酵母双杂交试验步骤.docx

1、酵母双杂交试验步骤LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3,可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。质粒pLexA的筛选标志为HIS3,在双杂交系统中用于表达DNA-BD（202个氨基酸残基组成的LexA蛋白）与目标蛋白（钓饵，Bait）的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexAX8结合。质粒pB42AD的筛选标志为T

2、RP1，在其供外源基因插入的多克隆位点（EcoRI与XhoI）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）、HA（血凝素）及AD（来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白）等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu,它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA,但两者启动子不同。根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含

3、有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。二、商品化酵母双杂交系统的组成1.载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3.大肠杆菌菌株：E.coliKC8株4.对照质粒：质粒用途pLexA-53,pB42AD-T阳性对照

4、pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白阳性对照pLexA-Lam（LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用）假阳性检测质粒5.引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。三、酵母双杂交实验的基本流程1.将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。2.同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。3.构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X,作为钓饵（bait）。4.将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48（p8op-LacZ）细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此D

5、NA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。转化质粒选择培养基克隆生长情况说明（含有Gal/Raf）pLexA-PosSD/-His,-Ura蓝阳性对照pLexASD/-His,-Ura白阴性对照PlexA-XSD/-His,-Ura白没有直接激活活性PlexA-XSD/-His,-Ura蓝具有直接激活活性PlexA-XSD/-His,-Ura菌落不能生长酵母细胞毒性4-1.如果pLexA-X-半乳糖昔酶的信号作用。P能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少4-2.如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，

6、但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。5.如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。转化质粒SD固体培养基LacZ表型对口11pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura蓝对口22pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu蓝+pB42AD-T实验pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待测+pB42AD-文库5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。

7、-半乳糖甘酶无表达。fe-2.上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu,观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但5-3.同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。5-4.将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。6.阳性克隆的筛选6-1.随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转

8、化E.coliKC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。6-2.如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。7.用质粒自然分选法（NaturalSegregation筛除只含有AD-文库杂合子的克隆7-1.将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10%-20%左右的频率随机丢失。C孵育2-3天。-2.将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura,307-3.再挑取生长

9、的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。7-4,将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura,以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。8.酵母杂合试验(YeastMating)1定真阳性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA,通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。质粒1(inYM4271)质粒2(inEGY48)La

10、cZ表型Leu表型pLexApB42AD白不能生长pLexA-靶DNApB42AD白不能生长pLexApB42AD-文库白不能生长pLexA-靶DNApB42AD-文库蓝真阳性pLexA-LampB42AD-文库白不能生长9,阳性克隆的进一步筛选和确证9-1,扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA,也含有3种转化的质粒DNA。9-2,将上述DNA电转化E.coliKC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质

11、粒DNA,酶切鉴定。9-3,用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。9-4,扩增与靶DNA相互作用的文库DNA,进行序列分析及进一步的结构、功能研究。10.对双杂交系统阳性结果的进一步研究10-1,用不同的双杂交系统验证10-1-1,将载体pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。10-1-2,选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。10-1-3,将文库质

12、粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。-半乳糖甘酶水平，比较作用强度变化。P10-1-4,去除或突变特定结合位点，定量检测10-2,用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。10-3,用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。10-4,进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系构建于AD载体的cDNA文库的扩增1.自-80C冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻。2,用新鲜的LB培养液在1,5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释。1H加入90%取稀释菌液各1090mm);37c倒置培养

13、过夜或30c培养24-36hr,计数平板上单克隆菌落数。4LB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板(4,确定待扩增的cDNA文库?度(cfu/ml)=克隆数X108(1:10崎释)或克隆数X1010(1:108释)。5,按照150mm),共100块；37c倒置培养过夜。圾-4X104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp平板(6,在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000mlLB/Amp培养液中，37c振荡培养2-4hr。7,留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-80C。8.其余培养菌液离心8000xgx10m

14、in4c收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。LB液体培养基，121C,15lb/in2灭菌15minA,bacto-Tryptone10.0gB,bacto-YeastExtract5,0gC,NaCl10.0gD,ddH2O-1000ml1LB固体培养平板为含有1.5%琼脂(Agar)LB培养基。2*LB/Amp培养基为含有Ampg/ml的LB培养基。N50-100构建于AD载体的cDNA文库的纯化1,质粒DNA提取缓冲液名称缓冲液配方g/mlRNaseMP1悬浮缓冲液50mMTris-HCl(pH8,0);10mMEDTA;100AP2裂解缓冲液200mMNaOH;1%SD

15、SP3中和缓冲液3,0MKac(pH5.5)QBT平衡缓冲液750mMNaCl;50mMMOPS(pH7.0);15%异丙醇；0.15%TritonX-100QC洗涤缓冲液1,0MNaCl;50mMMOPS(pH7,0);15%异丙醇QF洗脱缓冲液1.25MNaCl;50mMTris-HCl(pH8.5);15%异丙醇2,培养菌液离心6000xgx10min4,C,每500ml培养物(下同)的沉淀重悬于50mlP1缓冲液。3,加入50mlP2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵育5min。4,加入4c预冷的50mlP3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min(其间再倒置混匀4-6次)。5,将上

16、述混合液再倒置混匀，离心12000xgx30min4；C,保留上清。6,上清再离心12000xgX15min4,C,留上清。7.将上清液上样于经35mlQBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱。8.以100mlQC缓冲液洗涤层析柱2次。9.以35mlQF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA。10,以0,7倍体积异丙醇沉淀DNA,离心12500xgx30min4,C,小心去除上清。11,以7ml70%乙醇洗涤沉淀DNA,离心12500xgx10min4C,小心去除上清。12,将沉淀的质粒DNA溶于5mlTE(pH8,0)缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5倍体积无水乙醇；1/10体积3.0M

17、NaAc(pH5.2),于-20C静置过夜。13.离心12500xgx20min4；C,去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤，超净台风干。1),保存于-20C。%/管(用于1次转化反应，约40由4.干燥的DNA溶于适量体积TE,定量，分装100-200构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞1.将酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接种于5.0mlSD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0mlSD/-Ura液体培养基中，30c恒温，250rpm振荡培养16-18hr,至OD6001.0。SD/-Ura液体培养基，115C,10lb/in2灭菌15minA.DifcoNi

18、trogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)10.0mlD.20xHis5.0mlE.20xLeu5.0mlF.20xTrp5.0mlG.ddH2O100.0ml2.将上述新鲜培养菌液接种于300mlYPD,至OD600=0.2-0.3(约50ml),30c恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。YPD液体培养基，115C,10lb/in2灭菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O-300ml3.室温离心5000xgx5min,弃

19、上清；加入15-25mlddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1XTE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。4.准备下列试剂2X转化反应10XTE10XLiAc50%PEGddH2OlT/120T15JA.1XTE/LiAc0.15ml15l/960T120B.PEG/LiAc1.20ml120H/900C.1XTE1.00ml1005.分装待转化的质粒DNA,振荡混匀。Hg)3-5A.pLexA-X(0.1B.10mg/mll-SpermDNA*(0.1mg)10*新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20C。l用1XTE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。抬.每

20、管加入100lW.各加入600PEG/LiAc,振荡混匀，30c恒温，250rpm振荡培养30min。l%.各加入70DMSO缓和倒置混匀。42c热休克15min,迅速插入冰浴。9.室温离心13000xgx10se其量弃上清；以0.3ml1乂TE悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura,-His固体培养板，30c倒置培养3-5天。SD/-Ura,-His固体培养基，115C,10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板A.DifcoNitrogen1.34gB.葡萄糖4.00gC.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)20.0mlD.20xLeu10.0mlE.20xTrp10.0mlF.A

21、gar4.00gG.ddH2O90-100mm)g200.0ml铺8-10块平板(附表1.不同规模转化酵母感受态细胞SmallScale*LargeScaleLibraryScale转化反应2011(1)SD液体培养基扩增酵母菌100ml100ml300ml(2)YPD液体培养基扩增酵母菌300mla300mla1000mlaTE或ddH2O洗涤酵母细胞15mlc25-50mlb500mla(4)准备A.1xTE/LiAc缓冲液1.5mld1.0mld8.0mlcB.PEG/LiAc缓冲液12.0mlc6.0mlc100.0mlbC.1xTEI冲液6.0mlc10.0mlc10.0mlc(5)

22、分装A.DNA-BDvectorgdx/20.2-1.0mgc、0.1gd0.1-0.5mgMgX2010-50也.ADvector0.1C.l2.0ml/lx20200SpermDNA(10mg/ml)10世91xTE/LiAc重悬感受态细胞1.5mlc1.0mlc8.0mlblx201.0ml8.0mP酵母感受态细胞100(7)PEG/LiAc缓冲液0.6mlx205.0ml60.0mll7.0mlJlX20700DMSO70(9)室温离心后弃上清13000xgx10se2000xgx5mir2000xgx5min(10)1XTE重悬感受态细胞0.3mlx26.0ml10.0ml150mm

23、x50*50mmx301.0。SD/-Ura,-His液体培养基,115C,10lb/in2灭菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)10.0mlD.20xLeu5.0mlE.20xTrp5.0mlF.ddH2O-100.0ml3.将上述新鲜培养菌液接种于300mlYPD,至OD600=0.2-0.3(约50ml),30c恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。YPD液体培养基，115C,10lb/in2灭菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastEx

24、tract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O-300ml4.室温离心5000xgx5min,弃上清；加入15-25mlddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1XTE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。5.准备下列试剂1X转化反应10XTE10XLiAc50%PEGddH2OlH/800U100MA.1xTE/LiAc1.0ml100l4.8ml/6005B.PEG/LiAc6.0ml600C.1xTE10.0ml1.0ml/9.0ml6.取1.0ml用1XTE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入下列成份，振荡混匀。l-g)40-A.pB42AD-Library(50-100

25、8.10mg/mll-HerringDNA*(2.0mg)200*新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20C。7.加入6.0mlPEG/LiAc,振荡混匀，30c恒温，250rpm振荡培养30min。l%.加入700DMSO缓和倒置混匀。42c热休克15min,迅速插入冰浴。9.室温离心2000xgx5min,尽量弃上清。10.以6.0ml100mm,每稀释度各x2)30c倒置培养3-5天，确定转化效率在2X106cfu以上有效。稀释不同倍数，涂布SD/-Ura,-His,-Trp固体培养板(卜1xTE重悬沉淀细胞，取10150mmx30),30C倒置培养3-5天。涂布SD/-Ur

26、a,-His,-Trp固体培养板(以11.按每板200SD/-Ura,-His,-Trp固体培养基，115C,10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板A.DifcoNitrogen13.40gB.葡萄糖40.00gC.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)200.0mlD.20xLeu100.0mlE.Agar40.00gF.ddH2O150mm)g2000.0ml铺30块平板(12.在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上各加5mlTE(pH7.0)缓冲液，将菌落刮下。13.离心弃上清，加入10-20mlTE缓冲液重悬沉淀菌，加入等体积的无菌65%甘油-MgSO4缓冲液，混匀，

27、分装1.0ml/管，保存于4C1周或-80C1年以上。65%甘油-MgSO4缓冲液：65%甘油；100mMMgSO4;25mMTris-HCl(pH8.0)A.甘油65.00mlB.MgSO4?7H2O2.465gC.2.0MTris-HCl(pH8.0)1.25mlD.ddH2O-100.00ml酵母双杂合系统阳性克隆的筛选1.经过选择培养基筛选的含有DNA-BD载体、文库DNA及报告基因的酵母感受态细胞，用无菌TE稀释至1:1041:106和1:108等不同浓度。90mm),30c倒置培养3-5天，计数平板上单克隆菌落数。虬涂布SD/-Ura,-His,-Trp固体培养板(N2.取上述稀释

28、菌液各1003.确定待进一步鉴定的酵母菌滴度(cfu/ml)=克隆数X105(1:104释)、克隆数X107(1:106释)或克隆数X109(1:108释)。4.按照以前实验确定的文库转化效率的5-10倍的总量、0.5-2X106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养板，30c倒置培养3-5天。5.挑取显蓝色的菌落，再接种于SD/-Ura,-His，-Trp固体培养基以及SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养基，以进一步确证。SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养基A.

29、SD/Gal/Raf3.79gB.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O85.0ml灭菌(115C,10lb/in2)15min,冷却至50C,加入下列成份后铺板E.10xBU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm)琳甫5-6块平板(10xBU缓冲?C121C,15lb/in2灭菌15minA.Na2HPO4?12H2O9.30gB.NaH2PO4?2H2O3.90gC.ddH2O-100.0ml20mg/mlX-GalA.X-Gal40mgB.DMF2ml酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定-酵母质粒DNA的提

30、取1.挑取经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落，接种于5.0-10.0mlSD/-Trp液体培养基，30c恒温，250rpm振荡培养20hr。SD/-Trp液体培养基，115C,10lb/in2灭菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)10.0mlD.20XHis5.0mlE.20xLeu5.0mlF.20xUra5.0mlG.ddH2O100.0ml2.室温离心5000xgx1min,弃上清，收菌。l酵母裂解液，振荡重悬沉淀酵母菌。P3.加入200酵母裂解液:2%TritonX-100;1%SDS;100mMNaCl;10mMTris-HCl(pH8.0);1mMEDTAA.10%TritonX-10020.0mlB.10%SDS10.0mlC.NaCl0.58gD.Tris0.12gE.