精编培养基有效期的验证方案2资料.docx

1、精编培养基有效期的验证方案2资料 培养基有效期的确认本方案已由下列人员审查并批准 文件责任职位签字日期报告者审核者审核者批准者1.目的：确定日常环境监控、微生物限度检测使用培养基的有效期。2.接受标准:2.1试验用菌悬液每1ml含菌数应小于100cfu。2.2 培养基配制后无菌性检查和营养性检查需符合要求。2.3 培养基的pH值应符合相应培养基的要求。3.操作程序：3.1实验仪器及器具：生化培养箱LRH-250A（广东省医疗器械厂， 30-35, 23-28, 20-25）；XG1.DMX-0.36B型脉动真空灭菌器（山东医疗器械股份有限公司 编号10.0311）；FE20型pH计（梅特勒）；

2、灭菌生理盐水；移液管；试管；双碟。3.2验证培养基：硫乙醇酸盐流体培养基TGB(德国merk)，大豆酪蛋白消化肉汤培养基TSB(德国merk)，营养琼脂培养基NA(德国merk)，萨布罗葡萄糖琼脂培养基SDA(德国merk)、平板计数培养基PCA(德国merk)、远腾琼脂培养基ENA(德国merk)、硫酸月桂醇肉汤LST(德国merk)、亮绿乳糖肉汤培养基BGLBB (德国merk)、麦康凯琼脂培养基Mac.A (德国merk)、大豆酪蛋白消化琼脂培养基TSA(德国merk)、假单胞菌分离琼脂培养基PIA (BD)、绿脓荧光素测定用培养基PAF (德国merk)、绿脓菌素测定用培养基PAP (

3、德国merk)、 甘露醇胆盐琼脂培养基 (MSA) (德国merk)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（CET）(德国merk)、沙门氏菌增菌培养基(RVSB) (德国merk)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂XLD(德国merk)、麦康凯肉汤培养基Mac.B(德国merk)、曙红亚甲蓝琼脂培养基EMB(德国merk)、三糖铁琼脂TSI(德国merk)、萨布罗葡萄糖肉汤培养基SDB(德国merk)、梭菌增菌培养基RCM(德国merk)、哥伦比亚琼脂培养基CA(德国merk)、肠肝菌增菌培养基EEB-M(德国merk)、紫红胆汁葡萄糖培养基VRBGA(德国merk)3.3试验菌: 金黄色葡萄球菌Staphy

4、lococcus aureus ATCC 6538 大 肠 埃 希 菌Escherichia coli ATCC 8739沙门氏菌Salmonella typhimurium ATCC 14028铜 绿 假 单 孢 菌Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC6633生孢梭菌Clostridium sporogenes ATCC 19404 白色念珠菌Candida albicans ATCC 10231黑曲霉Aspergillus niger ATCC 164043.4菌悬液的制备：3.4.1各取金黄色葡萄球菌、枯

5、草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中，30-35培养24-48小时，其中生孢梭菌需厌氧培养，取出置28贮存使用7天，每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约为10100cfu/ml。3.4.2取白色念珠菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中， 20-25培养48-72小时，取出置28贮存使用7天。取黑曲霉菌SDA斜面培养物用灭菌生理盐水洗脱孢子，置28贮存使用7天。每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约10100cfu/ml。3.4.3菌悬液计数3.4.3.1无菌操作吸取菌悬液1ml，加入含灭菌稀释剂100ml的三角瓶中，摇匀

6、成10-2稀释液，同样操作制备10-4和10-6稀释液（必要时也可作更大倍数稀释）。3.4.3.2每种菌悬液备好二只灭菌双碟和融化好并放至50的NA培养基和RNA培养基TSA培养基和SDA培养基。3.4.3.3向双碟内注入10-6稀释液（必要时可以是其它浓度稀释液）1ml。3.4.3.4向含稀释液的双碟内加入备好的培养基约20ml，迅速振摇混合稀释液和培养基，并放置使凝固成平板，其中生孢梭菌置于厌养袋中。3.4.3.5翻转双碟置适宜温度培养(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌30-35培养24-48小时，白色念珠菌和黑曲霉菌20-25分别培养2-3天和3-5天)。3.4.3.

7、6计数平板上的菌落数求出平均值，得到稀释液的菌浓度要求应为含菌10-100 cfu/ml，若不在此范围内可以改变稀释倍数，得到含菌符合要求的稀释液。3.5实验步骤3.5.1培养基的制备3.5.1.1硫乙醇酸盐流体培养基（TGB）酪胨（胰酶水解） 15.0g 葡萄糖 5.0gL-胱氨酸 0.5g硫乙醇酸钠 0.5g或硫乙醇酸 0.3ml新配制的0.1%刃天青溶液 1.0 ml酵母浸出粉 5.0g氯化钠 2.5g琼脂 0.7g纯化水 1000ml用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节pH值，使灭菌后为7.10.2，分装成100ml/瓶，按试剂标签说明要求121高压灭菌15 分钟，备用。使用前，培养基氧化

8、层的颜色（粉红色）不得超过培养基深度的1/5。否则，须经100C水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。3.5.1.2大豆酪蛋白消化肉汤培养基(TSB)胰酪胨 15.0g大豆胨 5.0g氯化钠 5.0g纯化水 1000ml用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节pH值，使其灭菌后pH7.30.2, 分装成100ml/瓶，按试剂标签说明要求121高压灭菌15 分钟，备用。3.5.1.3营养琼脂培养基 (NA)胨5.0g肉浸出粉3.0g琼脂12.0g纯化水 1000ml根据配制总量，称取干粉适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，加热煮沸至完全溶解，用1N 氢氧化钠或1

9、N 盐酸调节培养基pH值，使其灭菌后pH为7.00.2，置121 高压灭菌15分钟，备用。3.5.1.4萨布罗葡萄糖琼脂培养基： (SDA)葡萄糖40.0 g胨（肉和酪蛋白） 10.0 g琼脂15.0 g纯化水1000 ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为5.60.2，置121 高压灭菌15分钟。灭菌前加入氯霉素50mg/L。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.5平板计数培养基： (PCA)胰酶消化酪蛋白5.0g酵母膏2.5g葡萄糖1.0 g琼 脂15.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培

10、养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.00.2，置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.6远腾琼脂培养基： (ENA)蛋白胨10.0g磷酸氢二钾2.5g无水亚硫酸钠3.3g乳糖10.0g阿拉伯胶0.3g琼 脂12.5g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.10.2，置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.7硫酸月桂醇肉汤（LST）胰蛋白20.0 g乳糖 5.0 g氯化

11、钠5.0 g硫酸月桂醇钠0.1g磷酸氢二钾 5.0 g磷酸二氢钾1.0 g蛋白胨10.0 g纯化水1000 ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为6.80.2，加热煮沸1min，置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25 贮存。3.5.1.8亮绿乳糖肉汤培养基（BGLBB）蛋白胨10.0 g乳糖 10.0 g干牛胆20.0 g亮绿0.0133g纯化水1000 ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为6.8

12、0.2，加热煮沸1min，置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25 贮存。3.5.1.9麦康凯琼脂培养基 (Mac.A)胰酶消化明胶 17.0g蛋白胨3.0g乳糖 10.0 g氯化钠5.0g胆盐混合物1.5g琼脂13.5g中性红30mg结晶紫1.0mg纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，加热煮沸1min，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.10.2，置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.10大豆酪蛋白消化琼脂培养基： (TSA)胰酶消化酪蛋白15.0g番木瓜酶消化大豆5.0g氯化钠5.0

13、g琼脂15.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,加热煮沸至完全溶解, 冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使其灭菌后pH7.30.2，置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.11假单胞菌分离琼脂培养基（PIA）蛋白胨20.0g氯化镁1.4g硫酸钾10.0g氯苯酚0.025g琼 脂13.6g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.00.2，置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25 贮存。 3

14、.5.1.12绿脓荧光素测定用培养基 (PAF)胰酶消化酪蛋白10.0g动物组织胃蛋白消化酶10.0g无水磷酸二氢钾1.5g硫酸镁 (MgSO3.6H2O)1.5g甘 油10.0ml琼 脂15.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使在灭菌后为7.20.2。置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.13绿脓菌素测定用培养基(PAP)胰酶消化明胶20.0g无水氯化镁1.4g无水磷酸二氢钾10.0g琼 脂15.0g甘 油10.0ml纯化水1000ml根

15、据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使在灭菌后为7.20.2。置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.14甘露醇胆盐琼脂培养基(MSA)胰酶消化酪蛋白5.0g动物组织胃蛋白消化酶5.0g牛肉膏1.0gD-甘露醇10.0 g氯化钠75.0g琼 脂20.0g酚红0.025g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使在灭菌后的为7.40.2。置121 高

16、压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.15溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（CET）胰酶消化明胶20.0g氯化镁1.4g硫酸钾10.0g琼 脂13.6g西曲溴铵0.3g甘 油10.0ml纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使在灭菌后为7.20.2。置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.16沙门氏菌增菌培养基(RVSB)大豆酪蛋白 4.5g水合氯化镁29.0g氯化钠8.0g硫酸钾0.4g磷酸二氢钾0.6 g孔雀绿0.036g纯化水1000m

17、l根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,加热煮沸至完全溶解, 冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使在加热后pH为5.20.2，在灭菌锅中于115加热灭菌15分钟并立即冷却，灭菌后于2-25贮存。3.5.1.17木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)木 糖3.5gL-赖氨酸5.0g乳 糖 7.5g蔗 糖7.5g氯化钠5.0g酵母膏3.0g酚 红80mg琼 脂13.5g脱氧胆酸钠2.5g硫代硫酸钠6.8g枸橼酸铁（III）铵800mg纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,加热煮沸至完全溶解, 冷却至室温用1N

18、氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使在加热后pH为7.40.2，加热至刚沸，冷却至50并倒入陪替氏培养皿中，勿在灭菌锅中加热。3.5.1.18麦康凯肉汤培养基 (Mac.B)胰酶消化明胶20.0g乳糖水合物10.0g胆汁5.0g溴甲酚紫10.0mg纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,加热煮沸至完全溶解, 冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.30.2。置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.19曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)胰酶消化明胶 10.0g磷酸二氢钾琼脂乳糖 曙红Y 2.0g15.0g

19、10.0 g400mg亚甲基蓝65mg纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.10.2，在振摇下加热煮沸1分钟，然后置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.20三糖铁琼脂 (TSI)胰酶消化酪蛋白10.0g动物组织胰酶消化物10.0g乳 糖10.0g蔗 糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸铁（III）铵200mg氯化钠5.0g硫代硫酸钠200mg琼 脂13.0g酚 红25mg纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温

20、用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使在灭菌后的7.30.2。在振摇下加热煮沸1分钟。分装在试管中，置121 高压灭菌15分钟，使凝固成斜面。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.21萨布罗葡萄糖肉汤培养基 (SDB)葡萄糖20.0 g胨（肉和酪蛋白） (1:1)10.0 g纯化水1000 ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为5.60.2，置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.22梭菌增菌培养基 (RCM)牛肉浸出粉10.0g蛋白胨 10.0g酵母浸出粉3.0g可溶性淀

21、粉1.0gD-葡萄糖-水合物5.0g盐酸半胱氨酸0.5g氯化钠5.0g醋酸钠3.0g琼脂0.5g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为6.80.2，加热煮沸1min, 置121 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.23哥伦比亚琼脂培养基(CA)胰酪蛋白胨10.0 g动物蛋白酶消化物5.0 g胰酶消化物3.0 g酵母浸出粉 5.0 g玉米淀粉1.0 g氯化钠5.0 g琼脂14.0 g纯化水1000 ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却

22、至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.30.2，加热煮沸1min，置121 高压灭菌15分钟，使用前冷至4550，加入含20mg的无菌庆大霉素，混合摇匀，倾注平板。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.24肠肝菌增菌培养基 (EEB-M)牛肉膏3.0g胰酶消化明胶5.0g水合乳糖5.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使在灭菌后为7.20.2，100加热灭菌30分钟或121高压灭菌5分钟并立即冷却。灭菌后于2-25贮存。3.5.1.25紫红胆汁葡萄糖培养基（VRBGA

23、）酵母浸出粉3.0g胰酶消化明胶7.0g胆汁盐1.5g氯化钠5.0g水合葡萄糖10.0g琼脂15.0g中性红30mg 结晶紫2mg纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH，使在加热后pH为7.40.2，加热至刚沸。勿再加热灭菌，于2-25贮存。3.5.1.25 取出所需配制的干粉培养基,检查干粉培养基是否处于有效期内。根据配制需求量,按干粉培养基包装瓶上的配方准确称取所需的干粉培养基,并做好相应的干粉培养基配制记录（FARD-QC-304）及灭菌原始记录（FARD-211-037），见附件1。3.5

24、.2培养基的无菌性检查3.5.2.1按照微生物试验用培养基适用性检查操作程序（FASOP-QC-032-7）“4.5 培养基灭菌性检查”。3.5.2.2填写配制的培养基无菌检查记录，见附件1。3.5.4 培养基的PH测定用pH计测定培养基pH值，pH计的使用见FE20型实验室pH计操作程序（FASOP-QC-1136） 见附件2，填写培养基pH值记录见附件1。3.5.4培养基的营养性检查3.5.4.1按照微生物试验用培养基适用性检查操作程序（FASOP-QC-032-7） “4.6.3 促生长试验” 见附件2。3.5.4.2填写培养基促生长试验原始记录(FARD-QC-034)，见附件1。3.

25、5.4 将配制好经过无菌性检查和营养性检查合格后的培养基置于2-25C恒温环境中存放，每间隔一个月取相应的培养基进行培养基pH测定、无菌性检查和营养性检查（按步骤“3.5.2”、“3.5.3”和3.5.4进行操作），需验证的培养基每间隔一个月的检测结果如符合3.6 结果要求，则继续放置在要求温度的恒温环境中，放置至第4个月。3.6实验结果3.6.1 无菌检查结果均应澄清或无菌落生长。3.6.2 pH值应在灭菌后各培养基要求的pH值范围内。3.6.3培养基营养性检查的结果3.6.3.1按照微生物试验用培养基适用性检查操作程序（FASOP-QC-032-7）4.7 结果判断”3.6.3.2若培养基

26、至第4个月经无菌性检查和营养性检查均符合要求则培养基的有效期定为3个月；若培养基经无菌性检查和营养性检查有任何一项不符合要求则规定培养基有效期的不得超过该次存放时间前一次检测间隔的时间（例如，培养基在第3个月检测结果不符合要求，则培养基的有效期不得超过2个月）。3.7本方案实施前应对参与本验证的人员进行培训。4.参考文献4.1中国药典. 二部附录XI H 无菌检查法、XI J 微生物限度检查法.国家药典委员会.4.2 ICH. Protocol Template Qualification of the USP/ Ph.Eur./JP Microbiological Examination T

27、ests for Non-sterile Drug Products,Drug Substances and Excipients(Version 1,Version 2).2007.4.3 United States Pharmacopoeia Chapters. Microbiological Examination of Non-sterile Products: Microbial Enumeration Tests, Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganis

28、ms, Microbiological Quality of Non-Sterile Pharmaceutical Products,and Validation of Microbial Recovery for Pharmacopoeia Articles.4.4European Pharmacopoeia Chapters. Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests, Microbiological Examination of Nonsterile Products: Test for specified Micro-organisms,and Microbiological Quality of Pharmaceutical Preparations.