SEM）有明显的上升平均血清L水平（SEM

31、）：基线=0.16（0.015）g/ml,第五次随访=0.593（0.042）g/ml , p0.001；平均血清Z水平（SEM）：基线=0.018（0.001）g/ml,第五次随访=0.022（0.001）,p=0.007。有趣的是，尽管组I 0.5偏心度的MPOD水平没有增加，但其血清L和Z水平却有明显的升高，且和其他三个反应组相似。（表3图3：偏心度0.5处MPOD值：根据黄斑对补充L,Z和抗氧化剂反应四分组。MPOD0.5：偏心度0.5处黄斑色素光学密度。ODU：光学密度单位。0 周：随访1=基线；6 周：随访2；12 周：随访3；18 周：随访4；24 周：随访5；随访6，结束补充后3个月。n=92(完成全部随访的对象)。计算各组第六次随访（随访阶段的最高值）和基线（随访1）间MPOD值的差值。 Quart I，组I（n=20）；Quart，组I（n=27）；Quart，组I（n=21）